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INSTRUCTIVO

DEMOSTRACION DEL EFECTO


DEL pH Y LA
TEMPERATURASOBRE LA
VELOCIDAD DE LA REACCIN
ENZIMTICA

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1. OBJETIVOS
1.1 Demostrar el efecto o influencia del pH sobre la velocidad de reaccin de la
amilasa.
1.2 Demostrar el efecto o influencia de la temperatura sobre la velocidad de
reaccin de la amilasa.
2. INTRODUCCION
Las enzimas, en general, al actuar como biocatalizadores, aceleran reacciones qumicas
especficas, experimentando cambios fsicos durante ellas, pero recuperando su estado
original cuando la reaccin qumica ha terminado. Sin embargo dada la naturaleza
proteica de la molcula enzimtica, diferentes factores fsicos y qumicos pueden
modificar la actividad de una enzima, siendo lo ms importante la temperatura y el pH.
Las enzimas transforman rpidamente los sustratos a temperaturas y a valores de pH
ptimos caractersticos para cada una respectivamente.
Respecto al pH, las enzimas requieren, para actuar con mxima eficiencia, una
determinada concentracin de iones hidrogeno en el medio, por tanto, cada enzima tiene
un pH ptimo de accin. El efecto del pH se explica por la accin de la concentracin
de protones en la disociacin de distintos grupos del sustrato y en especial de la enzima,
que participan tanto en la unin enzima-sustrato y en el mecanismo cataltico mismo,
como en el mantenimiento de la determinada conformacin de la enzima. A valores de
pH por encima o por debajo del pH optimo, disminuye la actividad enzimtica por lo
que, generalmente se describe una curva en forma de campana.
Respecto a la temperatura, al igual que el pH, existe un rango, algunas veces muy
pequeo, donde es mxima la actividad enzimtica, que est determinado por la
magnitud de las variaciones de la velocidad inicial en funcin de la temperatura del
medio, lo que significa que la velocidad inicial de reaccin aumentar con la
temperatura hasta que se haga prcticamente imposible de medir debido a una
activacin. La mayora de las enzimas son completamente inactivadas por encima de los
70 C.
La temperatura ptima de reaccin enzimtica es el resultado de un balance entre el
incremento en la actividad y la velocidad de destruccin de la enzima. La temperatura
ptima no es un valor constante para una enzima dada, sino que depende del tiempo
durante el cual se hace la medicin de la actividad. Mientras ms corto sea el tiempo de
medicin, ms alta ser la temperatura ptima.

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Las molculas deben poseer cierta energa de activacin para que puedan reaccionar y
las enzimas actan disminuyendo la energa de activacin, permitiendo que la reaccin
avance rpidamente. Se puede determinar fcilmente el efecto de la temperatura,
exponiendo la enzima a diferentes temperaturas y se mide la cantidad de actividad
residual.
Para estudiar el efecto de estos factores sobre una reaccin enzimtica, se debe trabajar
en condiciones de operacin bien determinadas. Los otros paramentos o factores, deben
permanecer constante respecto al factor determinante. Para ello se trabajar como
sustrato almidn y se determinara las variaciones del almidn segn procedimiento de
identificacin y cuantificacin de sustrato residual, utilizando solucin iodada.

3. MATERIAL METODOS
3.1 Material Biolgico :
Amilasa

3.2 Materiales:
Pipetas
Tubos de ensayos
Bao mara
Cocina elctrica
Balanza

3.3 reactivos
Solucin buffer acetato.
Solucin buffer fosfato.
Solucin buffer carbonato.
Solucin de almidn al 1%.

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Solucin de enzima al 1%.


Solucin NaCl 0.1M
HCl 0.05 M
Solucin Iodada
Sol. Cprico alcalino
4.

PROCEDIMIENTO:

4.1.

OBTENCION DE ENZIMA AMILASA


En un matraz colocar saliva aproximadamente 20 -30

mL
Mezclar a la misma proporcin con buffer fosfato
Con una gasa o algodn proceder a filtrar la mezcla
El filtrado corresponde a la enzima
4.2. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION
DE LA AMILASA SALIVAL.
A. Sistema de Incubacin:
COMPONENTES Y
PROCESO
Soluc. Almidn 1%

SISTEMA (Tubos)
1
2
1.0
1.0

Buffer pH 2.5

3.0

Buffer pH 6.8

3.0

Buffer pH 9.0

3.0

0.5

0.5

0.5

Soluc. de NaCl 0.1N

3
1.0

Mezclar y Pre-Incubar a 37 C por 5 minutos.


