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PRACTIC A N 3

MTODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS



OBJETIVOS:

- Aislar BACTERIAS AERBICAS por los mtodos de ESTRIADO, DISEMINACIN Y
DIFUSIN
- Reconocer los diversos parmetros que se toman en cuenta para describir una
colonia bacteriana.
- Relacionar la morfologa de la colonia con la capacidad tintorial.

MATERIALES:
Muestra biolgica
- Leche natural
- Abono
- Bebida fermentada
Otros:
- Asa de siembra
- Alambre de nicrom en aro
- Agua destilada
- Plumn marcador
- Encendedor
- Mascarilla
- Guantes
- Leja
- Pao
- Gradilla

CULTIVO DE MICROORGANISMOS
1. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Gracias a la aplicacin de los medios de cultivo, se ha llegado a conocer ampliamente
el comportamiento cultural y fisiolgico de la variada flora microbiana que pulula en
los ambientes permitindose la identificacin especfica. Para ello es necesario
considerar la metodologa que conduzca a la exacta determinacin de la especie en el
laboratorio.

a. Siembra y Aislamiento de microorganismos

Siembra: Acondicionamiento de un microorganismo en un medio de cultivo, de
acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de temperatura
y tiempo de incubacin, pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. Se siembra con
dos finalidades: a) Para hacer un aislamiento y b) para hacer un trasplante.

Aislamiento: Permite la separacin del microorganismos a un estado de pureza a
partir de una muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie
para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, genere su
progenie formando colonias separadas. Si se aslan colonias distintas, cada colonia
tendr caracteres especiales. La morfologa bacteriana ser tambin distintiva.

Trasplante: Separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado en
tubo, que puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa pura y por tanto
trasplantes en medios especiales, se logran conocer las propiedades culturales y
bioqumicas y como resultado la identificacin especfica. Los trasplantes pueden
ser:

- De lquido a lquido
- De lquido a slido
- De slido a lquido
- De slido a slido

ELEMENTOS NECESARIOS PARA LA SIEMBRA

(1) Conocer la procedencia de la muestra (tierra, agua, plantas, secreciones,
desecho industrial, un cultivo en particular)
(2) El medio de cultivo estril y apropiado que condiciona el crecimiento del
microorganismo que se quiere estudiar.
(3) Los dispositivos de siembra: asas de siembra, pipetas graduadas, esptula de
Drigalsky, mecheros, etc.
(4) El cubculo de siembra apropiado para el cultivo en condiciones de asepsia.
Deben ser instalados en lugares fuera de corrientes de aire, lmparas
germicidas UV, mecheros, etc.
(5) Equipo complementario: gradillas, lpiz graso, lminas desinfectantes, etc.

RECOMENDACIONES PARA COLECTAR ALGUNAS MUESTRAS A SEMBRARSE

(1) Muestras de Leche: Botellas de 100 mL de capacidad con tapa limpios. Tomar
50 a 100 mL.
(2) Muestras de Agua: Almacenar en recipientes de vidrio blanco limpios con
capacidad de 250 mL. Se recomienda colectar 100 a 200 mL para asegurar el
estudio de los microorganismos. Si es agua turbia, recolectar 20 a 50 mL en
frascos de menor capacidad.
(3) Muestras de tierra: Si est abonada, basta 1 a 4 g en tubos de prueba de 25 x
120 mm. En caso de tierra virgen la recolecta se har en bolsas de polietileno
de mayor capacidad.
En general, toda muestra slida debe ser diluida de preferencia en solucin salina o en
agua destilada estril antes de la siembra. Adems, la cantidad de inculo debe
dosificarse en relacin con la densidad de la muestra, dispositivo de siembra y
volumen de medio utilizado.

2. AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA PETRI

Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio
slido. Se va descargando gradualmente el inculo para que en los ltimos planos del
medio queden escasas clulas que en el ambiente nutricio se irn multiplicando
logartmicamente hasta formar colonias puras.
Los mtodos de siembra varan segn el dispositivo de siembra y la forma de distribuir
el inculo. Cualquiera que sea el mtodo ensayado se aprovecha al mximo la
superficie del medio, logrndose aislar el mayor nmero de cepas microbianas.

a. Aislamiento por el Mtodo del Estriado
Con el asa de siembra se distribuye el inculo por ESTRIAS en ZAG, con escasa
separacin unas de otras (1-3) mm). La distribucin puede ser por estra simple
(inculo descrito en un solo plano por todo el medio) y estra en tringulo, cuadrado o
pentgono (estras en 3, 4 5 planos en el mismo medio respectivamente). El
nmero de estras depende de la cantidad de inculo y los planos de siembra
ensayados. Se evita romper el medio.

