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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUMICA
Alumno: ___________________________________________ Cdigo: _________________
Alumno: ___________________________________________ Cdigo: _________________

Prctica 9: ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA AMILASA:


EFECTO DE LA CONCENTRACIN, EL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA
REACCIN ENZIMTICA.

OBJETIVOS:

Reconocer y diferenciar los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas.

Ilustrar el mecanismo por el cual ciertos factores afectan la velocidad de las reacciones
enzimticas.

Utilizar aquellos factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimticas para comprender
cmo se regula el trabajo de las enzimas en los organismos biolgicos.

Discutir los efectos de las variaciones bruscas de factores como temperatura y pH en el


funcionamiento adecuado de los organismos.

1. FUNDAMENTO TERICO
Estudio cintico del enzima -amilasa.
Introduccin a la enzimologa.
La cintica enzimtica tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas, as como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales
transcurren las reacciones enzimticas. La velocidad de las reacciones enzimticas se puede
medir:
1

Por la cantidad de sustrato que desaparece por unidad de tiempo.

Por la cantidad de producto que aparece por unidad de tiempo.

En esta prctica de laboratorio se comprobar la influencia de la concentracin del sustrato [S],


del enzima [E], el pH y la temperatura (TC) sobre la velocidad de la reaccin catalizada por el
enzima -amilasa salival, sobre los enlaces -1,4 del almidn.

Para ello nos basaremos en la desaparicin del almidn por unidad de tiempo, mediante el
seguimiento de la reaccin de coloreada que produce el mismo, as como sus productos de
hidrlisis, con el Iodo en disolucin de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol).
Dado que el almidn est integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe
tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (as como sus respectivos productos de
hidrlisis) con el reactivo de Lugol.
Basndonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la
cintica enzimtica la variacin de los factores que en ella influyen: [S], [E], pH y TC,
fundamentalmente.

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

2.1 Normas de seguridad


El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.
2.2 Equipos de proteccin personal
Usar durante todo el desarrollo de la prctica los siguientes elementos de seguridad:

Bata de laboratorio

Guantes de nitrilo

Gafas de seguridad

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Est prohibido su
intercambio con los dems compaeros de laboratorio.
2.3 Manejo de Residuos qumicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prcticas del laboratorio de qumica en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:
1.

Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales estn debidamente identificados segn el tipo de sustancia a desechar.

2.

Verter nicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no


controladas y potencialmente peligrosas.

No arrojar por el desage los desechos o residuos qumicos obtenidos durante el desarrollo de la
prctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comunquela al responsable del laboratorio, quien le
indicar la forma correcta de hacerlo.

3. TRABAJO INTEGRADO DE LABORATORIO


CONSULTAS PREVIAS.
1

Cules son las caractersticas estructurales del almidn?

Qu tipo de enzima es la -amilasa salival?

Cules son los productos que origina la accin de este enzima sobre el almidn?

Explique cmo influyen en la velocidad de las reacciones enzimticas una variacin en la


concentracin del enzima presente, en la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura.

Qu tipo de reaccin se debe dar entre el lugol y el almidn y de qu forma a travs de sta
reaccin se puede determinar la presencia o ausencia de almidn?

Cul es el producto o productos de la reaccin de degradacin del almidn por el enzima?

4. METODOLOGIA
4.1 MATERIALES
Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.
ITEM
Cantidad
1
Gradilla
15
Tubos de ensayo pequeo
5
Pipeta pasteur
2
Vasos de precipitados de 250 mL
1
Vaso de precipitados de 25mL
1
Erlenmeyer de 50mL
1
Probeta 25 mL
1 de c/u
Pipetas graduadas de 2mL, 5mL y 10mL
2
Pipeta graduada de 1mL
1
Propipeta
1
Termmetro
1
Pinza para tubos de ensayo
1
Cronmetro
1
Frasco lavador
1
Varilla de vidrio
2
Placa de aglutinacin
9 para todo el saln
Estufa
2 para todo el saln
Erlenmeyer de 25mL con tapa
1 para todo el saln
Vaso de precipitados de 250mL

4.2 REACTIVOS
Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.
Reactivos
Cantidad
Lugol (en frasco mbar con tapa gotero)
25mL
Almidn al 0,5%
30mL
Soluciones tampn de pH 4
2 mL
Soluciones tampn de pH 7
2 mL
Agua destilada
50mL
Hielo

4.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


PREPARACIN DE MUESTRA DE AMILASA:

Obtenga aproximadamente 1mL de amilasa salival de su boca en una probeta y


complete hasta 20mL con agua destilada.
Esta solucin es el EXTRACTO ENZIMTICO.

