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6. El crecimiento de los
microorganismos

e.1 Nutrición de los microorganismos


El crecimiento de lm. microorganismos va ligado a la presencia de agua.
1,..as sustancias disueltas en el agua, a partir de las cuales los microorga-
nismos forman su material celular y obtienen energía. son los nutrientes.
1,..os requerimientos de l<h distintos microorganismo" en cuanto a la com-
Posición del medio de cultivo y a las demás cond1c1ones ambientales son
mu~ 'ariables. Por ello \C han descrito muchas receta\ de la composición
de Jo-. medios de cultivo para los microorganNnos. Básicamente la diso-
lución ha de cumplir la siguiente condición mínima. han de estar prcsen-
ICS todos los elementos implicados en la constitución del material celular.
y en forma de compue\tOs utilitables.
Requerimientos nulricionales elementales. Desde el punto de vista de la
composición química de las células se distingue entre 11 macroelemen-
tos: carbono. oxígeno, hidrógeno. nitrógeno. atufre. fósforo. potasio.
sodio. calcio. magnesio. hierro (C. O. H. N.S. P. K. Na, Ca. Mg. Fe) con-
tenidos en todos lo., microorganismos. y los microclem cntos u oligoele-
mentos: mangane'>o. molibdeno. zinc. cobre. níquel. vanadio. boro. cloro.
selenio. silicio. wolframio entre otros. que no los necesitan todos los orga-
nismos. Los metales (X!sado'> \on principalmente componentes de lo'> en7i-
mas que transforman elementos o compuestos inorgánico... (0 . N~. H~. S' .
SO/ . SO/ . O . NQ, . 114 ). La mayoría de e\tO\ elementos que '>ólo
1e requieren en tra1as. se encuentran como contaminación en las -.ales de
los macroelementos) llegan a lo'> medios de cul11vo tamb1en a través de
los frascos de vidrio y partículas de polvo. Por ello. la demostración del
requerimiento de un detem1inado ·Oligoelemento necesita precauciones
especiales. Muchos iones metálicos son tóxicos en concentraciones mili-
llolares (Hg. Cu. Zn, N1. Co, Cd. Ag. Cr. Se).
la mayoría de los elementos se añaden a los medio-. de cultivo en fonna
de sal. En la-. tabla-. 6.1 >6.2 -.e da la compo'>ición de un medio de culti-
o sintético sencillo) de una di-.olución de oligoelemen1os.
Pnentes de carbono y energía. Los organi-.mos que obtienen -.u energía
1 través de la fotosínte"' o de la oxidación de compue'>tos inorgánicos.
Ion capaces de util11ar el anhídrido carbónico como fuente principal de
Clrbono. Estos organismo., autótrofos para el C reducen el co,_ Todos lo'>
dernás organismos obtienen el carbono celular principalmente a partir de
llUtrientes orgánicos. fatos últimos se utili1an generalmente tanto como
194 6. El crecimiento de los microorganismos

Tab. 6.1 Ejemplo de una solución nu- Tab. 6.2 Solución madre de oligoele.
tritiva sintética sencilla. mentos.

K2 HPO, 0,5 g ZnCI, 70 mg


NH, CI 1,0 g MnCh. 4 H.o 100 mg
MgSO, · 7 H20 0,2 g CoCl2 . 6 H.o 200 mg
Feso•. 7 H.o 0,01 g NiCl2 · 6 H20 100 mg
CaCl2 · 2 H20 0,01 g CuCl2 · 2 H. O 20 mg
Glucosa 10,0 g NaMoO, . 2 H.o 50 mg
Agua 1000 mi Na2Se03 · 5 H20 26 mg
Solución concentrada de [NaV03 · H20 10 mg)
oligoelementos 1 mi [Na2WO, · 2 H20 30 mg]
HCI (25%) 1 mi
Agua destilada 1000 mi
Tab. 6.3 Solución vitamínica acredi- [ ), sólo lo requieren algunos organismos
tada para bacterias del suelo y del
agua.

Biotina 0,2mg
Ácido nicotínico 2,0 mg
Tiamina 1,0 mg
4-Aminobenzoato 1,0 mg
Pantotenato 0,5 mg
Piridoxamina 5,0 mg
Cianocobalamina 2,0 mg
Agua destilada 100 mi
Se añaden 2-3 mi de la solución vitamí-
nica a 1000 mi de la solución nutritiva.

fuente de carbono como de energía; en parte se asimilan en forma de sus·


tancia celular, y en parte se oxidan para la obtención de energía. Las su~­
tancias naturales más abundantes en cantidad sobre Ja Tierra son los poh-
sacáridos celulosa y almidón. Muchos microorganismos son capaces <le
utilizar los componentes monoméricos de estos polímeros, la glucosa. ~o
obstante, todas las demás sustancias orgánicas de origen natural tamb1en
pueden ser utilizadas y degradadas por los microorganismos.
Suplementos. Muchos organismos requieren para su nutrición, además de
minerales, fuentes de carbono y energía, algunos suplementos o factores
de crecimiento. Se trata de algunas sustancias que pertenecen a los compo·
nentes básicos de la célula y que no pueden sintetizarse a partir de co1n·
ponentes más sencillos. Los factores de crecimiento pertenecen a tres gru·
pos de sustancias, los aminoácidos. las purinas y pirimidinas, así como las
6.1 Nutrición de los microorganismos 195

vitaminas. Los aminoácidos, purinas y pirimidinas son componentes de


tas proteínas y los ácidos nucleicos, y la célula los requiere en las canti-
dades correspondientes; las vitaminas, por el contrario, son componentes
de coenzimas o grupos prostéticos, y tienen por ello funciones enzimáti-
cas o catalíticas, y se utilizan únicamente en cantidades muy pequeñas
(Tab. 6.3). Los organismos que presentan requerimientos nutritivos se
denominan también auxótrofos, en oposición a los prototrofos, organis-
mos que no requieren estos suplementos.
¡\zufre y nitrógeno. Ambos elementos se encuentran en la célula predo-
minantemente en forma reducida, como grupos sulfhidrilo o amino. La
mayoría de los microorganismos son capaces de captar estos elementos en
su forma oxidada y de reducirlos hasta sulfato y nitrato. La fuente de nitró-
geno más común entre los microorganismos es la sal de amonio. Algunos
procariotas son capaces de reducir el nitrógeno molecular (N 2 o dinitróge-
no). Otros microorganismos necesitan aminoácidos, esto es, fuentes de
nitrógeno que lo contengan ya en forma orgánica. Tampoco todos los
microorganismos son capaces de reducir el sulfato; algunos requieren sul-
furo de hidrógeno y otros cisteína como fuente de S.
Oxígeno. El oxígeno se encuentra a disposición de las células en forma de
agua. Está contenido además en el anhídrido carbónico y en muchos com-
puestos orgánicos. Muchos microorganismos necesitan además oxígeno
molecular (02 o dioxígeno). La función principal del 0 2 es la de aceptor
final de electrones en la respiración aeróbica; el 0 2 se reduce entonces a
agua. Las moléculas de oxígeno procedentes del 0 2 únicamente se incor-
poran al material celular cuando la fuente de carbono es el metano o hidro-
carburos de cadena larga o aromáticos.
Con respecto a la relación con el oxígeno se diferencian como mínimo
tres grupos de organismos: los organismos aeróbicos obligados o
estrictos, sólo pueden obtener energía mediante la respiración y necesi-
tan 02. Los organismos anaeróbicos obligados sólo pueden crecer en un
medio sin 0 2; el 0 2 es tóxico para ellos (pág. 272). Los microorganis-
~os anaeróbicos facultativos crecen tanto en presencia como en ausen-
cia de 0 2. Entre ellos hay que distinguir dos tipos: las bacterias del ácido
láctico, aunque pueden crecer en presencia del oxígeno atmosférico, no
pueden utilizarlo, sino que obtienen la energía exclusivamente por fer-
mentación; son aerotolerantes. Otras bacterias anaeróbicas facultativas
<Enterobacteriáceas) y muchas levaduras pueden obtener energía tanto
Pür respiración (en presencia de 0 2) como por fermentación (en ausencia
de 0 2).
Muchas, sino la mayoría, de las bacterias aeróbicas son microaerófilas,
e~to es, necesitan 0 2 para la obtención de energía, pero no toleran la pre-
sión parcial del aire (0,20 bar), sino tan sólo entre 0,01 a 0,03 bar.
196 6. El crecimiento de los microorganismos

6.2 Medios de cultivo y condiciones de crecimiento


Una gran cantidad de microorganismos sin requerimientos, como por ejem.
plo muchos pseudomonas del suelo y del agua, pero también Escherichia
coli, se desarrollan perfectamente en un caldo de cultivo con una composi-
ción como la indicada en la tabla 6.1. Muchos microorganismos necesitan
además uno u otro de los oligoelementos, vitaminas o suplementos antes
indicados. Si el medio de cultivo está compuesto por sustancias químicas
definidas, se habla de un medio de cultivo sintético o definido. Se preten.
de conseguir definir para cada microorganismo los nutrientes mínimos para
establecer un medio mínimo, que contenga únicamente los componentes
necesarios para el crecimiento. Las especies más exigentes requieren un
gran número de complementos. Para Leuconostoc mesenteroides se ha desa-
rrollado un medio sintético que contiene más de 40 componentes.
M edios d e cultivo complejos. Para muchos microorganismos exigentes
no se conocen aún suficientemente bien los requerimientos nutritivos. Se
cultivan en disoluciones que contienen extracto de levadura, autolisado de
levadura, peptona o extracto de carne. Para algunos grupos de organismos
son también corrientes: mosto (extracto de malta), infusión de heno, jugo
de ciruelas, jugo de zanahoria, leche de coco, y para hongos coprófilos
incluso extracto de excremento de caballo. Debido a Jos costos, a los
medios de cultivo se les añade en lugar de sustancias puras otras comple-
jas, como lactosuero, melazas, agua de maíz o extracto de soja, que son
productos de desecho baratos. Los medios de cultivo de este tipo se deno-
minan complejos o no definidos.
Medios de cultivo sólidos. Para obtener medios de cultivo sólidos se añade
a los caldos de cultivo unas sustancias solidificantes, que dan a las disolu-
ciones acuosas una consistencia gelatinosa. La gelatina ya sólo se utiliza en
casos aislados, porque licua ya a 26-30ºC y muchos microorganismos son
capaces de licuar la gelatina. Un solidificante casi ideal es el descubierto en
1883 por HEssE, un colaborador de R. KocH, al introducir el agar en la téc-
nica bacteriológica. Es un polisacárido extraído de algas marinas, intensa-
mente ramificado y entrelazado, de composición compleja. Se añade a Jas
disoluciones acuosas en una concentración de 15-20 gil. El agar funde a
lOO"C, pero se mantiene líquido al enfriarse hasta 15ºC de temperatura. Es
atacado tan sólo por pocas bacterias. Cuando se necesitan medios sin com·
ponentes orgánicos se utiliza el gel de sílice como solidificante.
Concentración d e ion es h idrógeno. Los iones W y OH- son los iones
más móviles de todos; por ello, pequeñas modificaciones en su concen·
tración tienen grandes consecuencias. El establecimiento de un pH inicial
óptimo y el mantenimiento del pH durante el crecimiento es por ello de
gran importancia.
6.2 Medios de cultivo y condiciones de crecimiento 197

¡,a mayoría de los organismos se desarrolla óptimamente cuando los iones


W y OH- están aproximadamente en igual concentración (pH 7 ,0).
Muchas bacterias prefieren valores de pH superiores, un medio ligera-
fllente alcalino, p. ej. los nitrificantes, los rizobios, los actinomicetos, las
bacterias degradadoras de la urea (Fig. 6.1 ). Tan sólo pocas son ácidoto-
Ierantes (lactobacilos, Acetobacter, Sarcina ventriculi) o acidófilas
(Thiobacillus). Los hongos prefieren valores de pH bajos; si se inocula
con tierra medios complejos a distintos valores de pH, aparecerán prefe-
rentemente hongos a pH 5,0 y preferentemente bacterias a pH 8,0.

hongos bacterias

1 1 1 1
3 4 5 9 10 11

acidófilos neutrófilos

~Nus th1oox1dans Alca/1genes Rhizoblum Natronobactertum


~ acidocB/darius Pseudomonas Nitrificantes Ectothiorho<Jospira
'lflodic11um occultum Actonomicetos Especies de
Acetobacter Badllus ureolítocos
Lactobaclllus

Flg. 6.1 Márgenes de pH tolerados o preferenciales para hongos y bacterias.