TECNICA N 1
1.- Con la mano derecha, cargar el asa en aro, previamente al rojo, con inculo de
cultivo mixto que sostiene la mano izquierda; destapar el cultivo con el dedo meique
y margen cubital de la mano derecha. Se debe flamear el tubo antes y despus de
extrada la muestra.
2.- Tomar con la izquierda la placa Petri con agar, descansando la base sobre los
dedos medio, anular y meique; el ndice acta de bisagra y con el pulgar, levantar la
tapa lo suficiente para el paso del asa cargada. Esta operacin se realiza a la altura
del mechero encendido.
3.- Descargar el inculo en un punto marginal de la superficie del medio y con el asa
misma, describir la ESTRIAS hasta el margen opuesto de la placa, cuidando de no
romper el medio (ESTRIADO SIMPLE).
En caso de estriado por PLANOS, repetir los pasos 1, 2, 3 hasta la descarga del inculo,
diseminar en el primer plano. Hacer 1/4 de giro de la placa y continuar con el estriado
en el segundo plano. Volver a hacer de giro ms para diseminar en estras en el
tercer plano, de igual modo en el cuarto plano. Puede hacerse el estriado en 5 planos y
an en la parte central del medio, con un solo inculo.
4.- Dejar caer suavemente la tapa con el control de los dedos pulgar e ndice.
5.- Rotular datos sobre el dorso de la placa Petri sembrada as: nmero de grupo,
tipo de siembra y fecha.
6.- Incubar a 37 C por 24 hrs. Colocar las placas en la estufa en posicin invertida.
TECNICA N 2
1.- Levantar con la izquierda y a la altura de la llama el dorso o base de placa Petri
que esta invertida sobre la mesa. Con la derecha cargar el asa y depositar el inculo
sobre el medio. Describir las ESTRIAS simples o por planos, manteniendo casi vertical
la placa, con la superficie del medio frente al operador.
2.- Regresar la base sembrada en su posicin normal en la mesa de trabajo.
3.- Poner datos e incubar en igual forma a la anterior.



b. Aislamiento por Diseminacin
Se practica mediante la pipeta Pasteur estril para la toma del inculo. Esta, por la
capilaridad, permite el ascenso del inculo a discrecin el cual es depositado en un
margen del medio y esparcido sobre el medio de cultivo con una esptula de
Drigalsky.
La placa Petri del cultivo debe destaparse lo suficiente como para permitir la estrecha
penetracin de la esptula de siembra; as se evita la contaminacin. Ver los pasos de
la tcnica en la parte experimental.

PROCEDIMIENTO.-

1.- Tomar el inculo del cultivo mixto con la pipeta Pasteur y depositar una gota
sobre el medio de la placa Petri N 2, que descansa en posicin normal sobre la mesa.
2.- Devolver el sobrante al tubo de cultivo.
3.- Destapar con la izquierda la placa Petri, lo necesario para introducir la esptula
de Drigalsky y diseminar la gota por la superficie del medio, no pasando dos veces
por el mismo plano.
4.- Desechar la esptula en el frasco bactericida.
5.- Rotular: nmero de grupo, tipo de siembra y fecha.
6.- Incubar igual a los mtodos anteriores.

