Manual de Practicas Laboratorio BQ

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO.
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE MEDICINA
GUIA DE PRACTICA LABORATORIO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS MDICAS
SECCION BIOQUIMICA
PROMOCION LII
2015
DOCENTES DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA MDICA

SECCION BIOQUIMICA MDICA
DR. JUAN MANUEL VALLADOLID ALZAMORA. (JMVA)

(aulavirtualvalladolid@gmail.com)
Ms. JORGE PLASENCIA ALVAREZ. (JPA)
Prof. Principal Tiempo Completo.

COORDINADOR DE CURSO
Dra. MARIA ESTHER DAISY REYES BELTRAN. (MRB)
Prof. Auxiliar Tiempo Completo.

Coordinador Adjunto del Curso.
Prof. Principal Dedicacin Exclusiva.
Ms. WALTER OBESO TERRONES.(WOT)
(gobeso@gmail.com)
Jefe del departamento de Ciencias

Bsicas Medicas.
Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA. (JHS)
Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO. (CAA)
Prof. Asociado Tiempo Completo.
Ms. ANGEL ALFREDO LARIOS CANTO. (ALCA)
Prof. Auxiliar Tiempo Parcial.
(aalarian51@yahoo.com)
DR. HCTOR RODRGUEZ BARBOZA. (HRB)
Prof. Auxiliar Tiempo Parcial
I UNIDAD
SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA
PRACTICA N 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I.
INTRODUCCION:
Las enzimas son protenas relativamente frgiles con tendencia a sufrir desnaturalizacin e inactivacin,
es decir alteraciones en su conformacin, por efecto de diversos agentes fsicos y qumicos como:
temperatura, cidos y lcalis fuertes, sales pesadas, pH ,etc.
Las enzimas se encuentran en muy pequeas concentraciones en los materiales biolgicos. Resulta un
trabajo arduo y complicado individualizarlas o purificarlas. Para poder verificar directamente las
propiedades comunes o similares a la naturaleza proteica que las caracterizan , desde el punto de vista
experimental se pueden utilizar las propiedades de catalizadores especficos que tienen las enzimas,
como indicador de las alteraciones que pueden sufrir stas cuando son sometidas a la accin de
diferentes agentes fsicos y qumicos . De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una
determinada enzima se pueden verificar cmo afectan los agentes fsicos y qumicos la naturaleza
proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad.
Se busca asi poner en evidencia la naturaleza proteica de las enzimas y sus propiedades comunes al ser
expuestas a la accin de diversos agentes fsicos y qumicos que hacen variar su comportamiento y
actividad cataltica.
II.
REACTIVOS A UTILIZAR:
a. NaOH 1N
b. Almidn soluble 1%
c. Amilasa 1%
d. Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6
e. CuSO4 20%
f. Solucin Iodada
g. Acido Tricloroactico 20%
h. NaCl 0.15 M
i. HCl 3 N
j. HCl 0.05 N
III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Armar el siguiente sistema (A):
TUBOS
COMPONENTES (en ml)
II
III
IV
VI
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
NaOH 1N
2.4
HCl 3N
2.4
cido Tricloroactico 20%
2.4
CuSO4 al 20%
2.4
2.4
2.4
Amilasa al 1%
Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6
a. Observar el aspecto y color producido e interpretar.
b. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo 10 minutos a temperatura ambiente.
c. Colocar el tubo VI en un bao de agua hirviendo por 10 minutos.
d. Durante este lapso construir el siguiente sistema (B):
TUBOS
COMPONENTES (en ml)
II
III
IV
VI
Almidn al 1.0%
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
NaCl 0.15 M
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
Agua Destilada
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
e. Preincubar por dos minutos a 37C.

f. Agregar 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del sistema (A) a su
correspondiente tubo del ltimo sistema (B).
g. Dejar en incubacin a 37C. por 20 minutos.
h. A continuacin armar el siguiente sistema:
TUBOS
COMPONENTES (en ml)
HCl 0.05N
De los tubos de reaccin del
II
III
IV
VI
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
sistema (B), agregar:

Solucin yodada
i.
IV.
Observe el color producido e interprete los resultados.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
Cul es el mecanismo de accin de las sales pesadas sobre la protena (enzima)?