El mantenimiento de un deterrninado valor de pH durante el crecimiento


tiene gran importancia sobre todo para aquellos microorganismos que a
pesar de producir ácidos, no los toleran (lactobacilos, Enterobacteriáceas,
muchos pseudomonas). La autodestrucción por los ácidos formados se
combate utilizando sustratos no fermentables (para cultivos de larga dura-
ción) o tamponando el medio. Los fosfatos inorgánicos tienen ya un cier-
to efecto tampón, aunque leve a pH superior a 7 ,2. Si se da una excreción
más fuerte de ácidos, se recomienda la adición de carbonato cálcico, y si
no se quieren componentes insolubles, de carbonato sódico. En el último
caso, hay que tener en cuenta que los iones bicarbonato están en equilibrio
con el C02 disuelto físicamente, y por tanto con el contenido en anhídri-
do carbónico de la atmósfera gaseosa (p. ej. aire):
C02(gas) =C02(disuelto) =C02 + H 0 =H2C0 =W + HC0
2 3 3-

la relación entre el pH, concentración de bicarbonato y presión parcial de


C02 de Ja atmósfera gaseosa viene dada por la ecuación de HENDERSON-
liASSELBACH; la concentración de ácido carbónico es igual al producto de
la presión parcial de ácido carbónico y el coeficiente de solubilidad ex:
PH " pK' + log e (HCQ3-)
p (C02) ·a
198 6. El crecimiento de los microorganismos

Por lo demás, muchas bacterias son poco sensibles a pequeñas oscilacio.


nes del pH entre 6 y 9. No obstante, las modificaciones rápidas detenn¡.
nan brevemente una leve alteración del valor del pH intracelular, aunque
al cabo de 30 minutos se reinstaura el valor anterior de pH interno.
Las lesiones que aparecen a valores desfavorables de pH no se deben a los
iones H+ y OH-; los últimos elevan únicamente el porcentaje de ácidos 0
bases débiles no disociados, que en estado no cargado penetran mucho
más fácilmente en las células que sus productos de disociación. Los fisio-
lógican1ente activos son siempre los ácidos no disociados. El succinato,
bibásico, o el ácido cítrico, tribásico, penetran tanto más rápidamente en
la célula cuanto más bajo sea el valor de pH del medio.
Anhídrido carbónico. Un medio específico para el crecimiento de micro-
organismos autótrofos fijadores de C02 contiene generalmente bicarbona-
to sódico, y se incuba bajo una atmósfera que contenga anhídrido carbó-
nico en un recipiente cerrado. También puede hacerse pasar aíre o aire
enriquecido en C02 • Siempre hay que tener en cuenta la relación anterior-
mente indicada entre el pH, la concentración de bicarbonato y la presión
parcial de C02 en la atmósfera.
Pero también los microorganismos heterotróficos, los que asimilan fuen-
tes de carbono orgánicas, necesitan anhídrido carbónico. Muchas bacterias
que viven de forma parásita en Ja sangre, los tejidos o el canal intestinal
están adaptadas a atmósferas con un contenido elevado en anhídrido car-
bónico. Para ello se incuba a dichas bacterias con una mezcla de aíre o gas
que contenga en volumen un 10% de anhídrido carbónico. Hay que con-
siderar además, que la eliminación del anhídrido carbónico, por ejemplo
por absorción con hidróxido potásico, impide el crecimiento de casi todas
las bacterias (véase fijación de COi, pág. 407).
Contenido hídrico y presión osmótica. Los microorganismos se diferen-
cian ampliamente entre sí con respecto al contenido en agua. Para poder
comparar las disoluciones acuosas y las sustancias sólidas desde el punto
de vista del agua disponible, se recurre al parámetro actividad d el agua
(a") o humedad relativa. Este parámetro hace referencia a la fase de vapor
de agua que se encuentra en equilibrio con un material sólido o una diso-
lución. Indican el cociente entre la concentración de agua en la fase gaseo·
sa en el espacio aéreo por encima del material, y la concentración de agu.a
en el espacio aéreo por encima de agua pura a una temperatura deterrn•·
nada.
Los microorganismos pueden crecer a actividades hídricas entre 0,998
hasta 0,6. La menos exigente es la levadura Saccharomyces rouxii. que
tolera altas presiones osmóticas; crece a aw = 0,6. Aspergillus glaucus !
otros mohos crecen a ª"' = 0,8. La mayoría de las bacterias necesitan actt·
6.2 Medios de cultivo y condiciones de crecimiento 199

idadcs hídricas de más de 0,98. La única excepción la constituyen las


~ccerias halófilas, con un ª" = 0,75.
fernperatu ra. Los microorganismos presentan distintos comportamien-
tos en cuanto a las temperaturas de incubación que requieren. La mayoría
de las bacterias del suelo o del agua son mesófilas; tienen su tasa máxima
de crecimiento entre los 20"C y los 42°C. Los organismos termotoleran-
tes son los que todavía pueden crecer a 50°C (Methylococcus capsulatus).
i,as bacterias ter mófilas crecen a temperaturas superiores a los 40ºC con
una tasa máxima y tienen el límite superior a los 70ºC (Bacillus stearo-
thermophilus, Thermoactinomyces vulgaris). Se denominan organismos
terrnótilos extremos a aquellos que tienen su óptimo de crecimiento por
encima de los 65°C (Thermus aquaticus, Sulfolobus); algunos de ellos
pueden crecer a temperaturas por encima de los 70ºC (varias especies del
género Bacíllus y Clostridium) o incluso por encima de los 80º C
(Su/folobus acidoca/darius) o incluso a 105°C (Pyrodicti11111 occultum, una
bacteria reductora de sulfato anaeróbica estricta). A las bacterias que cre-
cen por encima de los 80 y IOOºC se las denomina organismos hiperter-
mófilos. Al otro extremo de la escala de temperaturas se encuentran los
psicrófilos (o criófilos), organismos entre los que predominan algunas
bacterias marinas (bacterias luminiscentes) y las bacterias del hierro
(Gallionella ); tienen su tasa óptima de crecimiento por debajo de los 20ºC.
Aireación. El oxígeno es el aceptor de electrones imprescindible para
todo~ los microorganismos aeróbicos estrictos. Para la mayoría de las bac-
terias que crecen sobre placas de agar o en medios líquidos poco profun-
dos es suficiente el oxígeno del aíre. No obstante. incluso en el interior y
por debajo de una colonia bacteriana puede bajar hasta cero la presión par-
cial de oxígeno. La figura 6.3 explica esta situación y aclara el hecho

lo 10 20 30 40 50 60 70 eo
~ 1 1 1 1 1 1 1 1

[ ps>erofilos
1 1
termóf1los
1

mesófilOs
1
a..ione11a Eschenchia co/i Baetl/us Thermococcus PyrodJCtium
~nx Alcal1genes stearothermoph1/us Thermctoga occultum

~enum Pseudomonas Thermoactmomyces Sulfo/obus PyrodJCllum brockll


Staphylococcus vulgans Thermoproteus Methanopyrus
llland.cum Thermus Oesulfurolobus Pyrobaculum
aquat1cus Acidianus

"9. 6.2 Rango de temperaturas que permiten el crecimiento de diversas bac-


'-rlas.
200 6. El crecimiento de los microorganismos

conocido desde antiguo de que, por ejemplo. la bacteria Escherichia co/i,


anaeróbica facultativa. cuando crece sobre un sustrato fermentable como
la glucosa, incluso en presencia de aire pasa de respirar a fermentar. pro-
duce entonces ácidos orgánicos. y se suicida.

- - - -- - - - - - - - - - -
0 ,2

5
0.4 30 20 10 10 20
f--.....~.........___,_~ ........_,
Los intervalos corresponden a 1 mm

Fig. 6.3 Distribución del oxígeno en el interior de una colonia de Escherichía


colí, y por debajo de ella, tras crecimiento sobre agar complejo. Las presiones
parciales se midieron al cabo de tres días de incubación a 30ºC mediante un micro-
electrodo de 0 2. Los valores se dan en porcentajes de la presión parcial medida en
el agar saturado de aire.

En los cultivos líquidos de mayor profundidad las bacterias aeróbicas sólo


crecen en la superficie; por debajo las condiciones se van haciendo cada
veL más anaeróbicas. Para permitir el crecimiento de microorganismos
aeróbicos también en las capas profundas de un cultivo líquido es necesa-
ria la aireación. Los microorganismos sólo pueden utilizar el oxígeno
disuelto. Mientras que las sales minerales y lo!> nutrientes orgánicos pue-
den estar en los medios de cultivo a concentraciones que permitan el cre-
cimiento bacteriano durante horas o días. la solubilidad del oxígeno es
baja. Un litro de agua que esté en equilibrio con el aire a la presión allnos-
férica a 20ºC contiene can sólo 6,2 ml o 0.28 mmol de oxígeno. Esta can-
tidad es únicamente suficiente para oxidar 0,046 mmol o 8.3 mg de glu-
cosa (aproximadamente Ja milésima parte de la glucosa que se encuentra
en un medio de cultivo normal). Por tanto, el oxígeno no puede almace-
narse en el medio líquido, sino que hay que ir proporcionándolo conti-
nuamente. Afortunadamente los microorganismos están adaptados a una
concentración muy baja de oxígeno disuelto; no obstante, no puede sobre-
pasarse una cantidad mínima, la concentración crítica de 0 2 sin perjudicar
la respiración celular.
La velocidad con la que se disuelve e l oxígeno se incrementa establecien·
do grandes superficies entre las fases gaseosas y líquidas, y elevando la
6.2 Medios de cultivo y condiciones de crecimiento 201

presión parcial de oxígeno en la fase gaseosa. La aireación de cultivos


líquidos se realiza generalmente con aire o mezclas de oxígeno, nitrógeno
y anhídrido carbónico. Se intenta por distintos medios establecer una gran
superficie de contacto entre las dos fases: l. Cultivo en capas finas. 2.
Movimiento del líquido por agitación (alternativa o circular). 3. Rotación
de frascos planos a lo largo de su eje longitudinal. 4. Burbujeo de la
columna líquida mediante aire a presión a través de difusores (placas
p0rosas, frascos de KLUYVER). 5. Pcrcolación (Fig. 6.4). 6. Agitación
mecánica. En los cultivos sumergidos de microorganismos aeróbicos se
utiliza frecuentemente la combinación de la aireación forzada con difuso-
res (placas porosas, tuberas) y agitación mecánica. El "fermentador sin
difusor" y el "sistema Waldhof' emplean la turbulencia ocasionada por
una fuerte agitación. La figura 6.5 representa algunos frascos de cultivo en
los que se procuró obtener a través de la forma una superficie máxima del
líquido, y también algunos frascos para el cultivo sumergido. Hay que
considerar que, incluso en un fermentador bien aireado o en las aguas
naturales, la distribución del oxígeno no es siempre homogénea. Ya los
mismos grumos de bacterias establecen microambientes en los que reina
una presión parcial de 0 2 reducida. Estos microambientes semianaeróbi-
cos se forman en las aguas naturales por la materia en suspensión que con-
tienen. Experimentalmente pueden simularse estas condiciones añadiendo

Flg. 6.4 Aparato de percolación para hacer fluir una


IOluclón nutritiva y aire a través de un material de
IOporte (s uelo, bola s de vidrio, etc.). Si por el tubo
8spirador (As) se extrae continua y lentamente aire, en la
entrada de aire (Lu) éste penetra y conduce la solución
nutritiva (NL) hacia la parte superior a través del tubo
ascendente (Sr); la solución nutritiva y el aire fluyen a tra-
~ del material de soporte (Tr); Gw =fibra de vidrio.
202 6. El crecimiento de los microorganismos

entrada
de aire

frasco de Kluyver frasco P capsula de Kolle fermentador

Flg. 6.5 Recipientes para el cultivo s uperficlal y sumergido de microorganis·


mos aerobios.

partículas sólidas (arcilla. celulosa. quitina) a una suspensión bacten ... na:
en este caso las bacterias crecen como un "crecimiento ma'>ivo" denso
alrededor de la superficie de las partículas y sufren igualmente una dd1-
ciencia de 0 2• Para la demostración de este efecto resultan idóneas las bac-
terias anaeróbicas facultativas. que en condiciones de deficiencia de oxí-
geno pasan a fermentar (Escherichia coli) o a respirar nitratos (Pseudo·
monas de11itrifica11s) .
Cultivo an aer óbico. Para el cultivo de bacterias anaeróbica., estricta' es
imprescindible la exclu.,ión del oxígeno del aire. La técnica anaeróbica
emplea medios de cultivo a los que se elimina el aire: hervidos. fra,cos
cerrados sin que queden burbujas, atmósfera11 sin oxígeno en desecado ·es
o frascos de Wrrr, sustancias para la absorción del oxígeno (pirogalol
alcalino, ditionito, cloruro de cobre 1), y 01ros medios auxiliares. La adi·
ción de sustancias reductoras (ácido ascórbico. tioglicolato, cisteína - si es
po'>1ble- o también sulfuro) a los caldos de cultivo pennite reducir o ch·
minar los efectos tóxicos del oxígeno del aire
Las bacterias extremamente sensibles al oxígeno pueden subculu\.af'ie
también en el aire cuando se procura, mediante una corriente continua de
nitrógeno libre de oxígeno en el frasco de cultivo, que el medio no en1n:
en contacto con el aire (técnica de H UNGATl.i). Alternativamente, puede
6.3 Tipos nutricionales 203

crabajar'e en c~binas de siembra llenadas con nitrógeno, arg~n. o hidróge-


no libres de _oxigeno. Co~o md1ca~or colore.ado de las con~1c1ones anae-
róbicas se anade resa,rnrma al medio de cultivo (en presencia de oxígeno
s 37 ul. anaeróbicamente incoloro, después de rcoxidación rojo) o bien se
:aade a los frascos de incubación anaeróbica un frasco con una disolución
de glucosa y azul de metileno (anaeróbico: incoloro).

