PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA[Título del documento] E.P.

INGENIERÍA AMBIENTAL

Práctica N°4
Caracteres culturales de los cultivos puros en tubos

OBJETIVOS:

- Conocer las técnicas de transplante en los diferentes tipos de medios de cultivo.

- Comprobar la pureza de las cepas aisladas.
- Relacionar estos parámetros con la taxonomía bacteriana.
- Conocer el comportamiento cultural de las 5 cepas en medios líquido, sólido y
semisólido.
- Coloración Gram de las mismas y correlación con los cultivos macroscópicos:
comprobación morfológica con las de los cultivos iniciales.

1. TRANSPLANTE DE CULTIVO PURO DE LIQUIDO A LIQUIDO. TECNICAS.

TECNICA N°1
(1) Levantar el cultivo con la mano izquierda a la altura de la llama del mechero y
con la mano derecha destaparlo con el dedo meñique y margen cubital de la
mano derecha.
(2) Con el asa previamente al rojo, extraer el inóculo sin rozar las paredes internas
del tubo.
(3) Retornar a la gradilla el inóculo inicial.
(4) Depositar el inóculo por agitación en el nuevo medio líquido cogiendo el tubo
igual que para el cultivo inicial. Flamear el cultivo antes y después de
trasplantada la cepa.
(5) Quemar el asa al rojo y colocarla en su lugar.
(6) Rotular datos: número de grupo, nombre de la cepa, fecha.
(7) Incubar a 37°C por 24 hrs.

TECNICA N°2
(1) Con la mano izquierda levantar a la vez cultivo y medio líquido estéril situando
ambas bocas de los tubos a la altura del mechero.
(2) Con la mano derecha destapar ambos y extraer con el asa de siembra el inóculo
y rápidamente depositar por agitación en el segundo tubo (medio líquido estéril),
sin rozar sus paredes internas.
(3) Flamear y taponar los dos tubos, quemar al rojo el asa y retornar ambos cultivos
a la gradilla.
(4) Rotular datos: número de grupo, nombre de la cepa, fecha.
(5) Incubar a 37°C por 24 hrs.

NOTA: Para transplante de medio sólido a medio líquido, extraer el inóculo de

preferencia de la base del cultivo y desleír el inóculo por agitación en el
nuevo medio.

MOTILIDAD MICROSCOPICA: De los cultivos en caldo por cualquiera de las dos

técnicas incubadas de 18 a 24 hrs. a 37°C, se extrae un inóculo que se deposita
cuidadosamente en un portaobjetos (gota pendiente), sobre el cual se coloca un
cubreobjeto y se observa al microscopio, empleando la preparación primero a menor
aumento y luego a mayor aumento (45x) y se regula la intensidad de la luz, para mejor
observación. . Si el organismo es MOVIL se observará desplazamiento activo celular en
el seno del líquido por todo el campo microscópico. El desplazamiento se realiza en una
o más direcciones, dependiendo de la quimiotaxis celular de la cepa. Si el organismo no

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es móvil la población de células en el seno del cultivo se mantiene "in situ" con una leve
vibración, como resultado del movimiento browniano.

2. TRANSPLANTE DE CULTIVO PURO LIQUIDO A MEDIO SOLIDO EN PLANO

INCLINADO

TECNICA N°1
(1) Repetir los pasos (1), (2) y (3) de la TECNICA N 1 anterior.
(2) Con la mano izquierda coger el tubo de agar en plano inclinado, destapar con la
derecha a la altura del mechero, introducir el asa cargada hasta la base del tubo
sin romper el medio y deslizar el inóculo en sentido ascendente por la superficie
del medio, sembrando por estrías en zig-zag, por espiral o por paralelos.
(3) Flamear el tubo sembrado, quemar el asa y situar ambos en la gradilla.
(4) Rotular datos: Número de grupo, nombre de la cepa, fecha.
(5) Incubar a 37°C por 24 hrs.

NOTA: Para transplante de medio sólido a sólido, tomar el inóculo de la base del cultivo
sin cargar demasiado el asa y seguir igualmente los pasos (2) al (5) de la técnica
anterior. Mejores resultados se obtienen con siembras por zig-zag o por espiral.

TECNICA N°2
(1) Repetir el paso (1) de la TECNICA N 2 anterior.
(2) Con la mano derecha destapar ambos tubos y extraer con el asa el inóculo del
primer tubo y transplantar al segundo por estrías en zig-zag o por espiral en
trazos ascendentes.
(3) Flamear ambos tubos y taponar: quemar el asa y ubicar cada cultivo en la
gradilla.
(4) Rotular datos: Número de grupo, nombre de la cepa, fecha.
(5) Incubar a 37°C por 24 hrs.