Cmo actan los cidos y bases fuertes sobre la protena (enzima)? Ejemplos
Cmo acta la temperatura sobre la estructura proteica de la enzima?
Cmo repercute la modificacin de la estructura proteica, producida por agentes fsicos y
qumicos, sobre la actividad enzimtica?
PRACTICA N 02
DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS
I.
INTRODUCCION:
El punto isoelctrico (PI) es la concentracin de iones hidrgeno en el cual la protena es elctricamente
neutra, porque el nmero total de cargas positivas es igual al nmero total de cargas negativas
contenidas en la protena. Cada protena posee un determinado punto isoelctrico. Cuando una
protena se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores, iguales o mayores al
PI, la protena sufre variaciones en la constitucin de sus grupos qumicos, producindose en
consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su funcin biolgica
A parte de otras propiedades que presentan las protenas, cuando se encuentran en una solucin que
tienen pH igual al PI, algunas protenas son muy dficilmente solubles y precipitan. Aprovechando este
comportamiento, se puede determinar el PI de una protena observando los cambios de solubilidad que
se producen cuando la protena se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos.
La presente prctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoelctrico de las protenas y por
tanto de las enzimas es una caracterstica fsico qumica comn de estas molculas, que precipitan
porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mnimo.
II.
III.
- NaOH al 10%.
- cido actico 1N
- Papel Indicador de pH
- Solucin de casena en Acetato de Sodio 0.1N
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)
Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9
TUBOS
REACTIVOS (en ml.)
cido Actico 1N
3.2
Agua Destilada
6.8
Mezclar el tubo N 1
Extraer 5ml. de solucin del tubo N 1 y agregarlo al tubo N 2. Mezclar
Extraer 5ml. del tubo N 2 y transferir al tubo N 3. Completando del mismo modo hasta completar
la serie.
En el tubo N 9 una vez efectuada la mezcla, se extrae 5 ml. de solucin y se elimina .
Al contenido anterior del sistema agregar rpidamente 1 ml. de casena en acetato de sodio 0.1N en
cada tubo.
TUBOS
CONTENIDO ( ml.)
Contenido Anterior
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
Casena 0.1N (sal)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Mezclar al instante por inversin .

Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la protena en los diferentes
tubos.
Anotar en el cuadro que se da a continuacin
Observar despus de 30 minutos de reposo y anotar tambin en el cuadro respectivo.
TUBOS
N.
EFECTO
INMEDIATO
EFECTO DESPUS DE 30
MINUTOS
CLCULO
DEL pH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Emplear los smbolos siguientes :
O = no cambia
+ = opalescencia,
x = precipitado
Determinar el tubo que presenta el mximo de precipitacin, lo cual se producir en el tubo que
tiene pH prximo a la solubilidad mnima de la protena.
Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuacin de Henderson Hasselbach.
Verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de papel. Anotar los resultados en la
columna respectiva del cuadro anterior.
Ecuacin de Henderson Hasselbach
[ sal ]
pK del cido Actico = 4.7
pH = pK + log.
[ cido ]
Ejemplo :
Si la concentracin de la sal es de 1 ml. de acetato de sodio 0.1 N en todos los casos, la
concentracin de cido actico vara. As en el tubo N 1 es de 1.6 ml. de cido 1 N (16 ml. 0.1N). En
el tubo N2 la concentracin de cido actico es de 8 ml. al 0.1 N. En el tubo N 3 la concentracin de
cido actico es de 4.0 ml. 0.1 N. Etc.
Clculo de pH para el tubo N 3 :
pH = pK + log. 1 = 4.7 0.6 = 4.1
4
NOTA : Traer calculados los pH al laboratorio
TUBO N 3 : pH = 4.1
IV. CUESTIONARIO:
1. Qu es el punto isoelctrico?.
2. Conoce el punto isoelctrico de la casena?
3. Qu importancia tiene el punto isoelctrico de las protenas y de las enzimas?
4. Por qu razones precipita la protena cuando el pH del medio es igual al pH Isoelctrico de
la protena?
5. El pH neutro del medio es igual al pH Isoelctrico? De sus razones.
PRACTICA N 03
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
I.
INTRODUCCION:
Los seres vivos obtienen y gastan la energa ms rpidamente debido a la presencia de catalizadores
biolgicos llamados enzimas. Tal como ocurre con los catalizadores inorgnicos, las enzimas modifican
la velocidad de una reaccin qumica sin afectar el equilibrio final; y slo se requieren pequeas
cantidades para efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas de sustrato.
Para poder mostrar la actividad enzimtica se debe tener presente fundamentalmente que la accin
cataltica de las enzimas es de carcter especfico; o sea, cada reaccin qumica debe ser catalizada por
una determinada enzima. El reactante o sustancia qumica que reacciona para dar un producto en un
sistema enzimtico se llama sustrato, habra entonces tantos sistemas enzimticos como sustratos
reaccionantes existen en un organismo vivo.
Debido a que solo se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reaccin dada,
solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente.
En general, la actividad de cualquier sistema enzimtico puede ser demostrada de dos maneras:
1. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) despus de un tiempo
determinado de incubacin en condiciones especificas de pH y temperatura.
2. Verificando los productos liberados (PRODUCTOS FORMADOS) despus de un tiempo
determinado de incubacin en condiciones especificas de pH y temperatura.
El presente trabajo experimental tiene como finalidad determinar la actividad enzimtica, utilizando a la
enzima amilasa con capacidad de producir degradacin del almidn en maltosa (disacrido reductor) y
algo de glucosa como ejemplo de un sistema enzimtico.
II.
- Solucin de almidn pH 6.0 al 1%.
- NaCl 0.1M
- Enzima al 1% (amilasa salival).
- HCl 0.05N
- Solucin yodada.
- Reactivo Folin Wu:
a. Solucin Cprica alcalina.
b. Solucin fosfomolbdica.

Armar el siguiente sistema :
TUBOS
COMPONENTES
II
Solucin de almidn 1% pH 6.0
5 ml.
5 ml.
Solucin de NaCl 0.1M
1 ml.
1 ml.
Agua destilada
4 ml.
3 ml.
Colocar los tubos en bao maria a 37C por 5 minutos.

Agregar 1 ml. de enzima al tubo II.
Volverlos a colocar en bao maria a 37C durante 10 minutos.
A. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL.

De cada uno de los tubos de incubacin transferir 0.5 ml. a su correspondiente del cuadro
siguiente, inmediatamente de cumplidos los 10 minutos.
TUBOS
COMPONENTES
II
5 ml.
5 ml.
De los tubos I y II: Etapa A
0.5 ml.
0.5 ml.
Solucin yodada
0.5 ml.
0.5 ml.
HCl 0.05 N
MEZCLAR: Observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color
resultante.
B. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin Wu)
TUBOS
COMPONENTES
De los tubos I y II: etapa A
I
1ml.
II
1ml.
Solucin Cprica alcalina
1ml.
1ml.
Solucin fosfomolbdica
1ml.
1ml.
Agua destilada
2ml.
2ml.
Hervir 8 minutos
Enfriar
Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color
resultante
IV
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
Qu mtodos conoce para determinar la actividad enzimtica?