NOTA: En caso de cultivo muy turbio, el inculo debe ser muy pequeo. Si est diluido,
inocular en el medio ms de una gota.




c.- Aislamiento por Difusin

Se practica de preferencia en ANALISIS CUANTITATIVOS BACTERIANOS. Por ejemplo,
una muestra de agua en la que se desea conocer el nmero de microorganismos por
mL.
Es diluida primero al 1/10, 1/1000, etc. de acuerdo a la turbiedad. Se toman alcuotas
(1ml) de cada dilucin y se depositan separadamente en placas Petri vacas y estriles.
Sobre cada una se vierte agar fundido y enfriado a 45 C (10-15 mL). La mezcla se
agita moderadamente con movimientos ondulantes; se espera a que el medio
solidifique, se rotulan los datos y se incuban las placas en posicin invertida, a 37 C.
A las 24 horas aparecern colonias aisladas en superficie y profundidad, a diferentes
planos. Estas ltimas, de forma lenticular y de dimetros diversos. Los clculos
matemticos de las cuentas es motivo de otra prctica.
Una variedad del mtodo consiste en depositar los inculos en tubos de prueba
conteniendo agar fundido. Se agita vigorosamente cada tubo entre las palmas de las
manos y el medio se vierte sobre cada una de las placas estriles antes que solidifique.
Otra modificacin: se toma de la muestra una cantidad conocida del inculo, se vierte
en el primer tubo con el agar fundido, se agita para difusin uniforme, de ste se toma
igual cantidad y se vierte en el segundo tubo, se agita, se toma igual cantidad de
inculo y se vierte en el tercer tubo, se agita y con movimientos rpidos se vierten los
3 tubos sembrados sobre las respectivas placas estriles. Se obtienen as las diluciones
seriadas y el nmero de colonias ser mayor en las ltimas diluciones. Las placas de
cultivo para incubacin se colocan invertidas para evitar que el agua de condensacin
de la cara interna de la tapa humedezca la superficie. Se asegura el crecimiento de
colonias aisladas.

PROCEDIMIENTO.-

El profesor har la demostracin con una muestra de tierra a 3 diluciones: 10
-1
, 10
-2
y
10
-3
.
Para los fines de la tcnica seguir cuidadosamente lo indicado por el instructor luego
de la demostracin.

NOTA: Hacer esquemas de cada uno de los mtodos de aislamiento y anotar
cualquier otra observacin no estipulada en la gua.








PRACTICA N 4
I. LECTURA: MORFOLOGIA DE COLONIAS

Ensayados los mtodos de aislamiento en la clase anterior, el alumno podr ahora
observar el resultado de sus siembras sobre el gel (agar corriente), en placas Petri, en
24 48 horas de incubacin.

Si ha seguido las instrucciones, podr visualizar sobre algunos planos del medio,
definidas masas microbianas separadas entre s: COLONIAS. Cada COLONIA, no viene a
ser sino el resultado de la multiplicacin logartmica de una clula depositada en un
punto del medio slido, que en condiciones ptimas de crecimiento forma su progenie
con sus caractersticas distintivas de ESPECIES o GRUPOS BACTERIANOS.

La morfologa puede depender de varis factores: naturaleza del medio para el vigor del
crecimiento, temperatura y tiempo de incubacin, modo de divisin celular y tipo de
movimiento de post-fisin; en consecuencia, una variedad de bacteria tiende a formar
constantemente el mismo tipo general de colonia cuando crece sobre el mismo medio
y bajo iguales condiciones. De esta manera, por sus caracteres ayuda grandemente a la
identificacin.
Aunque la mayora de especies bacterianas forma colonias definidas, algunas dan un
desarrollo difuso, sobre todo el medio, debido a su extrema motilidad. Ejm. Gnero
PROTEUS.
Tomando en cuenta la divisin celular y los movimientos de post-fisin, los caracteres
de las colonias de definen as:

a) DESLIZAMIENTO: Cundo las clulas se separan fcilmente despus de la divisin,
formando masas contorneadas, hmedas, de bordes lisos. As por Ejemplo La familia
Enterobacteriaceae.

b) LAZOS Y PLIEGUES: Cuando las clulas se dividen en cadenas largas que se
adhieren entre s, formando franjas o pliegues de paquetes de organismos (bacilos
rectangulares), que dan a la colonia un aspecto de cabellera despeinada o rizoide con
bordes irregulares. Por ejemplo Gnero Bacillus.

c) SALTOS: en caso de clulas cocobacilares o bacilares, unas veces se deslizan
aisladamente o formando pequeos grupos; las colonias generalmente esfricas y de
superficie lisa, terminan no obstante con bordes dentados o aserrados. Por ejemplo
algunas especies del gnero Pasteurella.