6.3 Tipos nutricionales


(..Os conceptos de "heterótrofo" y "autótrofo" pensados para denominar
tos tipos de nutrición de animales y plantas, no son suficientes para carac-
teri1ar la variedad de tipos nutricionales que se dan en los microorganis-
mos. Para la descripción breve de los tipos nutricionales se han implanta-
do nuevos términos, que hacen referencia a la fuente de energía, al d ador
de hidrógeno y a la fuente d e carbono.
Fuentes d e energía. Con respecto al mecanismo para la transformación
de energía para obtener la forma energética bioquímicamente útil (ATP)
se dis1i nguen principalmente dos ti pos metabólicos: los organismos foto-
trofos y los quimiotrofos. Los organismos que pueden utilizar como fuen -
te energética para el crecimiento la radiación electromagnética (luz) se
deno minan " fototrofos" (fotosintéticos). Los organismos fototrofos
abarcan a los pertenecientes a dos grandes grupo-.: la-. bacterias fototro-
fas anacrób1cas. que no desprenden oxígeno, y los fototrofos aeróbicos.
cianobacterias. algas y plantas verdes, que producen oxígeno en la lu1.
"Quimiotrofo" (quimiosintético) indica la ganancia de energía por reac-
cione11 de oxidación-reducción en las que los nutrientes actúan como sus-
trato, independientemente de que la forma de energía bioquímica se
obtenga por oxidación (respiración) o por fermentación.
~ores de hidrógeno y fuentes de carbono. Todos los organismo., que
Ubh1an sustancias orgánica-. como dadores de hidrógenos se denominan
ttorganotrofos". Se utili7a este término como antónimo de " litotrofo"
~e hace referencia a la capacidad de utilizar dadores inorgánicos de
hidrógenos (H2, NH3, H2S, S, CO, Fe2• entre otros). Los términos "autó-
trofo" y "heterótrofo" han visto restringido su significado, puesto que
hacen referencia exclusivamente al origen del carbono celular: los micro-
organi-.mos son "autótr ofos" cuando son capaces de obtener la mayoría
del carbono celular por fijación del anhídrido carbónico. y " heterótrofos"
CUando extraen el carbono celular de sustancias orgámcas.
Por lo general basta con indicar el proceso básico de obtención de energía
~ et dador de hidrógenos. Las plantas verdes, cianobacterias y las bacte
nas rojas del azufre son en este sentido fotolitotrofos; las bacterias nitríft
204 6. El crecimiento de los microorganismos

cantes quimiolitotrofas, y los animales y la gran masa de microorganismos


quimiorganotrofos. En casos especiales puede incluirse el origen del car.
bono celular en la denominación.

6.4 Métodos de cultivo selectivo


El conocimiento de la diversidad de los microorganismos se debe a dos
procedimientos. Algunos m1croorgani'>mo'> han despertado nuestro inte ·é~
por la formación de colonias. agrupaciones llamativas o por modificacio.
nes en el medio. Muchos de estos microorganismos aparentes a simple
vista pueden someten.e a un aislamiento directo. Para estos organismo.,
pudieron establecerse fácilmente los medios de cultivo y las condiciones
de crecimiento que permitiesen su desarrollo. No obstante, muchos tipos
fisiológicos distintos de microorganismos pudieron investigarse sólo
cuando se desarrolló la técnica del cultivo de enriquecimiento de W1No-
GRADSKY y BEIJERINCK.

Cultivo de enriquecimiento. El método del cultivo de enriquecimiento es


en su principio y en la práctica muy sencillo. Las condiciones de enrique-
cimiento son aquellas en las que un organismo se implanta por competen-
cia. Estableciendo una serie de factores (fuentes de energía, carbono,
nitrógeno, aceptor de hidrógenos, atmósfera, luz, temperatura, pH, etc.) se
determinan unas condiciones ambientales precisas, y se siembra con una
población mixta, como la que se presenta en el suelo o los lodos. En un
caldo de enriquecimiento de este tipo se desarrolla mejor el más adaptado
y sobrecrece a todos los demá'> organismos acompañantes. Mediante
varias transferencias en el mismo caldo de cultivo y extensión en el mismo
medio solidificado puede aislar.,e fácilmente la cepa enriquecida. Una
"resiembra líquido-líquido" frecuente, después de cortos intervalos de
tiempo, impide el crecimiento de los microorganismos acompañantes, que
podrían aprovechar los producto'> de excreción, o incluso de autolisis. de
las células favorecidas primariamente. Un material de inóculo apropi..do
lo ofrecen aquellas muestras de lugares en donde ya haya tenido lugar Jn
..enriquecimiento natural": microorganismos utilizadores del monóx1do
de carbono en aguas residuales de fábricas de gas, utiliL.adores de herio-
globina en aguas residuales de mataderos y oxidadores de hidrocarbu os
en campos petrolíferos o depósito'> de petróleo.
El cultivo de enriquecimiento permite aislar microorganismos con cual-
quier combinación de requerimientos nutritivos, naturalmente con la pre-
misa de que el tipo elegido se presente en la naturaleza. Para los microo~­
ganismos muy especiali1.ados pueden establecerse condiciones de enfl·
quecimiento especialmente selectivas. Un medio mineral sin nitrógeno
combinado expuesto a la lut es muy selectivo para cianobacterias fijado-
6.4 Métodos de cultivo selectivo 205

ras de nitrógeno. _Si al mismo medio. de ~ultivo se le añade una fuente


orgánica de energ1a y carbono predominara A:.otobacter en la oscuridad y
condiciones aeróbicas, Clostridium en condiciones anaeróbicas. El éxito
de un culti~~ de enriqut~cimie~to ,ra.dica en sati~facer tan s?lo los requen-
iniento'> mm1mo'> del upo fis1olog1co que se mtenta ennquecer. Si por
ejemplo se buscan bacteri~ que oxiden metano o hidrógeno con nitrato o
sotfato como aceptor de hidrógenos, hay que procurar eliminar el oxíge-
oo: de otro modo predominarían las bacterias oxidadoras del metano o del
hidrógeno aeróbicas. La selección puede emplear también la resistencia o
la tolerancia frente a ácidos o bases, la influencia del calor o las radiac10-
pes. Frecuentemente la selección incluye también una contraselecc1ón
mediante el empleo de sustancias inhibitorias selectivas. Sobre un medio
de culuvo con aúda crecen por ejemplo en condiciones aeróbicas los lac-
tobacilos, mientras que otros microorganismos de crecimiento aeróbico
quedan reprimidos; aúda, cianuro o sulfuro de hidrógeno seleccionan con-
U'8 organ ismos aeróbicos, en cuyos procesos respiratorios están implica-
dos los citocromos. En el diagnóstico médico para la demostración de
Cory11ebacterium diphtheriae (sobre medios que contengan telurito) y de
Enterobacteriáceas patógenas (agar-bismuto) se recurre a una inhibición
selectiva. Acerca de la contraselección con penicilina para el enriqueci-
miento de mutantes auxotróficos de Escherichia coli insistiremos en la
pág. 506. Para impedir el crecimiento de bacterias Gram positivas se
aflade penicilina a los medios de cultivo. El crecimiento de hongos, leva-
duras, protozoos y otros eucariotas se impide añadiendo cicloheximida.
En el material utilizado como inóculo por el experimentador puede haber
varias cepas o variantes del mismo tipo fisiológico. que se diferencien tan
sólo. por ejemplo, en los óptimos de pH o en las velocidades de creci-
miento. Si se inocula con este material un cultivo de enriquecimiento, pre-
dominará la cepa mejor a da ptada o la de crecimiento más rápido, y el
resto de las cepas quedará sobrecrecida por ella y no podrán aislarse. Si el
lislamiento se encamina a la obtención de un gran númer o de cepas que
crezcan bajo estas condiciones selectivas hay que recumr al " método
directo en placa". Si el inóculo se siembra sobre el medio selectivo soli-
dificado, los tipos fisiológicos favorecidos se desarrollarán hasta formar
COionias. Si las colonias están suficientemente separadas no compiten por
los nutnentes; las cepas de crecimiento más lento no quedan reprimida'>
llOr las de crecimiento más rápido y pueden aislarse separadamente.
en·'ª tabla 6.4 se dan las condiciones selectivas de crecimiento para una
~e representativa de tipos fisiológicos. El cuadro reúne los datos al con
liderar el enriquecimiento de cada uno de los tipos fisiológicos.
Cultivo puro. Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de
llna sola célula. La función principal del microbiólogo es la obtención de
206 6. El crecimiento de los microorganismos

Tab. 6.4 Condiciones de enriquecimiento de algunas bacterias seleccionadas.


Microorganismos fototróficos (principal fuente de C: C02)

Rodospiriláceas
o H2 }
:e ácidos fotOM;m;ladoo }
e
Q)
orgán. ).>800 nm
N
dador de H Cromatiáceas
.2 "'
e: SH2
dador de H A>715nm Clorobiáceas
e:
Q) "' SH2
o Algas verdes
:e CINH. o KNQ3 como fuente N
e
Q) N2 como fuente N Cianobacterias
"'
Bacterias quimiolitotrofas (autótrofas) (principal fuente de C: C02)

Nitrosomonas
Nitrobacter
Bacterias del H2
Thiobacillus
Thiobacillus ferrooxidans

Thiobacillus denitrificans
Paracoccus denitrificans
Metanogénicas

Bacterias quimioorganotrofas (heterótrofas)


KN03 2% + ác. orgán. Pseudomonas } desnitri-
e: KN0 3 10% + exir. lev: esporulados ficantes
J: 8 Sulfato + ác. orgán. Desu/fovibrio
Q)
"O
o o glutamato, histidina C. tetanomorphum
o E
:O
Q)
lactato+ exir. lev. Veillonella
Q; X almidón + NH• Clostridium
e:' Q)
" ~ almidón+ N2 C. pasteurianum
"' a.
o e:
·¡¡; Enterobacter y
glucosa + NH.·
Q)
o organismos fermentadores
"' glucosa+ 1% extr. lev.; pH 5 bacterias del ácido láctico
bacterias del ácido propiónico
lactato+ 1% exir. lev.

lactato+ NH.· } Pseudomonas f/uorescens


benzoato + NH.·
manitol, benzoato + N2 Azotobacter
·º.ee almidón + NH•
4% etanol+ 1% exir. lev.; pH 6,0
Bacillus polymyxa y otros
Acetobacter, Gluconobacter
~ 5% urea + 1% exir. lev. Sporosarcina ureae
petróleo+ NH,· Mycobacterium, Nocardia
celulosa + NH.· Sporocytophaga

• lnóculo pasteurizado extr. lev. = extracto de levadura


6.4 Métodos de cultivo selectivo 207
cultivo puro, demostrar su pureza sin lugar a dudas y mantener el cultivo
puro libre de contaminación. El aislamiento del cultivo puro tiene lugar,
con alguna excepción, sobre o en medios sólidos. Se inicia por Ja separa-
ción de una sola célula a partir de una población y requiere también que la
colonia que surja de esta célula se mantenga separada de otras células o
colonias. Las bacterias aeróbicas se aíslan según el método de vertido en
placa de KocH, o más sencillamente por siembra en estría con el asa de
platino sobre medios con agar (Fig. 6.6). Las bacterias anaeróbicas se sus-
penden en agar calentado a una temperatura de 45ºC y se incuban en
ausencia de aire (Fig. 6.7). Con la separación cuidadosa de una colonia,
pasterior suspensión en un líquido y nueva siembra por estría o dilución en
agar pueden conseguirse cultivos puros de la mayoría de microorganismos.
El aislamiento de un cultivo puro puede hacerse también en medios líqui-
dos, siempre que el organismo predomine en el material de partida. Por
una dilución en serie de la suspensión en el caldo de cultivo se consigue
que en la última dilución se encuentre tan sólo una célula; el clon repre-
senta al cultivo puro.

Flg. 6.6 Siembra por agotamiento


para conseguir un cultivo puro de una
bacteria aeróbica. Con ayuda de un
asa de platino se sembró una suspen-
sión bacteriana sobre la superiicie del
agar. Las estrías sucesivas iban per-
diendo densidad celular. Las colonias
aisladas situadas al final proceden muy
probablemente de una sola bacteria. La
colonia aislada situada en la parte supe-
rior de la imagen es un contaminante
(Fotografía de B. LEHMANN).