3. TRANSPLANTE DE CULTIVO PURO LIQUIDO A MEDIO SEMISOLIDO EN

COLUMNA (PUNTURA)

TECNICA N°1
(1) Con la mano izquierda, tomar el cultivo inicial, destapar con la mano derecha a
la altura del mechero y extraer el inóculo mediante el asa en aguja o en asa de
2 mm de diámetro, flamear y taponar el cultivo, retornar el cultivo inicial a la
gradilla.
(2) Con la mano izquierda coger el medio semisólido e introducir el asa cargada
hasta la mitad o un tercio del medio.
(3) Flamear y taponar el tubo y quemar el asa. Reubicar ambos en la gradilla.
(4) Rotular datos: Número de grupo, nombre de la cepa, fecha.
(5) Incubar a 37°C por 24 hrs.

TECNICA N°2
(1) Practicar el transplante tomando a la vez cultivo y medio semisólido a sembrar.
Los pasos y precauciones idénticos a los ya descritos anteriormente.
(2) En este caso la siembra es por PUNTURA y con golpe seco.
(3) Rotular datos: Número de grupo, nombre de la cepa, fecha.
(4) Incubar a 37°C por 24 hrs.

MOTILIDAD MACROSCOPICA: Si el crecimiento del microorganismo se definió

diametralmente y en profundidad del cultivo, a partir del trazo de siembra, se dice que
el organismo es MÓVIL. El tamaño de las zonas de expansión del crecimiento

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dependerá del grado de motilidad del microorganismo. Si por el contrario, el crecimiento

se circunscribe al trazo de siembra, se dice que el organismo es NO MOVIL.

COMPROBACION DE LA PUREZA DE LAS CEPAS AISLADAS A PARTIR DE CO-

LONIAS (Práctica anterior)

El alumno debe recordar que aisló cepas puras en caldo corriente a partir de 4 a 5
tipo de colonias. Mediante la técnica de coloración Gram determinar la morfología celular
y poder tintorial de cada una. Ejm.: paquete de racimos de cocos Gram(+), resultan de
una colonia circular, lisa, de bordes irregulares, consistencia cremosa, opaca a trasluz,
con pigmento amarillo dorado. La lectura se manifiesta idéntica en los cultivos en caldo,
en este caso los racimos con menor número de células.

1. METODOS DE TRANSPLANTE

MATERIAL.-

1.- Cinco cultivos en caldo: cepas 1, 2, 3, 4, 5 (de 24 hrs. de incubación).

2.- 5 tubos con caldo corriente estéril.
3.- Una gradilla, asa de siembra, lápiz graso, mechero de Bunsen.
4.- Batería Gram: Cristal violeta, Lugol, alcohol-acetona, fucsina fenicada de Ziehl.
Láminas desengrasadas y limpias.
5.- Microscopio, aceite de cedro y alcohol.

PROCEDIMIENTO.-

1.- Transplante de las cepas 1, 2, 3, 4, 5; a cada uno de los tubos con caldo corriente
siguiendo la TECNICA N 1 ó 2 del inciso teórico 1.
2.- Transplantar las cepas 1, 2, 3, 4, 5 por separado, en tubos de agar en plano
inclinado, siguiendo la TECNICA N 1 ó 2 del respectivo tópico teórico 2.
3.- Transplantar las cepas 1, 2, 3, 4, 5 por separado, en los tubos de agar
semisólido, por siembra en puntura o picadura; para observar motilidad
macroscópica (ver técnica en Tópico Teórico 3). El alumno puede elegir
cualquiera de las dos técnicas.
Rotular datos e incubar a 37°C por 24 hrs.

NOTA: En caso de duda preguntar al instructor. Recordar que estas siembras se hacen
con el fin de LEER LAS CARACTERISTICAS CULTURALES MACROSCOPI-
CAS en medios líquidos, sólidos y semisólidos en tubos, en la PARTE II
correpondiente a esta misma práctica.

2. COLORACION GRAM DE LAS CEPAS 1, 2, 3, 4 Y 5

Para conocer la morfología celular y poder tintorial de cada una de las cepas y
comprobar las mismas características a partir de los nuevos cultivos, se realizan
coloraciones Gram.

1.- Seguir los pasos ya conocidos para la tinción Gram.

2.- Observar al microscopio con aceite de cedro y lente de inmersión.
3.- Dibujar y hacer anotaciones.