Mtodo 1:

Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reaccin


enzimtica.

Procedimiento.
1. Rotule 4 tubos de ensayo y agregue 2mL de almidn al 0,5%
2. Encuentre la cantidad de lugol necesaria para detectar la solucin de almidn
proveda en esta prctica. Para ello tome 3 gotas de uno de los tubos preparados
en el punto 1 y adicione 1 gota de lugol. Repita el procedimiento aumentando a 2
y 3 gotas de lugol. Escoja la menor cantidad que de una coloracin fuerte.
3. Llve los tubos preparados en el paso 1 a 37C en bao mara y mantenga la
temperatura constante.
4. Agregue en el siguiente orden 2.9mL, 2.8mL, 2.7mL y 2.6mL de agua destilada a
los tubos de ensayo.
5. Luego en el mismo orden, adicione: 0.1mL, 0.2mL, 0.3mL y 0.4mL del extracto
enzimtico. En este momento empieza la reaccin.

6. En placas para ELISA, tome 3 gotas de cada reaccin y agrgueles 1 gota de


lugol (o la cantidad que usted determino apropiada). Repita este procedimiento
cada 2 minutos durante los primeros 20 minutos de reaccin. Para los 40 minutos
restantes tome muestras cada 10 minutos. Consulte con su instructor y ajuste los
tiempos segn la velocidad de su amilasa salival (resultados varan segn
grupo).
7. Asgnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consgnelos en la
Tabla 5.1.
Mtodo 2:

Efecto del tiempo y el pH sobre la velocidad de una reaccin


enzimtica.

Procedimiento.
1. En dos tubos de ensayo agregue 2.5mL de almidn al 0.5%, rotlelos y agregue
1mL de buffer pH 7.0 a uno y 1mL de buffer pH 4.0 al otro.
2. Incbelos a 37C en bao mara y mantenga la temperatura constante.
3. Agregue 0.5mL del extracto enzimtico a cada erlenmeyer. Aqu comienza la
reaccin.
4. En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reaccin y agrgueles 1 gota de lugol
(o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reaccin. Repita
este procedimiento en intervalos de 2 o 5 minutos durante 30 minutos.
5. Asgnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consgnelos en la
Tabla 5.2.

Mtodo 3:

Efecto de la concentracin de sustrato sobe la actividad enzimtica

Procedimiento.
1. Tome 4 tubos de ensayo, rotlelos y agregue en el siguiente orden 0.5mL,
1.0mL, 1.5mL y 2.0mL de almidn al 0,5%. Llvelos a 37C en bao mara y
mantenga la temperatura constante.
2. Luego agrgueles a cada tubo, en el orden correspondiente: 2.0mL, 1.5mL,
1.0mL y 0.5mL de agua destilada.

3. Agregue a cada tubo 0.5mL del extracto enzimtico. Aqu comienza la reaccin.
4. En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reaccin y agrgueles 1 gota de lugol
(o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reaccin. Repita
este procedimiento en intervalos de 10 minutos durante 60 minutos.
5. Asgnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consgnelos en la
Tabla 5.3.

Mtodo 4:

Estudio del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica

Procedimiento.
1. Rotule 3 tubos de ensayo, para realizar los experimentos a 4C, temperatura
ambiente y 50C.
2. Agregue a todos los tubos 2mL de almidn al 0,5%.
3. Al primer tubo llvelo a 4C en hielo, el segundo a temperatura ambiente y el
tercero a 50C en bao mara.
4. Agregue a todos los tubos 0.5mL del extracto enzimtico.