Cultivo mixto. Las poblaciones naturales están compuestas por lo gene-


!'3-1 de una mezcla de distintos mi~roorganismos. Entre ellos se establecen
lllterrelaciones de distinto tipo. Estas se basan en la competencia por el
sustrato común como comensalismo o mutualismo (véase pág. 593 y sig.).
Para el estudio de las interrelaciones de este tipo, y otras, se hace cada vez
lllás uso de los cultivos discontinuos. Tanto en los cu]tjvos estáticos como
Continuos pueden establecerse condiciones definidas, y pueden determi-
narse sucesiones de distintos organismos y acumulaciones de productos
lr_letabólicos. A partir de aquí pueden extraerse conclusiones de relaciones
81nergísticas o antagónicas entre Jos organismos. Los cultivos mixtos pue-
208 6. El crecimiento de los microorganismos

Flg. 6.7 Banco de dilución de una bacteria purpúrea del azufre en agar blan.
do (0,8%) tras Incubar durante siete dlas con luz. la imagen demuestra el aisla-
miento de un cultivo puro de bacterias anaeróbicas por el método de d1luc16n El agar
se cubrió con una capa formada por parafina y paraf1nol a fin de evitar la entrada de
oxigeno atmosfénco (Fotografía de B. lEHMANN).

den obtenerse también por unión de culti vos puros. Las investigaciones de
cultivos mixtos definidos conducen al conocimiento de las relaciones
complejas que se dan entre lo., microorganismo s en el hábitat natural
En la economía doméstica y en la industria no .,e utilizan exclm,ivamente
cultivos puros, sino también cultivos mixtos, algunos de los cuales se
denominan también "cultivos puros naturales". Ejemplos de ellos son la
levadura, el kefir, el hongo de té, etc. También en la purificación de aguas
rc.,iduales tienen un papel importante los cultivo<; mixtos, especialmente
en la degradación de xenobiótico\ en las aguas residuales indu\triales.

6.5 Fisiología del crecimiento


Se entiende por crecimiento el incremento de materia viva, y por lo gene-
ral, el incremento en el número de células y de la masa celular. La tasa de
crectmiento es una medida de la modificación del número de células ':l de
la masa celular en una unidad de tiempo. En los microorganismos unicelu-
lares el crecimiento consiste en un incremento en el número de células. La
célula bacteriana se multiplica por división binaria. Inicialmente la cél~la
duplica su tamaño. A continuación se divide en dos células hijas, que ne-
nen el mismo tamaño que la célula madre. El mtervalo de uempo para la
duplicación del número de células se denomina tiempo de generación El
tiempo necesario para Ja duplicación de la masa celular se denomina uern-
po de duplicación. Si consideramos que el número de células y la masa
celular se duplican a lo largo de un mismo lapso de tiempo, e l tiempo de
6.5 Fisiología del crecimiento 209
------
generación (g) e\ igual al tiempo de duplicacmn (tJ). El valor recíproco. 1/g
se Jenomina tasa de crecimiento (v): sus dimensione!> son h 1.

e.S.1 Métodos de determinació n del número


de células y de la masa bacteriana
6J1tre el incremento en el número de células y de la masa no tiene que haber
una relación fiJa durante el crecimiento de una población bacteriana en un
culti\ O discontmuo o por carga\. como es por ejemplo una -,u-,pcnsión de
¡,actenas en un matraz de Erlenmeyer. Tras la moculación en el medio de
cultirn algunas hacterias se d1v1den má'> r.ípidamente que el incremento en
ta masa; las célula'> son inicialmente más pequeñas. En una e posterior ra. .
del crecimiento, la tasa de incremento de la masa puede sobrepasar a la del
número de células. En la con.,idcración de las fases del crccim1ento, en las
que el incremento del número de células y de la masa son en cierto modo
iguales, no es necesario diferenciar entre ambas magnitude\. Se habla enton-
ces de '"célula'> estándar'" o de "crecimiento balanceado"'. En este caso. en
lugar del número de célula\ puede detenninar:-.e también la masa celular, o
alguna dimensión proporcional, como la extinción(= absorción= densidad
óptica). La ma ... a celular referida a una unidad de volumen (litro o mililitro)
IC denomina también densidad celular o den.,idad bacteriana (g/I: g/ml).

Determinación del número d e bacterias. En una población bacteriana no


lodas las célula\ son viables. Se consideran célula\ vivas a aquella\ que son
capaces de fonnar colonia-. !.obre medios con agar, o de formar suspensio-
nes en caldos líquidos. Las células viables se establecen mediante los méto-
dos para determinar el número de células viahle\. En el número total de
~lula-. se incluyen todas Ja-, célula'> que pueden \ersc o demo\trar\e de otro
modo. esto es, se incluyen tamhién las células muertas > la-, lesionadas.
Número rora( de céfufm. 1. El método más extendido para la detenrnnación del
número total de células se basa en el contaje al microscopio de las células extendi-
da., en una capa delgada en una camara de contaje (p ej. ~egún N1L11.\ll R. THO\I ·\
O Pt l ROFF-H \l 'Sf R). Si el grosor de la capa es de 0.()2 mm y el área cuadrangular
tiene un lado de 0.05 mm (volumen 5 · 1O" cml) el número de la\ i.:dulas que allí
le encuentran ha) que muhiphcarlo por 2 x 10' para obtener el número de eélu
llstmJ. 2. El contaje relativo frente a cifras conocidas. p. ej. los eritrociios de la san-
1!'1: !aprox. 5 x 10" eritrocitos/mi) es uno de los métodos más antiguo,. 3. Un con
lklor electrónico. "'Col LTER-counter"'. '>Upone una '>igmficaliva simplificación: se
~en la pérdida de conducti\idad de la disolución de un electrólito i.:uando pasa
~ célula bacteriana a tra\'és de un orificio e\trecho. 4. Para número' de células
fcriores a 1<Y' i.:élulavml puede utili1an.e un mctodo de filtros de membrana. El
'lua de mar. de un lago o de bebida se fillra a tran:-. de un filtro de membrana. este
tltimo se seca, se tirie. se hace transparente y se cucnlu al micrm.copio.
210 6. El crecimiento de los microorganismo s
~~~~~~~~~~~~~~
~-
~~~~~~

Numero de célula.f vwbles. Generalmente se cuentan las células viables qu, e


condiciones favorables de crecimiento llegan a desarrollar colonias. Según e~
método de vertido en placas de Koc11 se toma una parte alícuota de una suspe0 .,¡6
celular homogénea diluida apropiadamente y se me1cla con agar nutritivo líq Jidn
(40-45"C). para verterlo en placas de Petri. La su ... pcnsión puede tamh1cn exten~
dcrse sobre la superficie de agar de una placa de Petri con el asa de DRIGALSKY; la.s
células también pueden depositar...c por filtración sobre un filtro (Gottinger
Membranfilter) que luego se sitúa 1,obre agar nutntivo o sobre discos de Cartón
impregnados de medio. En todos los casos se cuentan las colonias después de la
incubación. La u11h1ación del método de KOCH de vertido en placa y Jo., método~
dcnvados, se hmuan al contaje de células de la misma especie a partir de suspen.
sioncs homogéneas y no deben trasladarse al contajc de individuos de especies di~.
tintas en poblaciones mixtas.

Determinación d e la masa bacteriana. La elección del método para la


determinación de la masa bacteriana depende de para qué se tome como
referencia a la masa bacteriana. Para la determinación de rendimientos ~
indica frecuentemente la masa húmeda o seca. Para actividades metabóli-
cas o enzimática-. se utiliza el contenido proteico o en nitrógeno. Frecuen-
temente la elección de un método apropiado se efectúa bajo el punto de
vista de la sencille1. y la rápide1 del método. Después del correspondiente
calibrado acostumbran a preferirse en los procesos de rutina los método~
indirectos frente a los directos.
Méwdos directo.\ . 1. La masa húmeda se determina mediante centrifugación de la~
células. Después de la centrifugación de las células lavadas puede determinarse la
masa seca. Ambos métodos están someLidos a errores sistemáticos considerables.
2. Significativamente más exactos son el contenido total de nitrógeno (método
m1cro-KJELDAHL y microdifusión del amonio) y el conLenido total en carbono
(según YAK SL Yll.E-rOLCH). 3. De forma rutinaria se determina frecuentemente la
proteína bacteriana. Modificaciones del método de B1uret y otras reacciones colo-
readas determinables colorimétricament e dan buenos resultados. Los microméto-
dos '>e basan en la medida de componentes representativos de las proteínas (tirosi-
na. Lriptófano; según LowRY o Fo1 tl\-CtOCALTEU).

Métodos indirecto.f. 1. Los métodos ba,ados en la determinación de la turbidez son


úules para establecer la masa celular. En los trabajos rutinarios se mide la densi·
dad de una suspensión por su extinción (turbidimetría). En alguna., ocasiones la
nefclometría es más precisa. La dependencia lineal entre los valores medidos Yla
ma'>a bacteriana sólo se da en ambos métodos cuando <,e trabaja en la 1ona de mu)
baja densidad celular. Como la dispersión de la lu1 depende del diámetro, la fonns
y el índice de refracción de las partículas dispersantes, también de los componen·
tes internos de la célula, las relaciones entre los valores ópticos y otras magni ude>
más directas (masu seca. contenido en nitrógeno o en carbono) hay que establecer·
1
las de nuevo para cada caso. 2. Magnitudes metabólicas que dependan dircct. •
6.5 Fisiología del crecimiento 211

inente del crec1m1ento (captación de 0 2, producción de C02 o ácido) pueden dar


11113 medida adecuada
de la masa de microorgamsmos. Su medida está indicada en
,quellos casos en que fracasan los otros métodos, p. ej. cuando las densidades celu-
laft' son muy bajas. Para la medida pueden utili1arse métodos de titulación, mano-
aPétricos y electroquímicos entre otros

e.5.2 Crecimiento exponencial y tiempo de generación


(.as bacterias se multiplican por división binaria; su multiplicación se
corresponde, por lo tanto, con una progresión geométrica 2º ~ 2• ~ 22~
2' ... ~ 2". El número de células aumenta con un factor determinado cada
unidad de tiempo. Se habla de cr ecimiento exponencial. Si la unidad de
volumen de un cultivo discontinuo en crecimiento contiene N11 células, el
número de c~ lulas N al cabo de n divisiones es No· 2". Pasando a los loga-
ritmos se obttene log N = logNo + n · log 2 y para el número de divisiones
celulares
log N- log No
n• log 2

Para el número de divisiones celulares por hora, también llamada tasa de


división u, '>e obtiene
n log N - log No
•• - = --='----=--
, log 2 · (t - to)

El tiempo necesario para un ciclo de división es el tiempo de generación

··-=- t
n
1
u

Si una suspensión de células se multiplica en 1O horas de 1O' hasta 1Q'I


'1Elulas, la tasa de división es
log 109 - log 103 6
• - - =2
0,3010 . 10 3

el tiempo de generación es de media hora.

t
!i
se representa e l número de células de una población en crecimiento
~nen~ial _en ordenad~s y el tiempo en absci'>as. ambas magnitudes en
ala antmet1ca, se obtiene una curva exponencial (Fig. 6.8). No obstan-
esta reprcscntaci?n ~trnéttca no resulta apropiada para expresar un
~e~o grande de dtv1stones celulares, porque según qué escala se esco-
un1camente serán reconocibles las primeras divisiones o las últimas.
212 6. El crecimiento de los microorganismos

10 3 CllldmielllO 8llp(Jl• lc:ill 1000


N, •N.·ll'

.. 9
8 "'
.!!
nlPI~
l8mllogBrftmlcl

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o ~
"g. "
;z
~ 3
-' 250
2

o o o
o 2 4 6 T-enho<as 10

Fig. 6.8 Crecimiento exponencial de los organismos unicelulares. Repre-


sentación aritmética (negro) y semilogarítmica (ro¡o) del número de células en tun.
c1ón del tiempo.

