PRÁCTICA N° 9.

DETERMINACIÓN DE UREA, CREATININA Y TRANSAMINASAS

I. OBJETIVOS
- Evaluar la concentración sérica de urea por el método de la ureasa.
- Evaluar la concentración sérica de creatinina por el método de la reacción de Jaffé.
- Evaluar la actividad enzimática de la transaminasa glutámico pirúvica o alanina
aminotransferasa
- Evaluar la actividad enzimática de la transaminasa glutámico oxalacética o aspartato
aminotransferasa

II. MATERIALES
Tubos de ensayo, pipetas milimétricas, gradillas,
Guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5cc.( POR MESA Y ALUMNO)
Centrífuga, micropipetas x 10 ul 1 POR LABORATORIO, baño maría, espectrofotómetro.
Kit para Úrea Wiener Lab.
Sol. Estándar: solución de urea = 0.60 g/l (28.04 mg/dl de BUN).
Reactivo A: Solución conteniendo buffer fosfatos 200 mmol/l, ácido salicílico 750
mmmol/l. nitroprusiato de sodio 20 mmol/l y EDTA 10 mmol/l.
Reactivo B: solución concentrada de hipoclorito de sodio 10 mmol/l en hidróxido de
sodio 0.1 mol/l
Reactivo C: ureasa ≥ 75 U/ml en solución glicerada.
Kit para Creatinina Wiener Lab.
Sol. Estándar: solución de creatinina = 20 mg/l.
Reactivo A: Ácido pícrico 41.4 mmol/l.
Reactivo B: Buffer glicina/NaOH 1mol/l.
Kit para GPT Wiener Lab.
Sol. Estándar: solución de piruvato de sodio 2 mmol/l.
Reactivo A: solución con 200 mM de dl-alanina y 2 mM de α-cetoglutarato en buffer
fosfatos 100 mM, pH 7,4
Reactivo B: solución conteniendo 1 mmol de 2,4-dinitrofenilhidracina (2,4-DNFH) en
ácido clorhídrico 1 mol/l.
Reactivo C: solución de hidróxido de sodio 4 mol/l.
Kit para GOT Wiener Lab.
Sol. Estándar: solución de piruvato de sodio 2 mmol/l.
 Reactivo A: solución con 100 mM de l-aspartato y 2 mM de α-cetoglutarato en buffer
fosfatos 100 mM, pH 7,4
Reactivo B: solución conteniendo 1 mmol de 2,4-dinitrofenilhidracina (2,4-DNFH) en
ácido clorhídrico 1 mol/l.
Reactivo C: solución de hidróxido de sodio 4 mol/l.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Determinación de Urea sérica.

La secuencia de reacciones que se emplean en esta determinación es la siguiente:

Ureasa
Urea CO2 + NH3;
pH
NH3 + Salicilato + Hipoclorito Alcalino
Indofenol (verde)

1) Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de

sangre de la flexura del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de un
paciente en ayunas.
2) Una vez obtenida la muestra, colocarla en un tubo de ensayo y dejarlas reposar durante
10 minutos.
3) Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a
3000 RPM durante 10 minutos.
4) Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación.
5) Para la determinación de úrea: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), S
(estándar) y D (Desconocido), se debe colocar:
COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO

B S D

Muestra (suero / ul) -- -- 10

Estándar (ul) -- 10 --

Reactivo A + C (ml) 1.0 1.0 1.0

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C o 10 minutos a temperatura ambiente (18

a 25 °C). Luego agregar:
 Reactivo B (ml) 1.0 1.0 1.0

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C o 10 minutos a temperatura ambiente (18

a 25 °C). Leer en espectrofotómetro a 570 nm. dentro del plazo de una hora.

6) Cálculos de resultados:
Cálculo del factor:
𝟎. 𝟔𝟎 𝒈/𝒍
𝑭=
𝑺

Cálculo de la concentración de Urea.

Urea (g/l) = D x F
7) Interpretación de los resultados.
Valores Referenciales: 0.10 – 0.50 g/l

Determinación de Creatinina sérica.

La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico produciendo un
cromógeno de picrato de creatinina de color rojo (Reacción de Jaffé). La determinación
se realiza en un filtrado de proteínas obtenido a partir del suero (desproteinizado).
1) Para la determinación de creatinina: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), S
(estándar) y D (Desconocido), se debe realizar lo siguiente:
Desproteinización del suero: Colocar en un tubo 0.4 ml de suero y agregar 2 ml
de Reactivo A. Mezclar por inversión. Dejar en reposo durante 10 minutos y
luego centrifugar a 3000 rpm por cinco minutos. Transcurrido el tiempo armar
el siguiente sistema:

COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO

B S D

Desproteinizado (ml) -- -- 1.5

Estándar (ml) -- 0.25 --

Agua Destilada (ml) 0.5 0.25 --

Reactivo A (ml) 1.0 1.0 --

Reactivo B (ml) 0.25 0.25 0.25

 Mezclar por inversión. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Luego leer
en espectrofotómetro a 510 nm, llevando a cero el aparato con agua destilada.

