C.S.de Técnico de Laboratorio.

Microbiología Clínica: Técnicas de siembra

TÉCNICAS DE SIEMBRA Y RECUENTO DE BACTERIAS

1. TÉCNICAS DE SIEMBRA:
1.-INTRODUCCIÓN.2.- MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIÓN.3.-PREPARACIÓN DE INÓCULOS.4.-TÉCNICAS DE SIEMBRA.5.- NORMAS GENERALES: 2. RECUENTO DE BACTERIAS

1 TÉCNICAS DE SIEMBRA:
1.-INTRODUCCIÓN.Para la identificación de una especie bacteriana es preciso estudiarla en un cultivo puro y para ello es necesario aislarla. El aislamiento consiste en obtener bacterias de un solo tipo, de tal forma que en su estudio no se produzcan errores, llegando a un diagnóstico falso al haber varias especies bacterianas mezcladas. Normalmente las infecciones bacterianas están ocasionadas por un solo tipo de microorganismos y es muy raro que intervengan dos o más especies, lo cual no significa que no haya otro tipo de bacterias acompañantes en la infección, ya que esta ocasiona unos cambios fisicoquímicos que facilitan la proliferación de dichas bacterias acompañantes (oportunistas). Hay que tener en cuenta los posibles microorganismos que se pueden añadir durante la manipulación en el laboratorio, por ejemplo la presencia de Staphylococcus aureus. El aislamiento es la separación de un determinado microorganismo de las poblaciones mixtas existentes en la naturaleza, hasta conseguir una sola o los descendientes de esta única bacteria. A esta bacteria separada se denomina “unidad formadora de colonias” Para realizar el aislamiento y contaje de bacterias es preciso depositarlas en un medio de cultivo apropiado, a este procedimiento se llama siembra o inoculación. El método más usual es la siembra por estrías en placa, utilizando el asa de siembra, mediante la cual y a partir de una pequeña cantidad de muestra se separan e inmovilizan las células bacterianas sobre un medio nutritivo sólido. Después de un tiempo y temperatura de incubación adecuados cada célula viable origina una colonia bacteriana que es visible macroscópicamente y a partir de la cual es posible obtener un cultivo puro. Cada colonia tiene unas características determinadas en cuanto a su forma, borde, elevación, tamaño, consistencia, etc.

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Un inóculo es una cantidad suficiente y representativa de microorganismo problema. 2. Se debe de partir por un lado: a) de un cultivo puro y b) de una concentración adecuada de microorganismo problema.Se usan para siembras en medios sólidos y semisólidos en picadura . 4. 4.C. se aislará por estría en placa o por agotamiento.Si se añade en un medio de cultivo sólido. la más usada tiene un calibre de 0. Es desechable 5. Se realiza con asa de siembra. Pipetas. de esta forma. se extenderá con el asa y se incubará. Si se adiciona a un medio de cultivo líquido se homogenizará y se incubará .-PREPARACIÓN DE INÓCULOS. una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como cultivo puro. de manera que si bien aparecen colonias confluentes o una masa continua de microorganismos... Asa de siembra.. b) Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta Pasteur. a) SIEMBRA DEL INÓCULO EN MEDIO LÍQUIDO.MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIÓN. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra Es muy importante realizar el mayor número de estrías para diluir la muestra.MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS a) Si la muestra es sólida o semisólida se tomará con asa estéril.1. que no es suficiente.-Es utilizada para la inoculación o siembra por estrías en medio sólido y para siembras en medios líquidos. en las estrías finales deberán aparecer colonias perfectamente separadas unas de otras. 3. 2. Hisopos. Hilos. Si se adiciona a un medio líquido se homogeneizará por agitación y si se adiciona a un medio de cultivo sólido se utilizarán diferentes técnicas de siembra y se incubará en ambos casos. será necesario preparar un inóculo con el fin de obtener una cantidad microbiana suficiente y representativa para obtener resultados fiables.Se utilizan para la toma de muestra y extender dicha muestra en el medio de cultivo.-TÉCNICAS DE SIEMBRA Siembra o inoculación es el paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo ya sea líquido o sólido. b) Si el problema está en la cantidad de microorganismo.de Técnico de Laboratorio. 2 . Se utiliza para extenderle inóculo líquido previamente adicionado a la placa con una pipeta pasteur. 3.Pueden ser de vidrio o de plástico. Los inóculos se preparan en medios líquidos y el nº de microorganismos se cuentan por comparación con la escala de Mc-Farland.. se carga ésta con muestra sólida o líquida y añadiéndose al medio liquido y agitando el asa dentro del mismo.S.01mililitros.-Son asas de vidrio en forma de triangulo más o menos abierto. a) Si la muestra no es pura. 4. Asas de Digrasky. Resiembra es el paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro. A veces al principio es necesario partir de un inóculo con un número aproximado de microorganismos.

