TIPOS DE VECTORES DE CLONACIÓN

Vectores de clonación: almacenamiento de secuencias y obtención de grandes cantidades del ADN insertado o de la
molécula recombinante.

Origen de replicación: Secuencia en el ADN del vector que provee un sitio de reconocimiento a las proteínas que
identifican el sitio de inicio de la replicación (ORI).

Marcador de selección Gen que confiere resistencia a un antibiótico con el cual puede seleccionarse la célula que
incorporó el vector. los genes de selección más comunes son la ampicilina y kanamicina.

Sitio múltiple de clonación (SMC): fragmento de ADN que contiene una serie de sitios de reconocimiento para
enzimas de restricción con una amplia gama de posibilidades de insertar cualquier fragmento de ADN.

Elementos de factores de expresión: origen de replicación, marcador de selección y sitio de clonación múltiple),
además de contar en su secuencia con por lo menos un promotor fuerte. Tienen una baja expresión basal y son
fácilmente transferible a otras cepas. También debe incluir secuencias de terminación de la transcripción y de adición
de cola de poliadelinación.

Células competentes para la replicaron de vectores: la bacteria más utilizada para este proceso es la E. Coli. Y se
utiliza cloruro de calcio para hacerlas más permeables a la entrada de ADN.

La clonación de ADN: introducción de un fragmento de ADN llamado inserto dentro de un vector, que puede replicarse
de manera autónoma e independiente del genoma de la célula hospedera. El resultado es la obtención de millones
de copias de una molécula recombinante compuesta por ADN proveniente del inserto y del vector.
Pasos para la clonación
1. Preparación del inserto de ADN que se va a clonar.
2. Preparación del vector para la clonación.
3. Ligación del inserto y el vector.
4. Preparación de células competentes.
5. Transformación celular.
6. Identificación de las colonias celulares que contienen el vector recombinante.

La transformación: introducción de material genético en las bacterias mediante el uso de plásmidos en los cuales se
ha insertado el material genético deseado. Los elementos básicos de los que debe constar un plásmido son: un origen
de replicación, el cual le proporciona autonomía propia e independiente del DNA nuclear, y un gen de resistencia a un
antibiótico, que permite seleccionar a la bacteria transformada de las otras que no lo están.

La transfección es la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores
víricos (transducción). Estas técnicas, se llevan a cabo abriendo poros en la membrana celular (electroporación)

Identificación de colonias con el vector recombinante: Se utilizan marcadores de selección proporcionados por los
vectores. Los más utilizados son los genes de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el,
cloramfenicol y la kanamicina. Después de la transformación, las bacterias se siembran en cajas petri con agar
suplementado con el antibiótico, para el cual el plásmido es resistente. Si la transformación ha sido exitosa las
bacterias serán capaces de metabolizar el antibiótico y vivirán, lo que indicará que incorporaron el vector. Otros
marcadores de selección se basan en la producción de moléculas fluorescentes o bien en la producción de enzimas
que, al reaccionar con un sustrato, producen coloración en la colonia de células transformadas.

PCR: técnica utilizada para la amplificación del fragmento de ADN que nos interesa, la cual se lleva a cabo tres etapas,
Para llevar a cabo la PCR se necesita el diseño de los oligos de la cadena que se quiere en específico tener, a estos
oligos se le adiciona en el extremo 5’ la secuencia de restricción que es reconocida por la endonucleasa seleccionada.
Desnaturalización de ADN consiste en la separación de la cadena de las dos hebras de ADN mediante una exposición
de altas temperaturas 96°C
Hibridación se trata de un descenso de la temperatura para permitir que los primer’s se unan por complementariedad
al ADN molde separado previamente e hibridan con su secuencia complementaria formándose así el complejo ADN
molde-primer 55°C
Elongación la enzima TAC polimerasa incorpora los nucleótidos complementarios a partir del extremo 3´ libre de la
región en que han hibridado los cebadores la extensión de estas cadenas es en dirección de 5’ a 3’ a la temperatura
de 72°. En este proceso a partir del 3 ciclo se obtiene la cantidad de primer´s necesarios para realizar la clonación

Digestión del inserto y del vector

El producto de PCR como el vector deben ser cortados con las respectivas enzimas de restricción para poseer los
extremos cortados y complementarios listos para su unión.
Para ello se eligen 2 enzimas de restricción, las secuencias que se eligieron para los oligos deben estar presentes en el
vector. Estos deben ser dos diferentes ya que de esta manera el inserto tiene una única dirección de entrada.
Se coloca en un tubo el inserto y en otro el vector y se adicionan en ambos las enzimas con sus respectivos buffers
para que se lleve a cabo la reacción. Para la comprobación de los cortes se lleva a cabo una electroforesis en gel de
agarosa utilizando un marcador de referencia que permita comparar los fragmentos.

Ligación
Una vez que se comprobó que los cortes se hicieron de manera correcta se realiza la ligación del inserto con el vector.
Para ello se colocan ambos componentes en un tubo junto con la enzima ligasa que lleva a cabo la formación de
enlaces covalentes entre el extremo 5’ y 3’ de la molécula de ADN. La enzima utilizada se llama T4 ligasa.