Por ello se prefiere la reprei.entación semi logarítmica (Fig. 6.8), en la cual


se coloca en ordenadas el logaritmo del número de células. En este ti po de
representación el crecimiento exponencial se reconoce por una rect.. La
pendiente de esta recta corresponde a la tasa de duplicación; es t. nto
mayor cuanto más pendiente sea la recta. Como el crecimiento expo en-
cial se caracteriza por una relación lineal entre el tiempo y el logantmo del
número de células, se habla también de crecimiento logarítmico.
En relación con la cinética del crecimiento se considera a la población
bacteriana como un sistema autocatalítico multiplicativo. En los calcu-
los se toma como base la densidad bacteriana .\ o alguna magnitud oro·
porcional a ella (número de células, absorción ). La velocidad de moJifi·
cación de la densidad bactenana es entonces en cada momento proporcio-
nal >-.igue una cinética de una reacción de primer orden. Durante el ere·
cimiento exponencial es entonces la tasa de crecimiento
dx
µx
di

en la queµ es la tasa de crec11niento. Por integración se obtiene


X=X.,· e•
>para una duplicación de la masa celular
2 Xo xo · e" "'· De aquí resulta
2 ... ª ""' o bien
6.5 Fisiología del crecimiento 213
~~~------------~

ri 2 ,,. µ . t.. o bien


In 2 0,693
.. --¡:- =--Id-
La tasa de crecimiento µ está relacionada por tanto con el recíproco del
úelflPº de duplicación, o tiempo de generación, la tasa de crecimiento u
1 µ
". -¡;- = 0,693
f..,OS dos parámetros µ y u hacen referencia al mismo proceso de crec1-
lllÍento de una población bacteriana que se multiplica exponencialmente.

1.5.3 Crecimiento bacteriano en cultivo discontinuo


Si se inoculan bacterias en un medio de cultivo líquido, crecerán por lo
general hasta que un factor llegue al mínimo y el crecimiento se vea lim1
lado. Si durante este proce!>o no se adiciona ningún nutriente ni se elimi-
na ningún producto metabólico se denomina a eMe crecimiento en este
espacio predeterminado como cultivo discontinuo. El crecimiento en un
'"sistema cerrado" de este tipo está sometido a leyes que son válidas para
los organismos uni- y pluricelulares. Un cultivo d iscontinuo se comporta
como un organismo pluricelular con un crecimiento genético limitado.
El crecimiento de un culti\.O bacteriano se ve claramente en la representación
Pfica. cuando se expresan los logaritmo-. del número de célula'> \iables
hnte al tiempo. Una curva de crecimiento típica (Fig. 6.9) tiene un a<,pccto
ligmoidal y permite diferenciar varias fases de crecimiento que se presen-

.... demualtlt

Tiempo

Curva de crecimiento de un cultivo bacteriano.


214 6. El crecimiento de los microorganismos

tan regulannente de una forma más o menos acusada: fase de latencia (o lag)
fase exponencial (logarítmica), fase estacionaria y fase de muerte. '
El crecimiento sobre medios de cultivo sólidos es semejante, aunque las
densidades celulares alcanzadas son muy superiores.
Fase de la tencia. La fase de latencia abarca el lapso de tiempo entre la
inoculación y el momento en que se alcanza la tasa de divisió? máxima.
La duración de la fase de latencia depende sobre todo del cultivo previo
de ta edad del inóculo, así como de lo apropiado que sea el medio de cut:
tivo. Si el inóculo procede de un cultivo previo viejo (fase estacionaria de
crecimiento) ta célula tiene que adaptarse primero a las nuevas condicio-
nes de crecímiento mediante la síntesis de RNA, ribosomas y enzimas. Si
las fuentes de energía y de carbono del nuevo caldo de cultivo ~e.diferen­
cian de las del cultivo previo, la adaptación a las nuevas cond1c1ones va
ligada frecuentemente a una nueva síntesis de enzimas que no eran nece-
sarios en el cultivo previo y que no habrán sido sintetizados. La formación
de los nuevos enzimas está inducida por el nuevo sustrato.

70

60 b
a e
.~ 50 d
.g. 40
al
~ 30
.,,
e:
o 20

10

o 2 3 4 5 60 o o 2 3 4 Horas

Fig . 6.10 Crecimiento bifásico (diauxia) de Escherichia c oli en soluciones


nutritivas con una relación determinada de glucosa y sorbitol. Con una mezcla
de glucosa y fructosa se consigue una curva de crecimiento típica (a), pero. con mez·
clas de glucosa y sorbitol en proporciones 1:3 (b), 1:1 (c) y 3:1 (d) se obtienen cur·
vas de crecimiento bifásico (diauxia). (Según MoNoo, J.: Recherches sur la crois·
sanee de cultures bactériennes, Hermann, París 1958.)

Un ejemplo demostrativo del efecto de los sustratos en la formación de


enzimas lo ofrece el fenómeno de la llan1ada diau xia (Fig. 6.10). La apa·
rición de este crecimiento bifásico o de un doble ciclo de crecimiento tiene
lugar en soluciones nutritivas en las que se encuen.tran mezclas ~e nut~e~~
tes. Por ejemplo, de una mezcla de gl~cosa y sorb1~ol Eschenchia col~ u~
liza primero la glucosa. La glucosa mduce en pnmer lugar los enz1m 5
necesarios para su utilización y reprime simultáneamente la síntesis de tos
6.5 Fisiología del crecimiento 215

zirnas necesarios para la utilización del sorbitol. Éstos no se producen


~:sta que se ha consumido la glucosa. Mediante estos procesos de regula-
ción pueden explicarse suficientemente las dos fases de latencia.
Las modificaciones en la composición cuantitativa de las células bacteria-
nas durante la fase de latencia se reflejan sobre todo en el contenido en
áeido ribonucleico: el contenido en RNA aumenta de 8 a 12 veces. Este
incremento en el RNA indica la participación del RNA y los ribosomas en
Ja síntesis proteica y enzimática.
fase exponencia l. La fase de crecimiento exponencial (logarítmico; fase
exp. o fase log) se caracteriza por un tiempo de generación constante y
mínimo. El tiempo de generación durante la fase log es un parámetro espe-
cífico de cada especie bacteriana y dependiente del medio. Las
Enterobacteriáceas se dividen cada 15-30 min, Escherichia coli a 37°C
aproximadamente cada 20 min. En otras bacterias el tiempo de generación
es considerablemente superior, y para muchas bacterias del suelo es de 60-
150 min, en Nitrosomonas y Nitrobacter incluso 5-10 horas.
En muchas bacterias el tamaño celular y el contenido en proteínas de la
célula es constante durante la fase log; el cultivo está compuesto hasta
cierto punto por "células estándar". Si este comportamiento está clara-
mente demostrado y el número de células, proteína y masa seca aumenta
con las mismas tasas, entonces puede seguirse el crecimiento midiendo
una de estas magnitudes. Pero en muchos casos en un cultivo discontinuo
las células se modifican durante el crecimiento exponencial, ya que el
ambiente también se modifica continuamente, desciende la concentración
de sustrato, aumenta la densidad celular y se acumulan productos metabó-
licos. Debido a la relativa constancia del tiempo de generación durante la
fase log, ésta resulta idónea para la detenninación de la tasa de crecimien-
to. Para el estudio de la influencia de factores ambientales (pH, potencial
redox, temperatura, aireación o semejantes) así como la capacidad de uti-
lizar diversos sustratos se sigue el incremento del número de células, o
bien de la turbidez (extinción) durante el crecimiento exponencial.
Fase estacionaria. La fase estacionaria se instaura cuando las células ya
no crecen. La tasa de crecimiento es dependiente de la concentración de
sustrato; como consecuencia, al disminuir la concentración de sustrato ya
&parece una disminución de la tasa de crecimiento antes de su total con-
sumo. La transición de la fase exponencial a la estacionaria tiene lugar por
tanto paulatinamente. Además de la disminución de sustrato, la densidad
de población, la presión parcial de 0 2 baja y la acumulación de productos
lnetabólicos tóxicos pueden hacer disminuir la tasa de crecimiento e intro-
ducir la fase estacionaria. En la fase estacionaria pueden utilizarse aún
ltlateriales de reserva, descomponerse parte de los ribosomas y sintetizar-
le enlimas. Los procesos aislados dependen del factor que limite el crecí-
216 6. El crecimiento de los microorganismos

miento. Sólo las células muy sensibles mueren rápidamente. Siempre que
pueda obtenerse energía necesaria por respiración de materiales de reser.
va o proteínas las bacterias permanecen largo tiempo vivas.
En muchos procesos microbianos de producción conducentes a la formación
de un metabolito secundario (p. ej. penicilina) la fase estacionaria es la ver.
<ladera fase de producción. Por ello. en biotecnología se diferencia una tro.
fofase (fase de nutrición o creeinúento) y una idiofase (fase de producción).
A pesar de que las células no creLcan durante la idiofase, si se añaden sus.
tratos, éstos aún son aprovechados y se incorporan precursores al producto.
La masa bacteriana alcanzada en la fase estacionaria se denomina rendi.
miento o producción. Depende del tipo y cantidad de los nutrientes aña.
didos y de las condiciones de cultivo.
Fase de muerte. La fase de muerte y las causas de la muerte de las célu.
las bacterianas en soluciones nutritivas normales se han estudiado aún
poco. Relativamente claras son las condiciones cuando se acumulan áci-
dos (Escherichia, Lac1obacill11s). El número de células viables puel:le des-
cender exponencialmente. En según qué circunstancias las células pueden
lisarse por acción de los propios enzimas (autolisis).

6
!:::.

~
i::¡ log X
,,,i1!
~
.3
~
~X.
j . . logx.-logXo
pendiente= log B • (1 • l.) = µ

1
"'
~
log Xo

.§' lo

~
~
~
~ Fig. 6.11 Parámetros del crecí·
~
..,,. = _ In x.- In Xo
4
JI
miento: rendimiento, ta sa de
crecimiento y período de laten·
.3 cia.
6.5 Fisiología del crecimiento 217

54
6.. Parámetros de la curva de crecimiento
Si se ~igue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multi-
plicación de la masa (masa seca) interesarán en primer lugar tres paráme-
iros que caracterizan al crecimiento: la producción, la tasa de crecimiento
y el período de latencia (Fig. 6. 11 ).
producción. La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial
y ta máxima: X = Xm... - Xu. Se da en gramos de masa seca. De especial
jJnportancia es la relación de la producción con respecto al consumo de sus-
trato (X/S). Si las dos magnitudes se expresan en unidades de peso, al co-
ciente se le denomina coeficiente de rendimiento o rendimiento del creci-
fJliento (growth yicld) Y. Frecuentemente se refiere la producción a la can-
tidad de sustrato y se calcula el coeficiente de rendimiento molar Y01 (g de
células/mol de sustrato). Este coeficiente de rendimiento molar permite rela-
cionar la producción con Ja cantidad de ATP que puede obtenerse a partir de
la fuente energética (sustrato). Se llega así al coeficiente de rendimiento
energético (g de células/mol ATP). Puede calcularse cuando se conoce Ja vía
de degradación de un sustrato y la ganancia energética que así se consigue.
Para cultivos anaeróbicos de Escherichia coli y K/ebsiella ¡meu111011iae con
tasas de crecimiento limitadas por la adición de glucosa. se midieron valo-
res de YATP de 12.4 y 14 g masa celular/mol equivalente de ATP. Para las
bacterias anaeróbicas que obtienen la energía por fermentación el Y,, 1p es
un valor bastante constante. Si para una nueva bacteria se obtiene un valor
significativamente superior. hay que considerar que existen "ingresos even-
tuales", esto es, la presencia de vías metabólicas energéticas accesorias. Los
valores de YuP se han calculado también para células en crecimiento aeró-
bico. Dependen de las condiciones de crecimiento y de las necesarias capa-
cidades de síntesis; así por ejemplo, de si a las células se les proporciona
como fuente de N iones amonio, iones nitrato o nitrógeno molecular.
Tasa de crecimiento exponencial. La tasa de crecimieto exponencial es
una medida de la velocidad del crecimiento celular en la fase exponencial
del crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas x0 y x1 en
los tiempos to y t, según
== log x, - log Xo In x, - In x0
11
log e · (1- lo) (1 - lo)

donde log e =0.43429. El tiempo de duplicación es td = In 2


i.l

'tiempo de latencia. El tiempo de latencia es un parámetro muy impor-


lantc en la consideración de las características de una bacteria o de lo apro-
218 6. El crecimiento de los microorganismos

piado que pueda ser un medio de cultivo. El tiempo de latencia T1 l et -


intervalo de tiempo entre el tiempo 1,, en el que el cultivo ha alcan1ado una
determinada densidad .x,, y el tiempo t,, en el que se hubiese alcan1adq la
misma densidad, caso de que hubiese crecido exponencialmente desde el
momento de la inoculación (los índices son 1 para fase lag, r para creci-
miento real e i para crecimiento ideal).

In x.- In x.,
To=L-t=t,- - - - -
µ

Como el parámetro T1 únicamente es útil cuando se comparan dos cultivos


con tasas de crecimiento idénticas, se recomienda dar el tiempo de laten-
cia en tiempo fisiológico (tiempo de generación g) y no en valores ahso-
lutos. La diferencia entre el tiempo observado real y el crecimiento ideal
=
expresada en múltiplos del tiempo de generación es L Tri•. Por tanto, el
valor de L indica cuánta'> multiplicaciones de retraso lleva un cultivo real
frente a otro ideal, que de<.,de un principio hubiese crecido exponent1al-
mente. Los valores de L son la forma de expresar normalmente los re ul-
tados de la influencia sobre el crecimiento de diversas sustancias nutri ti-
vas, inhibidores o condiciones del medio.

6.5.5 Crecimiento bacteriano en cultivo continuo


En un cultivo discontinuo se modifican continuamente las condic1l 1e'
de cultivo; la densidad bacteriana aumenta y la concentración de SUl>tra-
to disminuye. Sin embargo, para muchas investigaciones fisiológicas
parece deseable mantener las células lapsos largos de tiempo con una
misma concentración de sustrato y con unas condiciones ambientales
también constantes, dejándolas crecer exponencialmente. Mediante una
rápida y repetida transferencia de las células a un nuevo caldo de cult vo
se pudo llegar a condiciones aproximadamente de este tipo. El obJCt 'º
se alcan1a por una . ., ía más sencilla si a una población bacteriana en ue-
cimiento se le añade continuamente medio nuevo y se va eliminando ~us­
pensión bacteriana en la misma magnitud. La base de este procedimien-
to es el cultivo continuo, tal como se realiza en el quimiostato o en el tu r-
bidostato.
Crecinúento en el quimiostato. El quimiostato (Fig. 6.12) está ccm·
puesto por un recipiente de cultivo al que afluye un flujo constante de
medio de cultivo de un recipiente de reserva. Por aireación y agitac 111
mecánica se consigue en el recipiente de cultivo un sumini:-tro óptimo Je
oxígeno y una distribución homogénea lo mfü, rápida posible de lo~
nutrientes contenidos en el medio que va entrando. En la misma mcd1Ja
6.5 Fisiología del crecimiento 219

cllPóS''º de mediO bomba perlstáttlca quimoostato o


rec:ipoente receptor
o

Flg. 6.12 Principio del cultivo continuo en un qulmlostato.

que entra medio de cultivo en el recipiente de cultivo, va saliendo sus-


pensión bacteriana.
Si el volumen del recipiente de cultivo es V (litros) y el medio de cultivo
=
fluye con un flujo f (l/h), la tasa de dilución es D fN. D indica por
tanto, el cambio de volumen o renovación por hora. Si en el momento de
poner en marcha el quimiostato las bacterias que se encuentran en el reci-
piente de cultivo (x [gil]) no creciesen, se irían eliminando del recipiente
según una tasa de lavado

D ·x=-~
di
La densidad bacteriana en el cultivo iría disminuyendo exponencialmente
según .x =x0 . e-Dt
El crecimiento de las bacterias en el recipiente de cultivo tiene lugar igual-
lllentc de forma exponencial. La tasa de incremento viene dada por la
cxpre<.ión µ.x = dxldt, y la densidad bacteriana aumenta exponencialmen-
te según .X= .Xo . el''.
la tasa de modificación de la densidad bactenana d.x/dt en el recipiente de
CUitivo viene dada por las dos velocidades citadas d.x/dt µ.x - D.x. =
Si la tasa de crecimiento µ y la tasa de dilución D son iguales, la pérdida
J>or lavado se iguala al crecimiento bacteriano, esto es, la modificación es
220 6. El crecimiento de los microorganismos
~~~~~~~~~~~~
~~

t --µ_:-------------------- ·----·-=--
-- -
g""

