SEMANA 2 BIOQUÍMICA II SEMESTRE 2020 II

P-3 Determinación de urea en suero. Determinación de creatinina.

PRACTICA # 3
3.1 DETERMINACCION DE UREA EN SANGRE
I. Generalidades:
Es el principal producto final del catabolismo proteico y es excretado en la orina en mayor
cantidad que cualquier otra sustancia o sea que es la forma bajo la cual se elimina por la orina
la mayor parte del nitrógeno de las proteínas, dada su gran difusibilidad puede decirse que se
distribuye, salvo raras excepciones, en todos los fluidos del organismo, manteniendo una
concentración muy similar a la de la sangre que es vehículo que la transporta. Su contenido y
las variaciones normales dependen de: a) el contenido proteico de la dieta y b) De la diuresis
(la urea es un diurético natural y ejerce efecto continuo sobre el flujo de la orina). Cualquier
alteración de la función renal origina un aumento en la concentración de la urea sanguínea.
La urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en la mayoría de
los líquidos biológicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico.
Se produce en el hígado y es excretada por la orina a través de los riñones.
Una elevación de la concentración sérica de urea, se interpreta generalmente como una
posible disfunción renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores
séricos de urea se encuentran íntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo
proteico, por lo que cualquier alteración en estas variables se traducirá en un cambio de la
concentración de urea en suero.La determinación de la urea se realiza por reacciones de
descomposición: la urea por acción de diversos agentes: calor, reactivos químicos (Ac. Nitroso)
y enzimas, es susceptible de descomponerse, originando la formación de ciertos compuestos
que se utilizan en su valoración. Así la enzima ureasa (que se encuentra en la soya) acelera
su conversión en carbonato de amonio. Se ha supuesto que la acción es de carácter hidrolítico
y se representa por:
CO(NH2) 2 + UREASA 2 H2O → CO3 + (NH4)2
La presente práctica tiene como finalidad:
-Determinar las concentraciones séricas de la urea -Evaluar e interpretar los resultados
II.Reactivos y Equipos:
- Sol. Ureasa -Tungstato de sodio al 1 %. -Acido sulfúrico 2/3 N. -Reactivo de
Nessler.
- Reactivo 1: contiene fenol 532mM, nitroferricianuro de sodio 0,85 mM y etilén-bis-
ditiocarbamato manganoso 0,3 mM.
- Reactivo 2: contiene Hipoclorito de sodio concentrado 36,6 mM y p-toluén
sulfoncloramida 0,12 mM en Hidróxido de sodio 0,625 M.
- Standard : solución de urea 0,60 g / l. - Ureasa: Enzima.Espectrofotómetro RA-50,
III. Procedimiento:
Método según Trinder
La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y
amoníaco; éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de
indofenol que se determina colorimétricamente.
A) TECNICA EN SUERO O PLASMA
En tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y P (Problema). Colocar una o dos
gotas de agua y agregar:
 Tubos de ensayo B S P
Estándar -- 20 ul --
Suero o plasma -- --- 20 ul
Ureasa I gota I gota I gota
Mezclar por agitación suave e incubar a 37ºC por 5 minutos.
Reactivo 1 1 ml 1 ml 1 ml
Reactivo 2 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar por agitación suave e incubar a 37ºC por 5 minutos.
Agua destilada 10 ml 10 ml 10 ml
20
Mezclar por inversión y después de 10 minutos leer en fotocolorímetro con filtro verde
(510- 550 nm) ; en espectrofotómetro a 540 nm llevando el aparato a cero Absorbancia
con agua destilada.
Cálculos:
mg. % de Urea= (lectura del problema - Lect. Blanco) x Factor de calibración
B) TECNICA EN ORINA:
Se sigue la misma técnica que para sangre utilizando orina diluida con agua o solución
fisiológica. Como el contenido de la urea esta relacionado con la densidad, es
conveniente diluir según el siguiente esquema:
Densidad hasta 1,015.......................diluir 1 / 10
Densidad de 1,016 a 1,025...............diluir 1 / 20
Densidad mayor de 1,025................diluir 1 / 40
Como la orina contiene cantidades variables debe efectuarse un Blanco de Orina (BD).
Dicho Blanco se ejecuta igual que el Blanco de Reactivo (B), con la diferencia que,
después de agregar el Reactivo 1 y antes del 2 se agregan 20 ul de la dilución de
orina. Llevar el aparato a cero con el Blanco de Reactivo (B) y leer el Estándar (S), el
Blanco de orina (BD) y el Problema.