Los principales caracteres tomados en cuenta para la descripcin de una colonia son:
FORMA, TAMAO, BORDE, ELEVACION, TEXTURA DE LA SUPERFICIE, CONSISTENCIA,
GRADO DE ADHERENCIA AL MEDIO, CROMOGENISIS.

Las variaciones de cada uno de los caracteres se sintetizan en el siguiente Cuadro
Comparativo:


REQUISITOS PARA LA DESCRIPCIN DE COLONIAS ELEGIDAS

(1) Las colonias deben llegar a su mximo desarrollo, generalmente se obtienen en
un tiempo de incubacin de 24 horas a 37 C, en la mayora de especies que
estudiamos.
(2) El medio sobre el que se desarrollan debe siempre conservar en el ltimo
trazo de aislamiento su aspecto transparente. Facilita su ubicacin en superficie,
mirando por el dorso de la placa.
(3) Las colonias de eleccin deben ser las que han desarrollado en el ltimo trazo de
siembra. Adems de presentar caracteres normales, garantiza el grado de pureza por
carecer de competencias vecinas.
(4) Se recomienda su ubicacin por trazos (crculos, cuadrados, etc.) con lpiz graso
o plumn, sobre la base de la placa Petri. Se evita confusin con las que no son de
inters para el estudio. En caso de describir ms de una, es mejor enumerarlas en
el dorso mismo de la placa.
(5) Proceder a la observacin macroscpica sobre la base de los caracteres del
cuadro. Para mejor observacin de la textura, es mejor el auxilio de una lupa o
microscopio estereoscopio. Para el estudio de la elevacin mirar la colonia de
perfil, levantando moderadamente la tapa de la placa a la altura de la llama del
mechero.
(6) Ajustar las descripciones acompaadas de esquemas. Si son varias las
descritas, guardar relacin de forma, tamao, aspecto y otros.

MATERIALES.-

1.- Tres cultivos mixtos en agar nutritivo sembrados por difusin, diseminacin y
estriado a partir de agua de regado, leche y abono con diluciones al 1/100 y 1/
1000 para demostracin.

PROCEDIMIENTO.-

1.- Observar y comparar el desarrollo microbiano en las placas. Recordar que las
placas Petri fueron inoculadas con diferentes muestras usando un mtodo distinto de
aislamiento.
2.- En el ESTRIADO SIMPLE, ver desarrollo difuso indiferenciado sobre los
primeros trazos; numerosas colonias aisladas bien definidas, sobre los ltimos trazos
de siembra.
3.- Observar 5 colonias diferentes, si el aislamiento fue bien llevado. Cada una,
corresponde a una especie bacteriana distinta.
4.- Con el plumn marcador limitar mediante un crculo o cuadrado sobre el
dorso de la placa, la colonia elegida y enumerarla.
5.- Describir caracteres morfolgicos consultando con el CUADRO COMPARATIVO.
En caso de duda, preguntar al profesor.
Para mejor observacin de TEXTURA, mirar con lupa. Para ELEVACION, observar
de perfil la colonia levantando discretamente la tapa de la placa Petri.
6.- En la MUESTRAS PROBLEMAS, ver colonias distintas o algunas idnticas. En
muestras con escasos grmenes,las colonias crecern compartidas en la mayor
parte de la superficie del medio.
7.- Describir algunas de las de MUESTRA PROBLEMA; las que se encuentren bien
distanciadas unas de otras, siguiendo los pasos anteriores.
8.-Los cultivos en las placas Petri aislados por el mtodo de DIFUSIN, presentarn
colonias en superficie en profundidad a varios planos.
Las primeras con caractersticas consignadas en el CUADRO COMPARATIVO; las
segundas, lenticulares, de varias dimensiones, opacas y transparentes:

11.- Representar esquemticamente el desarrollo de las colonias por cada
muestra de agua de regado, leche y abono y presentar las caractersticas
morfolgicas observadas de cada una de las colonias analizadas segn el cuadro
comparativo mencionado arriba.


CUESTIONARIO
1.- Mencione otros mtodos utilizados en la caracterizacin de los aislamientos de
microorganismos. Explique su fundamento.































PRACTICA 5
COLORACIN DIFERENCIAL DE GRAM. PREPARACIN Y FIJACIN
OBJETIVOS
- Diferenciar a los microorganismos por su capacidad tintrea.
- Relacionar la diferencia en composicin de pared celular de acuerdo a la coloracin
de GRAM.