1
!
µ..
2

~
Fig. 6.13 Dependencia de
la tasa de crecimiento 11
con respecto a la concen-
tración de sustrato c..

nula, y la densidad bacteriana x se mantiene constante. Bajo estas condi-


c iones el cultivo se encuentra en un "equilibrio dinámico": la multipli-
cación exponencial de la-. células e-.tá compensada por un proceso expo-
nencial negativo.

El cultivo en el quimiostato está controlado por el sustrato. La estabilidad


del sistema se basa en e\ta limitación de la tasa de crecimiento por la e• .n-
centración de uno de los sustratos 11nprescindibles para el crecimiento
(dador de 1-1; fuente de N, So P). Si a través de la limitación por sustrato
se consigue que la tasa de crecimiento real µ sea menor que la tasa de cre-
cimiento máxima alcan7able con e l \U'itrato saturante. µ.,,.,, entonces la
tasa de dilución puede \Jriar<;e en un amplio margen sin que las bacterias
resulten lavadas. De todos modos, la tasa de dilución D no puede sobre-
pasar a µ"'~'·
La dependencia de la ta ...a de crecimiento µ con respecto a la concentra·
ción del su<,trato e sigue una curva de saturación (hg. 6.13 ). Por lo gene·
ral las bacterias crecen ya a peque11a-. concentraciones del su\trato (p. CJ
10 mg glucosa/I en el medio) con una tasa máxima. Tan sólo a concentra·
ciones de su\trato inferiores µ es dependiente de la concentración. K es
entonces la concentración para la cual la tasa de crecimiento tiene un valor
\emimáximo (µ =µ ,....J2). K es junto aµ .,.. un parámetro fundamental del
crecimiento de las bacterias en el químiostato.
En la figura 6.14 se representa la densidad bacteriana, la concentración de
sustrato, el tiempo de duplicación y la producción bacteriana frente a Ja
tasa de dilución D. Si '>C varía la ta\a de dilución [) entre cero y el pur to
de lavado D.. la densidad bacteriana -,e modifica muy poco dentro de un
margen amplio. En esta 1ona las bacterias reaccionan frente a un incre-
mento de D di-,minuyendo su tiempo de duplicación. La tasa de dilucí6n
6.5 Fisiología del crecimiento 221

A B C
1
5 ~nal
\
. r--·-·
7
10

4 6 8

3
~~ 5
6
\ 4
\
2

'' ...... ___ / .


3
2
4

~- -
concenlrKión del 8U8lrato
o ~------..-=-.;;..--·---.&.,.-----l. o o
o 0.5 1,0 J. J
o
Flg. 6.14 Relaciones entre la densidad celular, la concentración del sustrato,
el tiempo de duplicaclón y el rendimiento en equilibrio dinámico para distintas
..... de dilución Den un qulmlostato. Estos valores han sido calculados para una
bacieria de parámetros µ ..... = 1 .O horas, Y =0,5 y K. =0,2 gil y una concentración
del sustrato en el medio de cultivo circulante de s, = 10 gil Ordenadas: A rendi-
miento Dx (g/Vhora), B tiempo de duplicación t.. (horas); e concentración del sustra-
to en el recipiente estudiado c. (gil). Abscisas: tasa de dilución D (horas); Dmtasa de
cltución para el rendimiento máximo; O, salida de las células (segun HERBERT, O , R.
Et.SWORTH, R. c. TELLING'. J. gen. M1crobiol. 14 [1956] 601 ) .

creciente, y por tanto el flujo creciente y la tasa de crecimiento disminui-


da, se reflejan sin embargo en un incremento en las bacterias. El número
alcan1a un máximo en D,., por encima de D,.. desciende rápidamente.
La concentración de sustrato en el recipiente de cultirn. y por tanto en la
suspensión que sale de él es prácticamente cero a tasas de dilución bajas en
un amplio margen. Sólo cuando la lasa de dilución se acerca a la tasa de
crecimiento máxima se lava conjuntamente parte del sustrato: por último,
la concentración de '>U'>trato alcan1a en la salida a la del medio que entra.
la estabilidad del equilibrio dinámico en el quimiostato se basa en la limi-
tación de la tasa de crecimiento por un sustrato. La tasa de crecimiento µ
se mantiene a nivel bajo. El quimiostato puede manejarse fácilmente como
lln s1\tema autorregulado ; si se establece a lo largo de bastante tiempo una
\'elocidad de flujo constante, el sistema llega a regular...e por sí solo.
C~ecimiento en el lurbidostalo. Frente al cultivo continuo en el qui-
11'110..,tato ~e encuentra el del turbidostato. Tal como indica su nombre, el
funcionamiento '>e basa en el mantenimiento de una detem1111ada dem.ídad
bacteriana o turb1dc1. Un turbídímetro regula a través de una váh ula el
flujo de medio de cultivo. En el recipiente de cultivo están todos los
nutrientes en exceso, y las bacterias crecen a una tasa próxima a la máxi
222 6. El crecimiento de los microorganismos

ma. El funcionamiento del turbidostato es técnicamente más complejo que


el del quimiostato.
Difer encias b ásicas. Entre el cultivo discontinuo clásico y el continuo t n
el quimioc,tato exí<,ten unas d1fcrenc1as básicas, que debemos finalmente
recalcar una vez más.
El cultivo d iscontinuo hay que verlo como un sistema cerrado (en cieno
modo como un organismo pluncelular). que en su desarrollo cumple con
una fase de latencia, una fase exponencial, una fase estacionaria y una fase
de muerte (juventud. madurel. veje¿ y muerte). En cada momento rei nan
condiciones de cultivo distintas. Es casi imposible una automatización en
un cultivo discontinuo.
El cultivo continuo representa un sistema abierto, que tiende hacia un
"equilibrio dinámico". El factor tiempo está excluido hasta cierto punto.
Para los organismos reinan siempre las mismas condiciones ambientales.
El aparato puede automatilarse fácilmente.

6.5.6 Sincronización de la división celular


Para estudiar los sucesos metabólicos durante el ciclo de división de las
bacterias se necesitan suspensiones de células que se dividan al mismo
tiempo, que sean sincrónica<,. fata igualdad de fases en diversas células se
alcan7a mediante la sincroni7ación. La sincronización se consigue
mediante varios métodos, entre ellos por modificación de la temperatura,
estímulos luminosos, limitación de nutrientes o por filtración de las célu-
las de igual tamaño. Una suspensión celular sincronizada por un trata-
miento previo se vuelve asincrónica al cabo de pocas divisiones en la
misma fase, y el número de células ya no aumenta escalonadamente, sino
de una forma continua.

6.6 Inhibición del crecimiento y destrucción


Mediante una serie de sustancia., químicas puede hacerse más lento el c.re-
cimiento de los microorganismos o impedirse totalmente. Si el crecim1cn·
to se detiene por acción de una sustancia y se reinicia una vez eliminada.
se trata de un b acteriostá tico y de una acción bacteriostática. Los agen·
tes bactericidas conducen a la destrucción de las células. Ambas acc10·
nes dependen de la concentración. Es notable que precisamente entre tas
bacterias existan tipos que pueden tolerar o incluso utilizar como fuente
energética, venenos generales de las células y del metabolismo (sulfuro de
hidrógeno, fenol, monóxido de carbono). Para un gran número de agentes
- 6.6 Inhibición del crecimiento y destrucción

anti rmcrobianos se conoce en cierta medida el punto de acción en la célu-


la. ª"' como el mecanismo de actuación.
223

J.,eSiones d e l~ capas superficiales d e la célula o est r~ctura. A eleva-


da" concentraciones (70%) el etanol provoca la coagulación de las proteí-
na" y actúa como bactericida. Fenoles, cresoles, jabones neutro-, y agentes
de acción -,upcrfic1al (detergentes) atacan a las capas celulares externas y
lesionan la '>emipermeabilidad de la membrana citoplasmática. Las mem-
branas están compuestas predominantemente por lípidos y proteínas orde-
nado.., en capas. Los detergentes tienen una constitución polar con grupos
lipÓtilos (hidrocarburos largos o anillos aro~áticos) .Y gru.pos hidrófilos
ionizado-.. Se acumulan en las membranas lipoprote1ca'>, igualmente de
estructura polar, y las hacen no funcionales. Debido a su amplia acción
bactericida los detergentes se utilizan en general como medios de desm-
fC'ción para superficies y ropas. Algunos antibióticos polipeptídicos tie-
nen una acción semejante a la de los detergentes (p. ej. polimixina, colb-
tina. bacitracina, subtilina), lo mismo que algunas sustancias vegetales
antim1crobianas.
Lesiones de enzimas y m eta bolism o básico. Algunos metales pesados
(p. ej. cobre, plata, mercurio, entre otros) actúan como venenos de en1i-
mas ya a pequeñas concentraciones ("acción oligodinámica"). Tanto en
fom1a de sales (HgCh, CuCI, NO,Ag) como en forma de compuestos
orgánicos (4-hidroximercuriobenzoato) fijan los grupos SH de los en1i
ma., y modifican profundamente la estructura terciaria y cuaternaria de las
proteína'>. También se bloquea el grupo funcional mcrcapto del coen7ima
A. El cianuro es un veneno de la respiración y bloquea por unión del hie-
rro la función del enLima terminal de la respiración, la citocromo-o.,ida-
Ja. El monóxido de carbono inhibe la respiración por competencia con el
oxígeno libre a ni\'el de la citocromo-oxidasa. actúa por tanto por "inhibi-
ción compc1111va·'. La antimicina A inhibe el transporte de electronc'> en la
cadena re'>p1ratona bloqueando a la citocromo-c-reductasa. El 2.4-dinitro-
fenol desacopla la fosforilación de la cadena respiratoria en las mitocon-
dria-.. El arseniato inhibe la fosforilación a nivel de su-,trato. El fluoraceta-
to bloquea el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, siendo activado primero
igual que el acetato y siendo incorporado aJ citrato (síntesi-, letal). inhi-
biendo entonces. sin embargo, a la aconitasa en forma de fluorocitrato. y
en consecuencia a las transformaciones posteriores del citrato.
Inhibición competitiva. Como ejemplo modelo de la inhibición competi-
tiva citaremos aquí la inhibición de la tran!>formación del succinato a
fumarato a través del malonato. La acción es extraordinariamente especí
fica y tiene lugar ya a bajas concentraciones de malonato. Mientras que la
Inhi bición por cianuro (en determinadas concentraciones) no puede evi
tan.e incrementando la concentración del sustrato, esto es, la presión par-
224 6. El crecimiento de los microorganismos

cial de oxígeno, la inhibición por malonato puede invertirse total o Par.


cialmcnle incrementando la concentración de succinato. Piénsese q ue el
melabolito normal succinato compite con el a n álogo estructura l o anti.
m etabolito malonato por el centro catalítico del en¿ima, la succinato-des.
flidrogena.rn. La~ inhibiciones competitivas se basan en la semejanza
estructural del inhibidor y de la sustancia normal. La asimilación de un
antimetabolito en la célula se puede manifestar sobre todo de distintos
modos en la biosíntesis (véase también apartado 16.3). En el sig uiente
esquema se representan tres metabolitos (negro) y tres antimetabolito,
(rojo).