2) Cálculos de resultados: Corregir las lecturas S y D restándoles el blanco (B).

Cálculo del factor:
𝟐𝟎 𝒎𝒈/𝒍
𝑭=
𝑺

Cálculo de la concentración de Creatinina.

Creatinina (mg/l) = D x F
3) Interpretación de los resultados.
Valores Referenciales:
● Suero = 8 a 14 mg/l

Determinación de la actividad enzimática de la Transaminasa Glutámico Pirúvica (GPT)

o Alanina aminotransferasa (ALT).
La técnica empleada en la determinación de transaminasa ALT, es una técnica
enzimática basada en la siguiente reacción:
GPT
L-alanina + alfa cetoglutarato L-Glutamato + Piruvato
El piruvato reacciona con la fenilhidrazina dando un compuesto coloreado en medio
alcalino que se lee a 505 nm.
1) Para la determinación de transaminasa GPT: En 2 tubos de ensayo marcados con B
(Blanco) y D (Desconocido), se coloca:
COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO

B D

Reactivo A: GPT (ml) 0.5 0.5

Colocar en baño de agua a 37°C unos cinco minutos.

Muestra: Suero (ul) -- 100.0

Agua Destilada (ul) 100.0

Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30 minutos

y luego agregar:
 Reactivo B (ml) 0.5 0.5

Mezclar. Dejar 10 minutos a 37°C. Luego agregar:

Reactivo C: diluido (ml) 5.0 5.0

Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2 minutos

leer la absorbancia en espectrofotómetro a 505 nm, llevando el
aparato a cero con agua destilada.

2) Curva de Calibración para GPT:

Se construirá usando diferentes concentraciones del Estándar (piruvato de sodio) de
acuerdo al protocolo señalado por el laboratorio. Se obtuvieron las siguientes
absorbancias para las unidades señaladas.
Actividad: Absorbancia Absorbancia Neta

Unidades (U/l)

0 0.217 0.000

9 0.264 0.047

18 0.339

25 0.384

37 0.464

46 0.519

56 0.563

79 0.679

113 0.786

3) Calcular la absorción neta de cada actividad.

4) Graficar la curva de calibración.
5) Obtener la actividad del paciente.
6) Interpretación de los resultados.
Valores Referenciales:
 ● Transaminasa GPT = Hasta 12 U/l.

Determinación de la actividad enzimática de la Transaminasa Glutámico Oxalacética

(GOT) o Aspartato aminotransferasa (ALT).
La técnica empleada en la determinación de transaminasa AST, es una técnica
enzimática basada en la siguiente reacción:
GOT
L-aspartato + alfa cetoglutarato L-Glutamato + Oxalacetato
El oxalacetato se convierte en piruvato, el cual reacciona con la fenilhidracina
formando un compuesto de color marrón en medio alcalino, el que se lleva a lectura
en el espectrofotómetro a 505 nm.
1) Para la determinación de transaminasa GOT: En 2 tubos de ensayo marcados con B
(Blanco) y D (Desconocido), se coloca:
COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO

B D

Reactivo A: GOT (ml) 0.5 0.5

Colocar en baño de agua a 37°C unos cinco minutos.

Muestra: Suero (ul) -- 100.0

Agua Destilada (ul) 100.0

Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30 minutos

y luego agregar:

Reactivo B (ml) 0.5 0.5

Mezclar. Dejar 10 minutos a 37°C. Luego agregar:

Reactivo C: diluido (ml) 5.0 5.0

Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2 minutos

leer la absorbancia en espectrofotómetro a 505 nm, llevando el
aparato a cero con agua destilada.
 2) Curva de Calibración para GOT:
Se construirá usando diferentes concentraciones del Estándar (piruvato de sodio) de
acuerdo al protocolo señalado por el laboratorio. Se obtuvieron las siguientes
absorbancias para las unidades señaladas.
Actividad: Absorbancia Absorbancia
Neta
Unidades (U/l)

0 0.223 0.000

7 0.269 0.046

12 0.295

20 0.327

28 0.358

37 0.389

48 0.426

81 0.510

3) Calcular la absorción neta de cada actividad.

4) Calcular la absorbancia neta de cada actividad en el cuadro de calibración.
5) Graficar la curva de calibración.
6) Obtener la actividad del paciente. (La absorbancia neta se obtiene de la resta de
Desconocido – Blanco).
7) Interpretación de los resultados.
Valores Referenciales:
• Transaminasa GOT = Hasta 12 U/l.

IV. CONCLUSIONES
El estudiante debe plantear las conclusiones, en base al análisis de los resultados
obtenidos en el desarrollo de la práctica de laboratorio.
La conclusión es una afirmación en respuesta a los objetivos.