5. En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reaccin y agrgueles 1 gota de lugol


(o la cantidad apropiada), esto para cada reaccin. Repita este procedimiento en
intervalos de 2 minutos durante 10 minutos.
6. Asgnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consgnelos en la
Tabla 5.4.

5. RESULTADOS Y ANLISIS PRELIMINAR DE RESULTADOS.


Mtodo 1: Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reaccin enzimtica
Tabla 5.1 Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reaccin enzimtica
Tiempo de reaccin
(Minutos)
0
10
20
30
40
50
60

Tubo 1

Observacin
Tubo 2
Tubo 3

Tubo 4

1. Con los datos obtenidos construya una tabla tomando como concentracin del
enzima el volumen de la solucin de extracto enzimtico utilizado en cada tubo.
2. Con estos datos construya un grfico de [E] en el eje ordenado contra velocidad
de reaccin (1/t) en el eje abscisas. Por qu se puede tomar como velocidad de
reaccin el inverso del tiempo?
3. Describa qu caractersticas estructurales del almidn permiten su identificacin
mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los
enlaces del almidn. Plantee las conclusiones que se pueden obtener de los
resultados del experimento.
4. Resuma las dificultades encontradas en el ensayo.
Mtodo 2: Efecto del tiempo y el pH sobre la velocidad de una reaccin enzimtica
Tabla 5.2 Resultados del efecto del tiempo y el pH sobre la actividad enzimtica
Observacin

Tiempo de reaccin
(Minutos)
pH 7.0
0
3
5
8
10
15
20
25
30

pH 4.0

Anote si la reaccin en cada tubo es positiva o negativa y anote el tiempo en que se


agota el almidn. Llene con sus resultados la tabla 4.2.
1. Qu efecto tendra la utilizacin del medio con pH muy cido o muy bsico en la
realizacin de este ensayo?
2. Si hubo diferencia en los tiempos de reaccin, cmo explicara esta diferencia?
Mtodo 3: Estudio del efecto de la [S] sobre la velocidad de la reaccin enzimtica
Tabla 5.3. Efecto de la concentracin de sustrato sobe la actividad enzimtica
Tiempo de reaccin
(Minutos)
0
10
20
30
40
50
60

Tubo 1

Observacin
Tubo 2
Tubo 3

Tubo 4

1. Con los datos obtenidos construya una tabla, tomando como valor de [S] el del
mismo volumen de sustrato medido en cada tubo.
2. Con los datos de la tabla construya un grfico de velocidad de reaccin
(volumen/tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de
abscisas (que representa concentracin de sustrato creciente en nuestro
experimento). Por qu en este caso para calcular la velocidad de la reaccin
es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo?
3. Analice el grfico y plantee las conclusiones a las que puede llegar en este caso.
4. Describa las dificultades presentadas en este ensayo.
Mtodo 4: Estudio del efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reaccin enzimtica

Tabla 5.4 Resultados del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.


Tiempo de reaccin
Observacin
(minutos)
4C
Temperatura ambiente
0
2
4
6
8
10

1. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la Tabla 4.4.


2. Plantee las conclusiones que obtuvo en este ensayo.

50C

Preguntas
1. Consulte con los dems grupos de trabajo, las velocidades de actividad de cada
amilasa salival y compare la suya con la de ellos, identificando la amilasa
aparentemente ms rpida y la ms lenta, y dando una posible explicacin para
la variabilidad (si la hay).
2. Ofrezca una explicacin a la variacin de la actividad de la enzima a diferentes
pHs y diferentes temperaturas.
3. Ofrezca una explicacin de por qu no podemos digerir a otro polisacrido de
glucosas como la celulosa. Para esto, mire los tipos de enlace que ocurren en el
almidn y los de la celulosa.
4. Consulte sobre el gen de la amilasa salival en humanos comparado con el de
otros primates, y de una explicacin de por qu la capacidad de degradar
almidn en la saliva pudo haber sido un factor importante en el desarrollo de las
civilizaciones humanas.
http://www.unav.es/acienciacierta/salud/amilasa.html,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2377015/, y

http://blogs.scientificamerican.com/guest-blog/2012/07/23/human-ancestorswere-nearly-all-vegetarians/).