Transformación en los vectores

BACTERIAS
Para llevar a cabo la transformación se requiere la preparación de células competentes. Estas se generan utilizando
agentes de competencia como el CaCl2 seguido de un proceso de choque térmico o electroporación.
Se adiciona el vector recombinante con células pertenecientes a una cepa de clonación (E.coli DH5a).
Choque térmico: la combinación de la temperatura y los cationes aumenta la porosidad de la membrana celular,
facilitando la asimilación de los plásmidos. De esta forma atravesarán la membrana. Para la transformación se toma
la reacción de ligación para ponerla en hielo de 5-30 minutos, después pasa a un baño maría a 42°C durante 30
segundos sin agitar ni mover el vial y nuevamente se pone en hielo.
Electroporación: aplicación de breves pulsos eléctricos de alto voltaje, para formar poros en la membrana plasmática
o en la pared celular de las bacterias. Las membranas, se desestabilizan originando una pérdida temporal de la
permeabilidad produciendo poros reversibles, por los que se produce el paso de macromoléculas y mayor absorción
de DNA, por parte de las células.
Después del proceso se adiciona a un medio para restablecer su ciclo de vida y luego se siembra en medio con
antibiótico para la identificación de las células que contienen el vector recombinante, en este paso aun no se expresa
la proteína solo se hace la clonación para tener un mayor número de copias del vector recombinante. Se realiza la
purificación del plásmido por lisis alcalina o un kit y se vuelve a hacer la transformación (por choque térmico o
electroporación) pero ahora en la cepa de producción (bacterias E.coli BL21) ésta cepa ya contiene la T7 RNA pol) que
podrá iniciar la producción de la enzima de interés. Se siembra en medio con antibiótico y se obtienen las clonas
positivas con la proteína en su interior.

LEVADURAS
Se adiciona el vector recombinante con células pertenecientes a una cepa de clonación (E.coli DH5a). Mediante
choque térmico o electroporación.
Después del proceso se adiciona a un medio para restablecer su ciclo de vida y luego se siembra en medio con
antibiótico para la identificación de las células que contienen el vector recombinante, en este paso aún no se expresa
la proteína solo se hace la clonación para tener un mayor número de copias del vector recombinante. De esta manera
se obtiene un volumen mayor de plásmido que después es insertado en las células de levadura. Se realiza la
purificación del plásmido y se vuelve a hacer la transformación (por choque térmico o electroporación), pero ahora
en la cepa de producción (X-33) esta cepa ya contiene la AOX RNA pol que podrá iniciar la producción de la enzima de
interés. Para la selección de las clonas positivas se siembra en medio con Leucina dependiendo del gen de selección
del vector.
El gen LEU2 codifica una enzima necesaria para síntesis del aa leucina, por lo que la transformación de cepas de
levadura que carecen de esta enzima se puede seleccionar mediante crecimiento en un medio que carece de leucina.
Las levaduras transformadas por ADN plasmídico pueden crecer en medios que carecen de leucina a 25°C, pero sólo
las levaduras transformadas por el plásmido que porta una copia del gen de interés son capaces de crecer a 37°C.

CELULAS DE INSECTO
Transducción: Introducción de ADN a una célula por medio de un vector viral
Transfección: Introducción de ADN en células de mamífero con métodos no virales.
Primero se inicia con un plásmido pDonor que ya contiene en su interior el gen de interés, este cuenta con un promotor
pPoh, una región Tn7R en extremo 5’ y una Tn7L en 3’.
Se realiza la transformación introduciendo el plásmido por choque termino o electroporación a una cepa de E.coli
DH10Bac, esta cepa tiene en su interior el genoma del virus (bacmid) que cuenta con una región lacZ y attTn7, por
recombinación el gen de interés se introduce en medio de estas dos región del bacmid. Se lleva a cabo la selección de
aquellas clonas que introdujeron la información y la recombinaron. Se purifica el ADN recombinante Bacmid y por
transfección son introducidas a células de insecto, que contienen los componentes para la creación de partículas de
baculovirus recombinantes, se purifican y nuevamente se realiza una transfección, pero a una cepa de células de
insecto de producción donde el gen de interés se expresará y se obtendrá la proteína.

CÉLULAS DE MAMÍFERO
Primero se realiza una recombinación homologa mediante el uso de dos vectores (clonación y de expresión basado
en genoma adenoviral, este posee los genes E1 y E3, uno de los vectores posee un sitio attR1 y otro attR2 y el otro
vector attL1 y attL2, de esta manera se crea un adenovirus no replicativo que puede ser usado para introducir y
expresar transitoriamente el gen de interés. El vector creado contiene los elementos para el empaquetamiento de la
construcción dentro de los viriones (encapsulación). Este vector por transfección es introducido a una línea celular
recombinante (HEK293A) que contiene una copia del gen E1 que sintetiza las proteínas E1 para generar copias de
adenovirus replicativos-incompetentes. Se cosechan en un crudo extracto que es usado para infectar nuevamente
HEK293A para producir mayor cantidad de viriones, estos son purificados y utilizados para infectar células de mamífero
(CHO) para la expresión de la proteína de interés.