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RECOMENDACIONES

1.- Es mejor leer el capítulo entero de esta clase, antes de comenzar el trabajo
práctico.
2.- Cada alumno debe ensayar y representar esquemáticamente cada uno de los
métodos de siembra.
3.- Evitar confusiones de siembra.
4.- Anotar en su cuaderno de prácticas, algunas otras observaciones no estipuladas
en la guía.

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COMPORTAMIENTO CULTURAL DE CEPAS PURAS

1. CARACTERES MACROSCOPICOS

Siguiendo el orden de los estudios microbianos in vitro de morfología celular y de

colonias como caracteres de especies o grupos bacterianos, el alumno observará en
esta práctica las características culturales de 5 cepas con comportamiento característico
diferencial en caldo nutricio, agar en plano inclinado y agar en columna. Cada carácter
varía según las necesidades metabólicas y de multiplicación de las especies o grupos
bacterianos y en parte ayuda a la identificación.

a) Comportamiento en Medio Líquido

Mediante el siguiente cuadro se sintetizarán los caracteres de comportamiento
macroscópico en un medio líquido.

CUADRO I

CANTIDAD DE TURBIEDAD DESARROLLO EN OLOR

DESARROLLO SUPERFICIE
Abundante Homogénea Formación de película, Ninguno
de naturaleza: gomosa,
lisa,corrugada,
escamosa,
membranosa, costrosa
Moderado En grumos finos Sin película: desarrollo Fecaloide
en anillo
Escaso En grumos gruesos Aromático
Nulo Algodonoso Parecido a...

SEDIMENTO:
Cantidad: Abundante, moderado, escaso, nulo.
Naturaleza: Granular, grumoso, escamoso, algodonoso, membranoso, mucoide.

b) Comportamiento en Medio Sólido (A. Plano Inclinado)

La lectura se hará en base a un desarrollo masivo en capa (patina) sobre la superficie
del medio. Los caracteres diferenciales son idénticos a los de las colonias.

CUADRO II
CANTIDAD DE FORMA TEXTURA DE CONSISTENCIA
DESARROLLO SUPERFICIE
Abundante Filiforme Lisa Cremosa
Moderado Difusa o Confluente Granular Butirosa
Escaso Arborescente Escamosa Viscosa o vidriosa
Nulo Rizoide Membranosa Gomosa o mucosa
Perlada Papulosa Membranosa
Toruloide Corrugada Algodonosa
Costrosa
Verrucosa
Lacerada

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TRANSPARENCIA CROMOGENESIS ASPECTO DEL MEDIO OLOR

BRILLO
Vivo Opaca Amarillo limón Inalterado Ninguno
Apagado Opalescente Amarillo oro Grisáceo Fecaloide
Opaco Transparente Amarillo pálido Negruzco Sui generis
Anaranjado Enrojecido Aromático
Azulado Verdoso Parecido a...
Verde amarillento Fluorescente
Verde azulado Lechosa
Rojizo Opalescente
Ausente

c) Comportamiento en Medio Semisólido (A. en Columna)

El crecimiento semisólido se define a lo largo del trazo de siembra por puntura y

también de acuerdo al tipo de multiplicación celular en la profundidad del medio. Permite
además la lectura de la MOTILIDAD MACROSCOPICA de la bacteria a las 24 ó 48 hrs.
de incubación.

CUADRO III

DESARROLLO EN PUNTURA ASPECTO DEL MEDIO MOTILIDAD

Filiforme Inalterado Crecimiento difuso parcial o
total del microorganismo por
toda la columna de agar:
BACTERIA MOVIL
Granular Grisáceo Crecimiento circunscrito al trazo
de siembra: BACTERIA NO
MOVIL
Perlado Negruzco
Claviforme Enrojecido
Rizoide Verduzco
En pino invertido Lechoso
Arborescente Fluorescente
Velloso Opalescente

OBSERVACION MICROSCOPICA CELULAR DE LAS CEPAS MEDIANTE LA

COLORACION GRAM: COMPROBACION DE LOS CULTIVOS INICIALES

El alumno aprenderá a relacionar el desarrollo macroscópico característico de cada

cepa con la morfología celular y capacidad tintorial. Verá por ejemplo que la cepa b,
microscópicamente, corresponde a BACILOS RECTANGULARES agrupados en largas
cadenas, Gram(+).
Por las condiciones favorables de los medios de cultivo se multiplicará
abundantemente en la forma antes descrita. Por lo tanto, en el CALDO NUTRICIO el
DESARROLLO será abundante; la TURBIEDAD, en grumos blanquecinos y gruesos; el
SEDIMENTO abundante y de NATURALEZA algodonosa; formará película en
superficie. En el agar en plano inclinado: DESARROLLO abundante, confluente y
erizado; TEXTURA lacerada, opaca a trasluz, sin pigmento, etc. En el agar en columna
presentará crecimiento en forma de pino invertido, el medio inalterado e inmóvil.
Las demás cepas presentarán microscópicamente una morfología distintiva
(diplococos, estreptococos, estafilococos, cocobacilos), que conjuntamente con el tipo

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de coloración Gram, variarán según el grupo, género o especie. Macroscópicamente, el

comportamiento cultural en cada uno de los medios también será característico.