COLORACION GENERALIDADES
Debido a la naturaleza qumica de la clula bacteriana, su afinidad por los colorantes
bsicos es manifiesta, si tomamos en cuenta su principal contenido de cidos
nucleicos. Esta propiedad ha sido aprovechada para estudiar mejor los diferentes
tipos morfolgicos y estructuras (cpsulas, esporas, flagelos, etc.) que ayudan a la
identificacin de una especie o grupo en particular.
Los colorantes de mayor aplicacin son los derivados del alquitrn de hulla (anilinas):
Cristal Violeta, Violeta de Genciana, Fucsina Bsica, Safranina, Azul de Metileno y
Verde de Malaquita. Actan mejor mediante la adicin de mordientes, porque
aumentan la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmtica.
Las coloraciones de rutina con un solo tinte no permiten observar con nitidez cada una
de las estructuras mencionadas. De mayor aplicacin prctica son las especficas o
diferenciales que requieren prolijidad para un resultado satisfactorio ya que
intervienen dos o ms colorantes.
Para mejor comprensin del mecanismo de coloracin en microorganismos, es
necesario referirse a la accin de los tintes, principalmente los utilizados en
microorganismos.
Las imgenes producidas por absorcin en las preparaciones coloreadas son ms
fciles de interpretar que las imgenes de difraccin dadas por las preparaciones
frescas, sobre todo, teniendo en cuenta que los diferentes elementos celulares
poseen casi el mismo ndice de refraccin, lo que hace su diferenciacin difcil.
En general, las bacterias tienen afinidad por los colorantes derivados de la anilina o en
especial por aquellos de carcter bsico. Estos colorantes llevan en su parte cromfora
carga electro-positiva, lo que tendra una fuerte afinidad por los grupos
electronegativos que normalmente presentan las bacterias en su protoplasma, entre
los cuales se encuentran los cidos nucleicos y sus derivados.
Para una breve tincin hay que tomar en cuenta la naturaleza de la bacteria; edad del
cultivo, muestra y preferentemente una buena aplicacin de la tcnica.


COLORANTE.-
Definicin.-
Sustancia que tiene la propiedad de comunicar color a otros cuerpos de cualquier
naturaleza.
Composicin
Para que una sustancia sea colorante debe estar compuesta por:
MOLECULA INCOLORA + CROMOFORO + AUXOCROMO = COLORANTE
Donde:
Cromgeno: Son las molculas que poseen potencialidad de coloracin; esta
potencialidad es conferida por un radical llamado CROMOFORO.
Cromforo: Son grupos de tomos no saturados susceptibles de dar coloracin a las
molculas de las cuales forman parte; la fuerza de los cromforos vara con la
naturaleza de sus tomos y de su estructura. Algunos de estos grupos dan reaccin
bsica. Ejm.: Grupo AZO (-N=N-), grupo INDAMINICO (-N=), grupo AZINA (*). Otros
dan reaccin cida, por ejm. Grupos Nitro: NO
2
.
Auxocromo: Sustancias no saturadas, debido a esta insaturacin influyen en el color.
Pueden ser:
Simples: Cuando cada uno encierra un tomo no saturado. Ejm.: grupos
-OH, - SO
3
H, NH
2
.
Compuestos: Cuando cada uno encierra dos tomos no saturados. Ejm.:
Grupos hidroxilaminados (-NHOH), grupos hidroxnicos
(-NHNH
2
), grupos Tiohidroxilaminados (-SNH
2
).

En bacteriologa se emplean colorantes cidos y bsicos, siendo los bsicos de mayor
importancia para el bacterilogo.

RECOMENDACIONES GENERALES PARA CUALQUIER COLORACION
Cualesquiera de las tcnicas de coloracin bacteriana implican un cuidadoso
procesamiento del material colorearse. La calidad de los tintes, fijadores, mordientes
y decolorantes debe estar garantizada al igual que la preparacin.