manteniéndola vertical en el mechero bunsen. Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. 1. aunque la homogeneización en este caso es más difícil. 5 Con la placa invertida sobre su tapa. se adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0. Esta técnica es utilizada. levantarnos el fondo y sostenerlo sobre la mano durante la inoculación. 3. c) Siembra por agotamiento o aislamiento en estrías. para la determinación del CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos. Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 mililitros de medio a una temperatura de 45 a 50 0C) en tubo. La mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra  Si se realiza con pipeta se toma un volumen de muestra problema y se vierte al medio de cultivo líquido agitándose hasta su homogeneización. b) SIEMBRA DEL INÓCULO EN MEDIO SÓLIDO.S.de Técnico de Laboratorio.-Volver a poner el tapón en el tubo tras el flameado de la boca. 4.4 y se homogeneiza la muestra en el tubo mediante el vibrador. y hacer unas estrías en superficie sin apretar excesivamente sobre el medio con movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no 3 . 1.-Si la muestra se encuentra en el tubo de ensayo.C. utilizando el dedo meñique de la mano derecha quitar el tapón metálico o el algodón de! tubo que contiene la muestra y flamear la boca de éste.-Siembra del inóculo en placa a) Técnica de Barry.-Flamear toda la longitud del asa de siembra hasta la incandescencia.-Tomar con el asa una delgada película de la muestra.Consiste en adicionar al medio sólido un inóculo que pueda oscilar entre 0. Siembra previa al vertido del medio en la placa. b) Siembra de muestra líquida en placa con asa de Digrasky. 2. Una vez.1 a 0. se vierte ésta en la placa petri estéril y se dejará solidificar.2 y 1 ml con pipeta estéril y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky estéril. constituida la muestra.  Si se realiza con escobillón o hisopo el método es igual que con el asa de siembra. Esta técnica se usa en el estudio de antibiogramas. por ejemplo.

Utilizar placas sin agua de condensación en la tapadera.Sembrar igual que en el tubo inclinado pero utilizando un hilo en lugar de un asa y se introduce con la muestra verticalmente hasta el final de tubo (aprox. nunca en la tapadera. 2. 1 cm del fondo). Con un rotulador para vidrio.Normas generales: 1. 4 .-Siembra del inóculo en tubo. Los rótulos deben ser hechos en aquella parte de la placa que lleva el medio. Colocar las placas en posición invertida..Sembrar primero en picadura y sin sacar el hilo sembrar en estrias en la superficie.. es decir con el medio de cultivo arriba.Se lleva a incubación a la temperatura especifica para esa muestra (normalmente 370C) durante 24-48 horas. 6. de esta manera se evitan las contaminaciones y que el agua de condensación caiga sobre el medio. tapar y llevar a incubación.Flamear el asa en toda su longitud. en la base de la placa (reverso). 2. a) Siembra en tubo inclinado.de Técnico de Laboratorio. b) Siembra en picadura.Flamear la boca del tubo.Introducir el asa y sembrar en estrías la parte superior dcl medio (pico de flauta). Finalizada la operación se tapa la placa. se dibujan dos líneas perpendiculares que se cruzan en el centro de la placa. d) Técnica de los cuatro cuadrantes. Realizaremos la misma operación sin flamear en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema. formándose cuatro cuadrantes. 4. 2.S.Flamear la boca del tubo..1. Marcar adecuadamente las placas de petri que contienen el medio de aislamiento.. 5. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra tomándose en ningún momento nuevo inóculo y no levantándose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de inóculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig-zag. 5. en caso de que se encuentre en tubo quitar el tapón. ni en el medio de cultivo.. 3.Tomar la muestra. observándose en el último cuadrante las colonias más aisladas o separadas. c) Siembra en picadura y estrías...C.