CÁLCULO DE LOS RESULTADOS

▪ Suero o plasma : a) Urea ( g / l ) = D x Factor Factor = 0,60 g / l
S
b) BUN ( g / l ) = D x Factor Factor = 0,28 g / l
S
▪ Orina : Urea (g/l) = ( D - BD ) x 0,60 X dilución
S

VALORES DE REFERENCIA
▪ Suero o plasma: los valores normales de urea entre 0,20 g/l y 0,45 g/l.
▪ Orina: Depende de la dieta. Por término medio, y con una dieta mixta corriente, se
excretan unos 30 g en 24 horas, con oscilaciones comprendidas entre 20 a 40 g.
▪ https://www.youtube.com/watch?v=cLa1qqZyXEI Determinación de
Determinación de urea en suero y orina
▪ https://www.youtube.com/watch?v=eACnwiYbAk4 Cuantificación de urea
 CUESTIONARIO
RESPONDER A LO SIGUIENTE:
1. La urea es……………….
2. Características de la urea
3. Lugar de síntesis y estructura subcelular
4. Compuestos que participan en el ciclo dela urea, procedencia
5. Pasos de síntesis, ubicación
6. Distribución en el organismo
7. Utilidad
8. Excreción
9. Significado en la sangre acerca de sus concentración
10. El BUN es …………………

PRACTICA # 3.2
DETERMINACION DE CREATININA EN SANGRE.
I. Generalidades:
La creatinina es el anhidrido de la creatina, se forma en gran parte en los músculos por la
eliminación no enzimática e irreversible del agua del fosfato de creatina, es un producto terminal
del catabolismo proteico que se elimina por la orina.
En condiciones normales la creatina se encuentra sólo en la orina de los niños o en las
mujeres embarazadas o en puerperio, pero no en el hombre adulto. La creatinina en cambio es
un constituyente habitual de la orina cuya excreción no depende como en el caso de otros
compuestos nitrogenados, de la ingestión de proteínas en la dieta. De modo normal se elimina
1 a 7 g al día y esta cantidad es bastante fija para un determinado individuo dependiendo en
forma directa de la masa muscular que tenga el sujeto. Es eliminada por un simple proceso de
ultrafiltración glomerular por lo cual su determinación simultánea en sangre y orina representa
un buen índice de la función renal. Los Valores normales en sangre son de 1 a 2 mg %.
La creatinina en medio alcalino reacciona con ácido pícrico para dar un tautómero de picrato
de creatinina de color anaranjado. Se determina en un filtrado exento de proteínas a partir de
sangre total. Sin embargo, debido a los problemas prácticos inherentes a la determinación del
clearence (recolección de orina en niños, etc.) la determinación de creatinina sérica es más
utilizada como índice de funcionalismo renal.
En esta práctica el estudiante será capaz de determinar la concentración sérica de
creatinina y evaluar en que casos se encuentra alterada.
II. ReaCtivos Y Equipos:
- Reactivo 1: ácido pícrico 41,4 mM
- Reactivo 2: buffer glicina / NaOH 1 M, pH final 12,4
- Standard: solución de creatinina 20 mg/ l.
- Espectrofotómetro RA-50, Refrigeradora, Centrifuga.
III. Procedimiento:
Método de según Trinder
La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa
desproteinización con ácido pícrico, obteniéndose un cromógeno que se leerá a 510 nm.
a) Se debe obtener suero de la manera usual. Puede emplearse orina de 2 horas o de 24
 horas. Si es de 2 horas, multiplicar el volumen medido por 12 para calcular la cantidad de
creatinina eliminada durante 24 h.
b) No se recomienda el uso de plasma pues se obtienen resultados menores en un 8 a 15 %.
No es necesario el uso de aditivos.La hemólisis ligera o moderada no interfiere.
c) En caso de que la muestra a utilizar sea suero, debe efectuarse una desproteinización de
la siguiente manera: 0,7 ml de suero agregar 3,5 ml de Reactivo 1. Mezclar por inversión.
Dejar reposar 10 minutos jy centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos como mínimo.
En cuatro tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco), S (Standard), Ds (Desproteinizado
del Suero Problema) y Do (Dilución de la orina problema). Colocar:
Componentes/Tubos de ensayo B S Ds Do
Desproteinizado -- -- 3 ml --
Standard -- 0,5 ml -- --
Orina diluida (1:50) -- -- -- 0,5 ml
Agua destilada 1 ml 0,5 ml -- 0,5 ml
Reactivo 1 2 ml 2 ml -- 2 ml
Reactivo 2 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 10 minutos leer en fotocolorímetro
con filtro verde (510- 550 nm); en espectrofotómetro a 540 nm llevando el aparato a cero
Absorbancia con agua destilada.
Factor = 20 mg %/ Lectura del standard.
Creatina en orina g/ 24 horas = D/S x Volumen diuresis / 24 horas
Factor de dilución = 50

▪ https://www.youtube.com/watch?v=UsfNaCUwGqQ Determinación de
creatinina en suero
▪ https://www.youtube.com/watch?v=MbeFkENA6KY&t=8s Determinación de
creatinina sérica

CUESTIONARIO
RESPONDER A LO SIGUIENTE:
1. La creatinina es……………….
2. Características de la creatinina y creatina
3. Lugar de síntesis y estructura subcelular
4. Compuestos que participan en la síntesis, procedencia
5. Pasos de síntesis, ubicación
6. Distribución en el organismo
7. Utilidad
8. Excreción
9. Significado en la sangre acerca de sus concentración