ETAPAS A SEGUIR:
(1) EXTENSION O FROTIS
La lmina debe estar transparente, desengrasada y limpia. Si el cultivo es
lquido, con el asa de siembra en aro esterilizada previamente al rojo, tomar
1-2 gotas y extender suavemente sobre el centro del portaobjetos. Si el
cultivo es slido, primero colocar con el asa 1 gota de agua destilada estril
sobre el portaobjetos y luego tomar el inculo, emulsionar y extender igual
que en la anterior.
(2) FIJACION
Someter el frotis a la llama del mechero con calentamiento moderado o con
alcohol de 70% u otro lquido fijador.
(3) COLORACION
Cubrir la extensin fijada con la solucin colorante ensayada. Evitar
evaporacin por el tiempo que debe actuar. Se intensifica la coloracin con
el uso de mordientes como el lugol en el caso de tincin GRAM, cido tnico
para teir flagelos, etc. El tiempo vara de acuerdo a la tcnica.
(4) DIFERENCIACION
Con alcohol simplemente, alcohol acetona o cidos fuertes, como agentes
decolorantes.
El empleo de cada uno depende de la tcnica. Deben dejarse actuar hasta que
el lquido quede incoloro, para desprender el exceso de colorante.
(5) LAVADO
Con agua corriente para sacar el exceso de diferenciador; en algunos casos
se recomienda usar agua destilada.
(6) DECOLORACION
Para tincin de estructuras que se decoloran por la accin de los
diferenciadores. Hacer actuar los colorantes de contraste, el tiempo vara
segn la tcnica.
(7) LAVADO FINAL
A chorro continuo de agua corriente hasta que arrastre todo exceso de
colorante. Es preferible para algunas tcnicas, el uso de agua destilada
solamente. Evitar formacin de precipitados.
(8) SECADO
Preferible al ambiente, colocando el preparado en plano inclinado para el
escurrimiento y con el frotis protegido de polvo o impurezas. Se puede
acelerar el secado con el calor del mechero, evitando sobrecalentamientos.
(9) OBSERVACION
Observar al microscopio con lente de inmersin y aceite de cedro.
Conviene primero enfocar con lente de menor aumento (10X).

II.COLORACION POR EL METODO GRAM
Es uno de los principales mtodos de amplia utilidad para clasificar a las bacterias en
dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. Las primeras toman el
Cristal Violeta tindose de azul violceo y las segundas, pierden el Cristal Violeta al
ser lavadas con el diferenciador (alcohol acetona): es necesario imprimirle un
colorante de contraste: fucsina o safranina, para ser observadas, tindose de
rojo.

MECANISMO DE LA COLORACION GRAM
Se ha estudiado intensamente desde su iniciador (el dans Christian Gram, 1884)
hasta nuestros das, el mecanismo ntimo de la COLORACION GRAM, surgiendo
varias teoras al respecto:
La ms generalizada dice que el Cristal Violeta en mezcla con el Lugo (mordiente)
forma en la clula el complejo CARBOHIDRATO-PROTEINA-RIBONUCLEATO DE
MAGNESIO, y luego sta, al ser tratada con el alcohol acetona (diferenciador) no cede
el colorante, quedando teida de violeta. En cambio las que ceden el colorante por el
tratamiento con el colorante de contraste (fucsina o safranina) se tien de color rojo
pudiendo ser observadas. Estudios recientes comparativos atribuyen el carcter de
gram positividad a la estructura qumica de las paredes celulares; entre otras,
principalmente, al contenido de lpidos. En las gram positivas la permeabilidad de las
paredes resistentes puede decrecer por el efecto deshidratante del alcohol, mientras
que en las gram negativas el alcohol extrae de sus paredes el gran contenido de lpidos
aumentando la permeabilidad. De esta manera, fcilmente escapa el complejo cristal
violeta-yodo o violeta de genciana- yodo.
Es evidente entonces que la pared de las bacterias Gram positivas interpone una
barrera que impide acceso al decolorante; en consecuencia, evita la prdida del
complejo tinte. Si las Gram positivas teidas se tratan con lisozima se liberan
protoplastos que retienen el colorante, mostrando que la clula misma y no la pared
es el sitio de la reaccin Gram. Sin embargo, al actuar el decolorante, los protoplastos
pierden el tinte y se hacen Gram Negativas.
Otros experimentos como la rotura mecnica de la clula o el procesamiento con la
enzima ribonucleasa, convirtiendo en Gram negativas las que inicialmente fueron
Gram positivas, nos conduce al convencimiento que la integridad estructural
fisiolgica de la pared celular juega un papel importante en el mecanismo de este
mtodo de coloracin.
Es evidente entonces que la causa de la coloracin Gram gravita en la diferencia de
composicin qumica de la pared y protoplasma celular de las Gram (+) y Gram (-).
Para una buena tincin hay que tomar en cuenta la naturaleza de la bacteria, edad del
cultivo o muestra, el carcter cido o bsico del medio y preferentemente una
buena aplicacin de la tcnica. Cualquier variacin puede alterar el resultado.
Cuando el cultivo es viejo, las bacterias Gram (+) se tornan Gram (-). En cultivos
demasiados jvenes, las clulas individuales pueden reaccionar con una u otra forma
de tincin. En el caso de ciertas especies bacterianas, por ejemplo Neisserias
saprofticas que son bacterias Gram (-) toman inicialmente en forma tan intensa la
coloracin Gram, que a una discreta coloracin puede que aparezcan como Gram (+),
prestndose a confusin en el diagnstico morfolgico.
Aparte de la reaccin Gram, hay otras caractersticas diferenciales entre ambos grupos
con propiedades fundamentales que guardan relacin con la Gram positividad (ver
cuadro a continuacin).