11. Obtenido el cultivo puro de la bacteria deseada es conveniente realizarle una tinción de Gram. con ayuda de un rotulador. 8. Con el asa estéril tocar la colonia asegurándose de no rozar otras colonias vecinas. si todas las colonias de la segunda placa resultan idénticas puede usarse una de ellas para establecer un cultivo. TÉCNICA DE UN CULTIVO PURO Cultivo puro. 9. Técnica. Si se trata de un cultivo puro. por ejemplo en un tubo de agar nutritivo. Incubar las placas seleccionando el tiempo y la temperatura de incubación adecuados para cada bacteria. 10. Antes de sembrar revisar el medio a inocular para ver si está contaminado. para comprobar que no esté contaminado. como por ejemplo en la orina donde siempre hay bacterias. Hacer estrías paralelas juntas pero nunca superpuestas. a partir de cada una de las colonias distintas que se obtienen en un aislamiento de una muestra.Se trata de desarrollar un solo tipo microbiano en un medio de cultivo.-RECUENTO DE BACTERIAS En muchas muestras la detección de bacterias sugiere infección pero no asi en otras. 12.C. En condiciones de esterilidad.de Técnico de Laboratorio. Microbiología Clínica: Técnicas de siembra 3. 4. 13. No dejar los tapones de los tubos en la mesa para evitar la contaminación. Sacar los medios del lugar de almacenamiento con anterioridad para que estén a temperatura ambiente en el momento de la siembra. 6. Los tubos se mantendrán inclinados para evitar la contaminación. Las muestras se agitarán para homogenizar su contenido antes de sembrarlos. Incubar los tubos que deberán estar perfectamente rotulados con todos los datos necesarios. 2. Los cultivos puros son mantenidos en el laboratorio por resiembras (pase de una bacteria de un medio a otro) sucesivas. 3.S. avanzando sobre la superficie de agar 5. Para ello. Seleccionar 1 o 2 colonias para realizar el cultivo puro. ya que estas pueden ser destruidas por el calor. en cuyo caso se suministrarán sembrados en tubos inclinados de TSI. tomar la menor cantidad de masa bacteriana posible. se logra masa bacteriana sembrando estrías muy juntas.1. 7. rodeándola con una marca. tomar una gota de la mezcla bacteriana con ayuda de un asa estéril. 2. 5 . 4. También es aconsejable antes de proceder a la obtención del cultivo puro tomar la colonia seleccionada y hacer un segundo aislamiento. una de las copias puede ser liofilizada para su conservación. (Normalmente 37º durante 24 horas). Inocular un tubo inclinado de TSI o agar nutritivo haciendo estrías muy juntas para obtener un tapiz continuo de masa bacteriana. Seleccionar una colonia perfectamente aislada. En las muestras no estériles normalmente la infección viene dada por un incremento en el número o por cambio de las especies presentes. Observar las colonias y describir los diferentes tipos encontrados. Los instrumentos de siembra cuando se esterilizan por flameado hay que dejarlos enfriar antes de la manipulación de las bacterias.

Las fracciones de muestra se pueden obtener mediante diluciones de la muestra o con un asa calibrada y sembrando en placas de la forma más homogénea posible. la primera de la cuales será perpendicular a la estría longitudinal También se pueden realizar sucesivas diluciones de la muestra en un medio de cultivo líquido y tras la incubación ver qué diluciones han presentado turbidez y calcular el número de bacterias vivas que contenía. Técnicas de recuento: 1) Manuales: . como por ejemplo el recuento de hematíes en los cuales hay una diferencia de conductividad al paso de una bacteria u otra partícula que se traduce en una señal que se va registrando y contabilizando. Por todo ello es fundamental realizar estudios que nos permitan saber el número de bacterias presentes en la muestra. que su siembra nos va a dar tras la incubación colonias que puedan ser contadas (lo ideal entre 50 y 250 por placa) y de ahí deducir el número de bacterias.S.En medio sólido: se consiguen sembrando fracciones de muestras con escaso número de microorganismos. 2) Electrónicos: Consiste en un contador electrónico de partículas semejantes a otros empleados en el laboratorio. 6 . Microbiología Clínica: Técnicas de siembra Así mismo los tratamientos se deben valorar como satisfactorios si han hecho desaparecer o al menos han reducido el número de bacterias.de Técnico de Laboratorio.C. de tal modo. Con el asa calibrada se realiza haciendo una estría longitudinal en el centro de la placa y sobre ella se realizan estrías muy juntas en distintas direcciones.

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