COMPORTAMIENTO EN MEDIO LIQUIDO

COMPORTAMIENTO EN MEDIO SEMISOLIDO

MATERIALES.-

1.- 5 cultivos en caldo: cepas 1, 2, 3, 4 y 5 (24 a 48 hrs. de incubación).

5 cultivos en agar en plano inclinado de las mismas cepas.
3 cultivos en agar semisólido en columna de las cepas a, b y c.
2.- Asa de siembra, gradilla, lápiz graso o plumón, mechero de Bunsen.
3.- Batería Gram: cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, fucsina fenicada de Ziehl.
Láminas portaobjetos y cubreobjetos limpias.
4.- Microscopio, aceite de cedro y alcohol.

PROCEDIMIENTO.-

I. RESULTADO DEL COMPORTAMIENTO CULTURAL EN CALDO NUTRICIO

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1.- Observar cada uno de los cultivos mediante la siguiente técnica: con la mano
izquierda sostener cada cultivo a la altura del tercio anterior del tubo y con la
mano derecha establecer contraste a trasluz por detrás del cultivo, moviendo la
mano de abajo hacia arriba y viceversa. De esta manera, por contraste se verá
mejor desarrollo y turbiedad.

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2.- Anotar las características indicadas en el Cuadro I del tópico teórico. Por ejm.:

- DESARROLLO .................... abundante

- TURBIEDAD ..................... homogénea
- PELICULA ...................... ausente
- ANILLO ........................ ausente
- OLOR .......................... fecaloide
- SEDIMENTO
Cantidad ................... moderada
Naturaleza ................. Granular fina, blanca,
que al agitarse se re-
disuelve en ondas sero-
sas.

3.- Seguir las descripciones de las demás cepas.

4.- Motilidad Macroscópica: colocar una gota procedente del cultivo líquido en un
portaobjetos. Enfocar la preparación al microscopio primero con lente de menor
aumento y luego con el de mayor aumento, evitando se moje el objetivo. Se
reconocerá que el microorganismo es móvil por su desplazamiento a través del
campo microscópico como ya se ha indicado anteriormente.

II. RESULTADOS DEL COMPORTAMIENTO CULTURAL EN AGAR EN PLANO

INCLINADO

1.- Repetir el paso 1 del inciso I.

Para observar TEXTURA, poner el cultivo frente a la vista; para ver
TRANSPARENCIA, en sentido contrario, con observación a trasluz.
2.- Anotar características siguiendo las indicaciones del Cuadro II del tópico teórico.
Ejm. Cultivo de cepa d:

DESARROLLO moderado CONSISTENCIA viscosa

FORMA difusa CROMOGENESIS negativa
TEXTURA lisa ASPECTO DEL MEDIO inalterado
BRILLO vivo
TRANSPARENCIA opalescente
OLOR fecaloide
3.- Seguir las descripciones de las demás cepas.

III. RESULTADOS DEL COMPORTAMIENTO CULTURAL EN AGAR

SEMISOLIDO EN COLUMNA
1.- Repetir el paso 1 del inciso I.
2.- Anotar características siguiendo las indicaciones del Cuadro III del tópico teórico
(su importancia es relativa). Ejm. Cultivo de cepa d:

- DESARROLLO POR PUNTURA Difuso a través del trazo de siembra.

- ASPECTO DEL MEDIO Inalterado
- MOTILIDAD Muy activa (MOVIL)

COLORACION GRAM DE LAS 5 CEPAS

1.- Hacer tinción de cada cepa, sea del caldo o del agar.
2.- Comparar morfología, si son iguales o hay pleomorfismo. Si todas son Gram(+)
o todas son Gram(-). Si la morfología es igual a la de los cultivos iniciales.
3.- Hacer esquemas de las observaciones.

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Cuestionario
1.-¿Cuáles son las ventajas de la técnica de aislamiento por estriado ?

2.-¿Obtuvo una separación correcta de los microorganismos a partir de las muestras

empleadas?

3.- ¿Qué condiciones requiere para elegir una colonia y considerarla como un
aislamiento?

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