H2N ,-:NH H2N, .....:NH


' e;;- e;/
l 1
NH NH
1 1
COOH COOH SOz- NH2 CH2 o
1

99
1 1
CH2 COOH CH2 fH2
1 1 1
CH2 CH2 CH2 CH2
1 1 1 1
COOH COOH NH2 NH2 H2N- CH - COOH H2N-CH-COOH

succinato malonato 4-amino· sullanilam1da arg1rnna canavanina


benzoato

Impedimento en la síntesis de componentes celulares. El ejemplo más


conocido de una inhibición del crecimiento por la incorporación de un
análogo estructural en un componente celular lo ofrece la acción de los
derivados del ácido sulfanílico. La acción antibacteriana de las sul fona-
midas se encontró de forma empírica (DOMt\GK): posteriormente se reco-
noció en su scmejanLa estructural con el 4-amino-beiuoato (véase antes)
la clave para comprender el mecanismo de acción. El 4-amino-benwato
es un componente de un coenzima, el tetrahidrofolato. La mayoría de las
bacteria:-. Jo sintetiLan a partir de componentes sencillos. Pero el 4-amino-
benzoato añadido al medio de cultivo, lo mismo que la sulfanilamida, se
incorporan fácilmente a la célula y pasan a formar parte del folato: lo;,
últimos conducen, sin embargo, a la síntesis de un coenzima no funcio-
nal. y así en último término a la detención del crecimiento. La acción
de la sulfonamida puede contrarrestarse por concentraciones crecientes de
4-amino-bcnLoato: la base de la inhibición es un m ecanis mo competiti-
vo. Los organismos animales no son capaces de sintetizar folato de mn'.º
ni a partir de sus constituyentes y loman el coen.lima completo con los alt-
mentos. Por tanto, no puede incorporar sulfonamida en el coenLima Y.n~)
resulta lesionado. La toxicidad selectiva de las sulfonamidas y la posib1lt-
dad de utilizarlas como quimiotcrapéuticos se debe a la elevada capaci<l•1d
de síntesis de las bacterias y a la limitada capacidad de síntesis de los orga-
nismos animales.
6.6 Inhibición del crecimiento y destrucción 225
LB inhibición ~e l_a .rnccinato-desl'.idrogenasa_ ~or el mal~1~ato y la inhi-
bición del crcc1m1ento por los derivados del ac1do sulfantl1co son ejem-
tos <le relaciones antagónicas entre los metabolitos normales de la célu-
fa y las moléculas estructuralmente relacionadas. El a ntagonis m o entre
el 111ctabolito y el antimetabolito (análogo estructural) puede manifestar-
se a distintos niveles. Los análogos estructurales pueden impedir la incor-
ración del metabolilo normal y así evitar la síntesis <le componentes
~tu lares: pueden también incorporarse a polímeros y tener como conse-
cuencia la disminución o pérdida de la actividad de un enzima o de un
ácido nucleico.
Inhibición de la síntesis p r oteica po r a ntibióticos. La síntesis proteica
resulta inhibida en los procariotas específicamente por varios antibióticos.
El punto de intervención es la función del ribosoma 70S. La estreptomici-
na y la ncomicina impiden el proceso de unión de los aminoácidos. La eri-
uumicina iníluye en la función de la subunidad 50S. Las tetraciclinas inhi-
ben el anclaje del aminoacil-RNAl a los ribosomas. El cloranfenicol impi-
de la incorporación de aminoácidos a proteínas, aparentemente inhibien-
do el enlace <le los aminoácidos mediante la pep1idil-tra11.1ferasa. El clo-
ranfe nicol se utiliza en la quimioterapia como un bacteriostático de eleva-
da ac tividad, y en la investigación bioquímica como un inhibidor selecti-
vo de la síntesis proteica sin influir sobre otras actividades metabólicas.
Los antibióticos citados actúan naturalmente también sobre los ribosomas
de las mitocondrias y los cloroplastos de lo~ eucariotas. Pero ya que la
membrana externa de las mitocondrias, por ejemplo, es muy poco permea-
ble a la estreptomicina, ésta no tiene pnícticamcnte ningún efecto sobre los
eucariotas a las bajas concentraciones en las que se utilin contra los pro-
cariotas. La división de los orgánulos se impide sólo cuando se utiliLan
concentraciones 1000 veces superiores. Si se deja actuar a la estreptomi-
cina a elevadas concentraciones sobre eucmfotas (levaduras, Euglena,
puntos vegetativos de plantas superiores) se van lavando las milocondrias
Ylos cloroplastos a lo largo del crecimiento, y aparecen células y tejidos
con un número significativamente reducido de orgánulos.
Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos po r a ntibió ticos. Igual-
lllente. la síntesis ele ácidos nucleicos se ve inhibida por varios antibióti-
eos. La mitomicina C impide selectivamente la síntesis de DNA, sin
llltluir en principio en la síntesis de RNA y de proteínas. La acción se debe
• una unión y formación de puentes en el DNA de doble cadena y a rotu-
ras en las cadenas. La actinomicina D forma complejos con el DNA de
do_ble cadena fijándose a la guanina; impide la síntesis de los tres tipos de
~idos ribonucleico~, pero no la replicación del DNA. La rifampicina
lctúa sobre la RNA -po/imerasa DNA dependiente e impide así la síntesis
• RNAm en bacterias.
226 6. El crecimiento de los microorganismos

Inhibición de la síntesis de la pared celular. La inhibición de la síntes¡


del glucopéptido en procariotas por Ja penicilina, cefalosporina y otro~
agentes que actúan a nivel de pared celular se consideró ya anteriorment~
(pág. 54 y sig.).
La muerte y destrucción de microorganismos. Por muerte celular se
entiende entre los microorganismos a la pérdida irreversible de la capaci.
dad de crecer y multiplicarse, o -refiriéndonos a la práctica experimenta]_
a la pérdida de la "capacidad de formar colonias". Muchas lesiones celu-
lares que conducen a la muerte celular son reparables y pueden superarse
bajo determinadas condiciones. Son bien conocidas las reactivaciones
después del efecto de las radiaciones UV o del calor (pág. 502 a 509).
Pueden establecerse datos cuantitativos acerca de la muerte o destrucción
en los microorganismos únicamente considerando las poblaciones, pero
no para células aisladas. En algunos casos la tasa de disminución del
número de células viables es en cada momento proporcional al número de
células vivas presentes; la muerte sigue una cinética de una reacción de
primer orden: N = No · e-~· (k = tasa de muerte exponencial). Éste es, por
ejemplo, el caso de la esterilización por radiaciones.

6.6.1 Métodos de esterilización


La destrucción de microorganismos es la base de los métodos de trabajo
microbiológicos y de la conservación de los alimentos; requiere por tanto
una discusión. Se denomina esterilización a la liberación de un material
de microorganismos vivos o en estado latente. Tenemos que distinguir
tanto la pasteurización como la conservación. Si un medio estéril o en el
que se cultiva otro germen presenta microorganismos que se han introdu·
cido de forma involuntaria se habla de contaminación. Los términos
desinfección (eliminación de todos los microorganismos patógenos),
asepsia, antisepsia e infección son más utilizados en higiene que en
Microbiología.
Los microorganismos presentan un distinto grado de sensibilidad a les
medios que se han establecido para eliminarlos. Hay diferencias de una
especie a otra, dependencias del contenido en agua y del pH del medio.
de la edad de las células o de las esporas, etc. Las tasas exponenciales de
muerte y de destrucción dependen además de la especie de diversas con·
diciones ambientales. En lugar de esas tasas se expresa el éxito obtenid?
en la destrucción de una población detenninada en condiciones deternu·
nadas con el valor D, esto es, el tiempo necesario para destruir el 90% de
las células, llamado también "tiempo de reducción decimal" (Dio) (vease
la tabla 6.5).
6.6 Inhibición del crecimiento y destrucción 227

_,. 6.5 Valores de Dio (tiempo de reducción decimal) de suspensiones de


1
_.poras en tres especies bacterianas formadoras de esporas.

Tiempo de reducción decimal expresado en segundos a


105ºC 120ºC 130ºC 140ºC 150ºC 160ºC
fJBCÍl/US cereus 12,1 4,2 2,6 1,3 1,0 0,7
fJBCi/IUS subtílís 27,8 4,5 3,1 2,1 1,1 0,5

8 . stearothermophílus 2857,0 38,6 8,8 3,9 2,4 1,4

según MILLER, l., o. KANDLER: Milchwiss. 22 (1967) 686; modificado.

Puede esterilizarse o pasteurizarse por medio de calor húmedo, de calor


seco, filtrando, irradiando o con medios químicos.
Calor. h úmedo. Las células vegetativas de las bacterias y hongos ya son
destr01das a temperaturas de alrededor de 60ºC (5-1 O minutos), las espo-
ras de las le~aduras y d~ los hongo; sólo por encima de 80ºC y las esporas
de las bactenas por encima de 120 C ( 15 minutos). El tiempo que se nece-
~ta que ac~úe el calor húm~do para destruir las esporas de algunas espe-
ctes bactenanas representativas, extraordinariamente resistentes al calor
puede calcularse a partir de los tiempos de reducción decimal dados en I~
~la 6.:.
Obsérvese que cuanto mayor es el grado de contaminación, p.
CJ. el numero de esporas terrnorresistentes, hay que calentar durante más
tiempo.
P~~ alcanzar temperaturas superiores al punto de ebullición del agua se
~liza ~I autoclav.e. La t~mperatura del vapor liberado depende de la pre-
S1ón.~F1g. 6.15): S1 todav1a hay aire, la temperatura que corresponde a una
pres1on determinada es considerablemente inferior. Debido a que la des-

2,94 3,0
, .,, bar
bar at

o 0,()061
1.96 &. 2,0 20 0.0235
30 O,CM27
~

,.
40 0.0742
80 0,4796
0,98
~ 1•
110
1,9111
1,4419
~ 1,0
1.-a
130 2,7190

Temperatura
"9. 6.15 Presión de vapor del agua a saturación.
228 6. El crecimiento de los microorganismos
-
Tab. 6.6 Tiempo de esterlllzaclón con autoclave de los líquidos contenidos ell
distintos recipientes (121-123ºC).

Rec1p1entes Volumen Tiempo de exposic--;r¡-


en minutos
Tubo de ensayo 20 mi 12·14
Erlenmeyer SO mi 12·14
Erlenmeyer 200ml 12·15
Erlenmeyer 1000ml 20-25
Erlenmeyer 2000 mi 30.35
Botella 9000 mi 50-55

trucción por medio de calor húmedo depende de la temperatura y no cte la


presión, tiene que procurar-,e eliminar el aire antes de cerrar el autoclave.
El aire puede ser eliminado dejándolo fluir o bien haciendo el vacío Por
lo general tendría que medirse la temperatura y no la presión en el intLnor
del autoclave; no obstante continúa midiéndose esta última debido a la
facilidad que presenta y a motivos de seguridad. La duración de la esteri-
lización depende naturalmente del tamaño (capacidad calorífica) del apa-
rato que tenga que esterili7arse o del volumen; puede verse en la tabla 6.6.
A menudo se obtiene el mismo éxito de esteri lización mediante esterili-
zación fraccionada con vapor fluyente a 1OOº C (tindalización). Para ello
se calientan las soluciones 30 minutos a 1OOº C tres días seguidos conser-
vándolas entre tanto a temperatura de cultivo para que germinen las espo·
ras y poder destruir lm. células vegetativas en el siguiente calentamiento.
Para muchos fines es '>Uficiente una ester ilización parcial, esto es, la Je,.
trucción de las formas vegetativas de los microorganismos. Esta estwli-
?ación parcial se efectúa por lo general por pasteurización. calentando a
75 C o a 80 C durante 5- 10 minutos. La leche también se esteriliL de
forma parcial pasteuri1ándola; c;e uttli1an no obstante ) a fin de no perju·
d1car el gusto de la leche. tiempos má'> cortos. Están en uso dos métcJo'
de pa<,teuri1ac1ón: el calentamiento breve (20 segundos a 71.5-74 C ) \ el
calentamiento a alta temperatura (2-5 segundos a 85-87ºC). La lechL 'e
esterilita también por calentamiento a temperaturas muy altas (l HT.
··Ultra H1gh Temperature"). Se inyecta en la leche vapor de agua supe ·cJ·
lentado. con lo que la leche alcan1a una temperatura de 135-150 C. que
sólo se mantiene durante 1 2 '>egundo'>. Finalmente se deja que Ja leche 'e
expanda en una tobera y '>e enfría simultáneamente, con lo que se eli1 inJ
el agua que se había anadido al inyectar el vapor.
Los procesos de conservación de frutas pueden ser también considerado•
como una esteri li1ación parcial ("poner en conserva"). Cuando los frasc0 '
de las conservas se calientan como es habitual a 80º C durante 20 minuto'
sólo se deMruyen las células vegetativas y muchas esporas de hongos.
6.6 Inhibición del crecimiento y destrucción 229