Ejemplos:
Bacterias Gram (+): Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Bacillus subtilis,
Diplococcus neumoniae y otros.
Bacterias Gram(-): Neisseria gonorrhoeae , Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Salmonella typhi y otros.

MATERIAL.-
1.- Cultivos en placas Petri aisladas con los mtodos de Difusin, Diseminacin y
Estriado a partir de muestras de agua de regado, leche y abono.
2.-Batera Gram: Cristal Violeta, Fucsina Bsica, Lugol, Alcohol-acetona.
3.-Lminas portaobjetos limpias, asa de siembra, lpiz graso.
4.-Microscopio y aceite de inmersin. Papel lente. Solucin desinfectante (leja).
5. Alcohol 70.
6. Guantes
PROCEDIMIENTO.-
1.- Del cultivo tomar el inculo con el asa de siembra, siguiendo las indicaciones del
instructor. Extender sobre la lmina conforme se indica en las recomendaciones
generales. Flamear nuevamente el asa hasta quedar estril. Tomar el inculo de las
colonias previamente caracterizadas morfolgicamente.
2.-Fijar la preparacin a la llama o al ambiente. En el primer caso por pasadas ligeras.
Se controla sobre el dorso de la mano. Si el calentamiento es moderado, no habr
calcinacin.
3.-Cubrir con la solucin Cristal Violeta por 1 minuto.
4.-Lavar ligeramente con agua corriente.
5.-Cubrir la preparacin con Lugol, por 1 minuto.
6.-Diferenciar con alcohol acetona hasta que ste no arrastre colorante. Es mejor
regular la accin del alcohol con movimientos de balanceo con la preparacin antes
de ser descartado.
7.-Lavar con agua caliente.
8.-Contrastar con el colorante Fucsina bsica o Safranina, por 10 segundos a 1
minuto.
9.-Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar precipitados.
10.-Secar al ambiente o con ayuda del mechero.
11.-Observar el microscopio con lente de inmersin y aceite de inmersin.
12.- Reconocer diversas tipos de morfologa celular: cocos aislados, en parejas, en
racimos regulares e irregulares y en cadenas. Tambin bacilos rectangulares,
aislados o en cadenas. Todos de color morado intenso, si la tcnica ha sido bien
seguida. Son los GRAM POSITIVOS. Tambin cocos en granos de caf y por parejas.
Son los GRAM NEGATIVOS.
13.- Dibujar sus observaciones.
14. Relacionar la morfologa de la colonia con morfologa bacteriana y tipo de
tincin gram que la conforma.



CUESTIONARIO

1.- Haga un esquema de la pared celular de bacterias gram + y gram y mencione
diferencias y semejanzas.

2.- Afecta la edad del cultivo a la coloracin de Gram?

3.- Por qu se utiliza el aceite de inmersin para observar bacterias en el
microscopio?

Defina:
- Tincin diferencial
- Tincin simple
- Mordiente