Soluc. Amilasa 0.5 %

0.5

0.5

0.5

Mezclar y Pre-Incubar a 37 C por 15 minutos.


Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada
sistema, prepara y seguir con el siguiente sistema.

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B. Valoracin de la actividad enzimtica por el sustrato


residual:
COMPONENTES Y

SISTEMA (Tubos)

PROCESO
Soluc. HCl 0.5N

Blanco
4.0

1
4.0

2
4.0

3
4.0

Agua destilada

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

De los tubo 1-3 parte A


Solucion Iodada

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de


manera cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o
bien de manera cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el
fotocolormetro con filtro verde, o bien en espectrofotmetro a 660
nm).
4.3.

EFECTO DE la TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD

DE REACCION DE LA AMILASA SALIVAL.


A. Sistema de Incubacin:
COMPONENTES Y
PROCESO
Soluc. NaCl 0.2N

SISTEMA (Tubos)
1
2
0.5
0.5

3
0.5

Soluc. Amilasa salival.

0.5

0.5

0.5

Mezclar y colocar los tubo por 2 minutos en:


Bao de agua helada

SI

Bao mara a 37 C

SI

Bao mara 65 C

SI

1.0

1.0

1.0

Soluc. Almidn 1%.

Incubar por 15 minutos a las mismas temperaturas.

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Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada


sistema, prepara y seguir con el siguiente sistema.
B. Valoracin de la actividad enzimtica por el sustrato
residual:

COMPONENTES Y

SISTEMA (Tubos)
Blanco

Blanco
2
4.0

Soluc. HCl 0.5N

1
4.0

4.0

4.0

4.0

Agua destilada

0.5

Soluc. Almidn 1%

0.5

De los tubo 1-3 parte A

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

PROCESO

Solucion Iodada

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de


manera cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o
bien de manera cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el
fotocolormetro con filtro verde, o bien en espectrofotmetro a 660
nm).
5. RESULTADOS:

INDICADOR

T1
pH 4

T2
pH 7

T3
pH8

Color resultante

Amarillo

Amarillo

Amarillo

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Presencia de

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No

No

No

Si

Si

Si

sustrato residual
(Almidn)
Actividad amilsica

5.1. Cuadro N01: pH

5.2. Cuadro N02: Temperatura C


INDICADOR

T1
0C

T2
37C

T3
100C

Color resultante

Amarillo -

Amarillo

Azulado

Si

No

Si

No

Si

No

azulado
Presencia de
almidn residual
Actividad amilsica

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6. DISCUSIONES:

En la
pH al
error.
tubos

primera experimentacin que realizamos con la influencia del


medio en actividad enzimtica de la -amilasa hubo un gran
Ya sea por los resultados que nos dio en la coloracin de los
que eran los tres de color amarillenta, lo cual no podra darse

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en una experimentacin correcta. Lo correcto que se hubiera


presentado que el pH en extremos (es decir, muy cidos o muy
bsicos) la enzima no funcionaria, o al menos disminuyera
notablemente su actividad. Ente los pH 6 y 7 tendra que aparecer el
efecto acromtico para su dilucin ptima. Sin embargo, a un pH 4
(ms cido), no se encontrara cambios (es decir, no hubo efecto
acromtico). Igualmente con un pH 12 (ms bsico) no hubiera un
efecto acromtico. Por lo que los tubos de los pH extremos se
hubieran teido de color azul y el nico tubo que se hubiera teido de
amarillo sera el de pH neutro.

En la segunda experimentacin que realizamos con la influencia de la


temperatura al medio en actividad enzimtica de la -amilasa se dio
resultados positivos a lo esperado. Ya sea por la teora que explica
que la estructura proteica es la que determina la actividad
enzimtica, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar
a una prdida de actividad en este caso la temperatura. Aunque el
rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones
enzimticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una
considerable influencia. En la experimentacin las temperaturas 0 C
y a 100 C, al momento de poner la solucin yodada se presentaron
cambios de color en los tubos de la gradilla, es decir que el color azul
apareci en estos tubos. Por lo tanto, se podra decir que la amilasa
no actu. En cambio, a temperatura ambiente
se presentaron
cambios al momento de poner la solucin yodada, es decir que el
color amarillo se present en este tubo. Esto era de esperarse, ya que
cada enzima tiene un rango de temperatura ptima y, en el caso de
la amilasa, al encontrarse sta en el cuerpo humano (que siempre
tiene una temperatura de 37 C), se supone que a temperatura
ambiente no va a perder su actividad, pero s disminuirla, ya que los
choques intermoleculares van a ser menores dndose el efecto
acromtico.