:n¡entra.., que las e<,poras de la'> bacterias continúan '>iendo viable'>. El valor
bajo del pH debido a los ácidos de los frutos impide la germmación de
¡as c,por~., de la' bact~ria'>. Afortunadamente no existe n.inguna e'pora
aerrnorrc'>l '>te~te bac~en?na cap:v de desarrol_lar'>e a pH mferior a 4.5.
fru'º' poco ac1dos ijud1a'>, guisantes. zanahonas. setas. entre otro'>) pue-
den con.,crvar'>e también por ~a~teuri~~ción si se .añaden 1 o 2 c~charada-.
de vinagre para alcan1ar la ac1d1ficac1on necesana. Una e1Ccepc1ón: '>Obre
freSll' pa,teun1ada' aparece frecuentemente el "hongo de las fre'ª"..
IJYswchlamn 111rea. Sus ascósporas resisten bien los 86ºC; a e\ta tcmpe·
rallJra el f) o e' de 14 min.
(alor seco S1 se someten a calor seco las espora.-. de la'> bactenas 'ólo '>On
destruida'> a temperaturas más altas y con tiempos de acción má'> prolon-
gado' que '>I '>e las somete a calor húmedo. Por eso el material de vidrio,
loS polvo<. y aceites insensibles al calor son esterilizados manteniéndolos
dos hortl\ en un horno con calor seco a 160º C. En el caso de materiales de
alta capacidad calorífica o con propiedades de aislamiento térmico tiene
que considerarse el tiempo de calentamiento. No obstante, en todos los
casos se recomienda un control de temperatura (por medio de indicadores)
o un control de esterilidad. Si el material lo permite, actualmente se calien-
tan 30 minutos a l 80º C. La experiencia demuestra que así se eliminan
IOdas las esporas. La destrucción por el calor se debe a la coagulación de
las proteína'> celulares.
Jlltración . La'> soluciones con sustancias termolábiles (vitamina'>, algunm
1111inoácidos, a1úcares, otros sustratos) se esterili1an por filtración. debido
a la comodidad que pre'>enta este mecanismo. Ya en el laboratorio de PAS-
'IEUR se util11aban cilindros de porcelana no vidriados (filtros de C11AM-
IER1.A~D). En el laboratorio. ) para la esterilización del agua de bebida se
llili1an lihro' de tierra de diatomeas prensadas. No menos adecuado., '>On
los filtro'> de fibra de -.idrio o de membrana. Los filtros de membrana de
litrocelulo<,a (Sartorius o Millipore) se presentan con di~tt ntos diámetro.,
de poro. lo., filtro'> desechables pueden adaptarse a jeringuilla<, y se utilt-
lan actualmente de forma rutinaria para la esteriliLación de disoluciones
flllC no <,Oportan la esterilización por calor. Con ayuda de filtros de mem-
11rana pueden mcluso separarse organismos de distinta forma o tamaño.
(a., part1cula., \Íricas no son retenidas por los filtros. Debemos indicar
11rnbién. que al hervir o en el autoclave incluso azúcares como glucosa y
hcto\a pueden interconvertirse o desdoblarse. Cuando la glucosa es má'>
estable es a pi 1entre 3 y 5 al estar disuelta en agua y puede eMerililar'>e en
el autoclave. Pero '>i la glucosa se hierve a pH 8 durante 30 min, el 40"t
<Pc!>o/peso) se transforma en fructosa. Las sales metálicas (Fe, Mn, Mo.
fietc.) aceleran la transformación. Como la fructosa se tran~forma en ácido'>
1'6rnico., en estas condiciones, los caldos de cultivo esterili1ados de este
o adquieren frecuentemente una coloración parda o negra.
230 6. El crecimiento de los microorganismos

Irradiación . De las rad1ac1ones utiliLadas para efectuar e~terihLacione~


totales o parciales (radiación ultravioleta, rayos X. rayos gamma) es la
radiación UV la que tiene mayor interés para _su uso en _el _laboratorio. La
radiación de la mayoría de lámparas UV es nea en rad1ac1ones de long¡.
tud de onda próxima a 260 nm, radiación absorbida preferentemente l'Or
los ácidos nucleicos y que si actúa durante un tiempo prolongado pro\ Oca
la destrucción de todas las bacterias. La radiación UV es adecuada Pata
esteriliLar parcialmente habitaciones ya que destruye con gran rap1de¿ a
las bacterias aunque con una lentitud muy superior a las esporas de hon.
gos cuya sensibilídad a la radiación es notablemente inferior (apartado
15.1.4; Fig. 15.3). Las radiaciones ionizantes son utilizadas para esterili-
zar los alimentos y otros materiales compactos.
Radiaciones ionizantes. Los rayos X, las radiaciones de alta energía y I~
gamma, p. ej. del 60Co, deben su actuación a la formación de radicales
hidroxilo (OH-) que lesionan a macromoléculas. Para matar las célula 'Oll
suficientes dosis de radiación (dosis de energía) extremadamente bajas.
Ello es comprensible, porque de la macromolécula de DNA sólo CHste
una copia en la célula, mientras que de proteínas y polisacáridos hay
muchos representantes. Una "diana" en el DNA conduce a la muerte celu-
lar sin que se puedan demostrar modificaciones en otras moléculas. Las
radiaciones ionizantes pueden utilizarse por ello para esterilizar alimentos
y otros materiales compactos.
Medios químicos. Para la esterilización de alimentos. de fánnacos v de
aparatos así como en la práctica de laboratorio se ha acreditado el mido
de etileno (oxirano). Destruye tanto las células vegetativas como las espo-
ras, si bien sólo actúa en presencia de agua (con un contenido de agua del
5-15% ). Se utiliza en forma gaseosa mezclado con nitrógeno o con anhí-
drido carbónico (2-50% de óxido de etileno).

l3-prop1olactona dietil pirocarbonato óxido etilénico

A fin de proteger las sustancias termolábiles de las soluciones nutritivas


se ha introducido la esteriliLación con 6-propiolactona (propano-3-ól do).
Es mucho más activa que el óxido de etileno. si bien puede presentar una
acción carcinogénica <,ecundaria considerable así como otras accione~
füiológicas. Se añade en un 0.2% al medio ya preparado que <,e incubaª
conlinuación a 37º C durante 2 horas. Si se deja toda la noche el medio con
prop1olactona ésta queda totalmente destruida. Los hidratos de carbono no
son atacados. Las bebidas también pueden esterilizarse con dietildicarbO-
nato (0,003-0,02% ).
6.6 Inhibición del crecimiento y destrucción 231
~~~~~~~~

par.t esterilizar ext~rnamente las semillas que -.e han de utili?ar para
obtener plantas esténles resultan adecuados agentes microbicidas como el
jeiJo hromh~drico ~1 % ). e_I sublimado alcohólico (HgCb 1%), AgN0 1
(0.05'1-). el h1poclonto ~á.ic1co ( 1% Ch)_ y otro!., dejándolos actuar de 5 a
3o rninutos.
Anles de ut1lt1.ar estos medros ha de humedecerse completa-
inente la superficie de las semillas lo que se consigue por tratamiento con
J'bones y otros agentes emulsionantes.
p¡r.1 la limp1eLa y desinfección de r ecipientes de \idrio basta normal-
inente el lavado con agua caliente y detergentes. entre ellos el SOS (do<le-
cilsulfato sódico) o cualquier detergente casero.

&.6.2 Procesos de conservación


Los productos orgánicos e'>tán sometidos a la degradación por microorga-
nismos si no se evita la multipltcación y acción de lo<, microorganismos
con dc temlinados medios ) condiciones. Para mantener o conser\.ar los
productos orgánicos son adecuadas distintas medidas. Los procesos de
conservación que sirven para proteger los alimentos tienen una importan-
cia máxima. De los problemas relacionados con esto se ocupa la Micro-
biolo~ía d e los alimentos.

Los alimentos no sólo se estropean, no pudiendo ser utilizados por el hom-


bre. al ser destruidos o degradados por los microorganismos (putrefacción
1erób1ca o anaeróbica). sino también cuando son atacados por bacterias y
bongos que produzcan toxinas. Los productores más importantes de toxi-
nas en los alimentos son C/mtridium bo111/i11u111 y algunas especies de
Staphylococcus. El primero produce una exotoxina altamente tóxica
mcluso en cantidades insignificantes, que actúa sobre el sistema nervioso,
una ncurotoxina. Los estafilococos producen una enterotoxina, responsa-
'!lede la "mtoxicación por alimentos" y que actúa sobre todo en el mtes-
lino. Algunos hongos producen micotoxinas, de la'> que la más conocida
es la aílaloxina (producida por Aspergillus jlavus).
Los procesos de conser vación que evitan la descomposición microbiana
de los alimentos utilizan distintos métodos. Pueden utilizarse procesos
químico., o físicos.

Proch<>s füicos. Anterionncntc ya 'e ha hablado de la e'ileriJización por el calo r.


La., "lat.i' cJe conserva". por ejemplo. se someten a autoclave en Ja mayoría cJe
ca.~º'· Lo\ zumo' de fru1as ácido\ también pueden con<,ena"e aunque sólo \e Je,
..ya somctH.lo a pal>leuri1aci<Sn y \ólo se hayan de\tniicJo la\ célula<, vcgc1a11va\
~icn<lo aun germinar la\ C\poras; las cndóspora-. bacteriana~ no pueden gcrm1
llar en medio ácido.
232 6. El crecimiento de los microorganismos

Se uti liL.a una esterilización por liltra ción con filtros de capas y de celuloi.a de
poro fino para esteri li7ar los 7umos de frutas, el agua mineral y los productos tera.
péuticos. La fermentación del vino se interrumpe en el momento deseado por cc 11•
trifugación y filtración de modo que se conserve un "resto de dullor"'.

El antiguo y extendido proceso de desecar los alimentos se basa en el hecho de que


los microorganismos necesitan para su crecimiento un contenio en agua deternii.
nado (por lo general más de un 10% de agua). Los copos de avena. la fruta pasa. el
heno seco y los granos de los silos deben su conservabi lidad al estado seco en que
se encuentran y en seguida se echan a perder por la acción de hongos y de bacte.
rias cuando toman agua de l aire húmedo.

La posibilidad de irradia r los alimentos se halla muy limitada. La radiación ultra.


violeta se utiliza sobre todo para esterililar habitaciones en lecherías, depósitos fri-
goríficos, panaderías y en otras industrias. La conservación de los alimentos por
medio de radiaciones ionizantes resulta teóricamente posible por la alta penetra-
ción de esa radiación. pero aún no se uti liza de forma general. Resulta comprensi-
ble que las bajas dosis necesarias para matar a los microorgani mos no provoquen
ningún cambio perceptible en el material a esteri li zar. Un proceso seguro } tam-
bién cada ve¿ más utililado en la economía doméstica consiste en almacenar to.,
alimentos a bajas tem1>eraturas. Los congeladores y depósitos frigoríficos con-
servan los productos congelados a temperaturas inferiores a - 20ºC. El manten i-
miento de los alimentos a esas temperaturas provoca una disminución notabk de
la viabi lidad de los microorganismos o bien la destrucción de las toxinas: no obs-
tante el crecimiento queda totalmente impedido. Incluso las bacterias psicrófila'
son incapaces de vivir a temperaturas inferiores a los - 12ºC.

Procesos químicos. La conservación por acidificación se basa en el hecho de que


tan sólo unos pocos microorganbmos i.on capaces de crecer a pH bajo en ausencia
de aire. Para destruirlos basta una pasteuri;ración: las esporas termorresistente-. no
germinan a pH inferior a 4.0. Se utiliza la conservación por acidificación natural
en relac ión con la fermentación láctica para preparar la col ácida ("sauerkrauf">.
los pepinillos ácidos, los embutidos. etc. En muchos casos se añade ácido acético.
ácido láctico, ácido tartárico o ácido cítrico. Los alimentos acidificados pero no
pasteurizados pueden ser destruidos por las levaduras y hongos cuando entra aire.

La carne y los pescados pueden conservarse por ahumado. Este proceso co1Nstc
en disminuir el contenido de agua y en in troducir en el producto ahu mado swaan·
cias de acción antimicrobiana: tc noles, cresolcs, aldehídos, ácido acético. ác ido fór-
mico. En la salazón se introducen los alimentos en soluciones de sal común: c'>te
tratamiento provoca una pérdida de agua e inhibe el crecimiento de los microorga-
nismos putrcfactore.-; sólo unas pocas bacterias halófilas llegan a multiplicarse.

Las concentraciones al tas de azúcar (alrededor de un 50% de sacarosa) inhiben d


crecimiento. La conservación de las mermeladas y de los jarabes se basa en prum:r
tém1ino en el contenido en ácidos y en uúcares.
6.6 Inhibición del crecimiento y destrucción 233

para la con_sc;vación de una serie de alimentos ha sido ~ecesaria la ad ición de pro-


c1uctos qunmcos conser vantes. Hasta hace poco el vmo se conservaba gracias a
la adición de ácido sulfuroso; hoy en día el vino y los zumos de frutas se con ..er-
van añadi endo, si es imprescindible, dieti ldicarbonato.

rambi én se añaden para la conservación de los alimentos ácido sórbico. ácido


¡,eo¡oico o ácido fórmico. Los cítricos se tratan superficialmente con difenil y con
o-fcnilfenolato. Finalmente también se intenta limitar e l crecimiento de microbios
aplicando antibióticos.