7. CONCLUSIONES

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Se logr demostrar que la temperatura es un factor influyente


en cuanto a la velocidad de reaccin de la amilasa.

No se logr demostrar que el pH es un factor influyente para


determinar la velocidad de la amilasa. Por lo que existi un error
al momento de realizar la experimentacin.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Propiedades generales de las enzimas. [En lnea]. Recuperado el


12 de setiembre del 2014, de
http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividadenzimatica-amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf

Actividad enzimtica de la amilasa. [En lnea]. Recuperado el 11 de setiembre


del
2014, desde
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/
schmidth02/parte02/02.html

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CUESTIONARIO:
1. Explique qu ocurre en cada uno de los sistemas de incubacin
preparados, tanto en efecto del pH como de la temperatura.
2. Grafique el efecto del pH y la temperatura sobre la velocidad de
reaccin de la amilasa salival y otras enzimas.
3. Investigue los pH y las temperaturas ptimas de otras enzimas
importantes.
4. Defina que es

estabilidad

enzimtica

explique

la

pH

estabilidad y termoestabilidad de una enzima.


5. Defina el punto isoelctrico (pI) de una enzima (protena).
6. Describa un procedimiento para demostrar (pI) de una enzima.
Ejemplo amilasa salival.
SOLUCION DEL CUESTIONARIO
SOLUCIN CUESTIONARIO:
1. A valores de pH por encima o por debajo del pH optimo,
disminuye la actividad enzimtica por lo que, generalmente
se describe una curva en forma de campana.

La velocidad inicial de reaccin de la enzima aumentar con


la temperatura hasta que se haga prcticamente imposible
de medir debido a una activacin. La mayora de las enzimas
son completamente inactivadas por encima de los 70 C.

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2.

Efecto de
pH

Efecto de
Temperatura

3.
Enzima

Rango ptimo
de temperatura

Rango ptimo
de PH

Funcin

Fitasa

30 - 52C

4.4 - 5.5

Baja el PH del mash.


Ninguna otra utilidad

Beta Glucanasa

37 - 45C

4.5 - 5.0

Peptidasa

45 - 57C

4.6 - 5.2

Produce Nitrgeno
libre de Aminocidos

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Proteasa

45 - 57C

4.6 - 5.2

Rompe grandes
protenas que
producen turbiedad

Beta Amylasa

54 - 66C

5.0 - 5.6

Produce azcares
altamente
fermentables

Alpha Amylasa

68 - 75C

5.3 - 5.8

Azcares menos
fermentables

4.
-

La estabilidad enzimtica es la medida en que una enzima


mantiene su actividad o conformacin estructural cuando
es sometida al almacenamiento, aislamiento y purificacin
o varias otras manipulaciones fsicas o qumicas incluyendo
enzimas proteolticas y calor.
El pH es una medida del grado de acidez o alcalinidad de
una sustancia; el grado de acidez o alcalinidad afecta la
estabilidad de algunas sustancias, en particular, sustancias
orgnicas
Las enzimas son protenas que frecuentemente son
inactivadas cuando son expuestas a temperaturas
demasiado altas

5. El Punto Isoelctrico est definido como el pH en el cual las


cargas positivas igualan a las cargas negativas y no existe
movimiento en un campo elctrico. Las funcionalidades de
las protenas se ven afectadas cuando se aproximan al pI,
debido a la atraccin electroesttica de los grupos con carga
opuesta. Las enzimas son activadas en una zona muy
restringida de pH, y presenta un punto ptimo de pH donde
su actividad es mayor.
6. . Un fenmeno fsico importante es que cuando una molcula
est en su punto isoelctrico tiende a precipitarse, el cual
representa un principio importante de separacin de
protenas. Si se quiere determinar con exactitud el pI de una
protena se usa frecuentemente isoelectroenfoque, en el cual
se usa un gradiente de pH creado por anfolinas. Sin
embargo, esta tcnica resulta costosa y es casi de uso
exclusivo para los laboratorios de investigacin. Por otro
lado, si se conoce la secuencia de una protena existen

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programas que permiten conocer el punto isoelctrico, tales


como el EditSeq de DNA star.
Ya que una protena precipita en su punto isoelctrico, en
esta prctica determinaremos el punto isoelctrico
aproximado de la casena (protena mayoritaria en la leche)
al colocarlos en soluciones con diferentes valores de pH.