Cmo se puede objetivar la presencia del sustrato residual?
Cmo demostrar si se ha producido no reaccin enzimtica en un experimento realizado?
Cmo se pueden objetivar los productos de una reaccin enzimtica?
PRACTICA N 04
ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMATICA
I.
INTRODUCCION:
En la naturaleza existen sustancias cuya accin sobre una enzima dada se traduce en la disminucin de
su actividad. Estas sustancias son conocidas como inhibidores enzimticos. No se considera en sta
categora aquellos agentes como los cidos fuertes, alcoholes y calor que producen notables
alteraciones en la estructura especial de la molcula proteica que conduce a la desnaturalizacin.
Los inhibidores enzimticos se clasifican en dos grandes grupos reversibles e irreversibles, que se
pueden distinguir en base a un criterio experimental. Si despus de hacer actuar el inhidor sobre la
enzima, eliminamos por algn mtodo, como podra ser la dilisis, el proceso de inhibicin, y la enzima
recupera su actividad original, se dice que el inhibidor es reversible. A la inversa, si la enzima contina
inhibida despus de la reaccin del exceso de inhibidor, se dice que el inhibidor es irreversible.
Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interaccin entre inhibidor y la
enzima se traduce en varios tipos de inhibicin perfectamente diferenciales experimentalmente. Los
dos tipos ms comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no
competitivas, a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas.
En la inhibicin competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su accin inhibidora de
revierte al aumentar la concentracin de sustrato. El inhibidor se combina reversiblemente con la
enzima en el sitio por el cual se debera unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formacin del
complejo activo enzima-sustrato. De all el nombre de competitivo, por que efectivamente tanto el
inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazar se mutuamente de la
enzima.
La inhibicin no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la
concentracin del sustrato ya que este ltimo no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Aqu el
inhibidor se une a la enzima en otro sitio distinto al cual se une el sustrato. Por esta razn la unin de
este ltimo con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor, pudindose formar entonces un
complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor, que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en
productos de la reaccin y complejo enzima-inhibidor. Desde el punto de vista cintico, el Km no vara,
pero la Vm disminuye.
II.
REACTIVOS A UTILIZAR
- Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2
- Succinato de sodio 0.1 M
- Succinato de sodio 0.5 M
- 2 6 Diclorofenolindofenol
- Malonato de sodio 0.1 M
- Cloruro de mercurio
- Homogenizado heptico 10 %
III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES:
ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA:
10
TUBOS
COMPONENTES (ml)
II
III
IV
2.0
1.8
1.3
1.3
1.0
Succinato de sodio 0.1 M
0.2
0.2
0.2
0.5
Cloruro de mercurio 0.1 M
0.5
Malonato de sodio 0.1 M
0.5
0.5
2 6 diclorofenolindofenol
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Homogenizado 10 %
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Buffer fosfato 0.1M pH 7.2
Dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente.

Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).
Anotar y luego agregar a los tubos II, III, IV.
COMPONENTES
II
III
IV
0.5
0.5
0.5
Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar.
IV. CUESTIONARIO:
1. Por qu el malonato es inhibidor competitivo?
2. Por qu el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo?
3. Cmo podra usted demostrar que la inhibicin producida por el cloruro mercrico es o no
reversible?
4. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibicin competitiva en el sistema
Deshidrogenasa succnica succinato, adems del malonato utilizado en el presente experimento.
5. Seale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibicin no competitiva
reversible, sin considerar el cloruro de mercurio.
6. Qu diferencias puede usted establecer entre la inhibicin competitiva y la inhibicin alostrica?
7. De por los menos dos semejanzas entre la inhibicin no competitiva reversible e inhibicin alostrica.
11
PRACTICA N 05
FACTORES FSICOS-QUMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES

ENZIMTICAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE ENZIMAS, PH, TIEMPO
TEMPERATURA, IONES INORGNICOS
I.
INTRODUCCION:
En general, todas las enzimas, independientemente del tipo de reaccin que catalizan, presentan
caractersticas comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo, retardando o impidiendo
su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reaccin enzimtica
sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. Tomando una determinada enzima como
patrn es posible tener una idea ms o menos clara de la influencia de los factores (tiempo,
temperatura, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, pH, iones, etc,) sobre la serie infinita
de enzimas que se conoce. Este patrn general, como se comprender, varia en forma caracterstica
para cada enzima en particular. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros
permanezcan constantes, de tal manera que la investigacin del factor variable no se vea afectada por la
variacin que pudieran sufrir los otros.
La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores, pH, concentracin de
enzima, concentracin de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reaccin
enzimtica, tomando como ejemplo la hidrlisis enzimtica del almidn y evaluando las variaciones del
sustrato transformado y de los productos de la reaccin enzimtica.
II.
- Solucin de almidn al 1 %
- Buffer fosfato 0.1M pH 6.6
- Buffer acetato 0.1M pH 4.6
- Buffer borato 0.1M pH 9.0
- Solucin de NaCl al 2 %
- Amilasa dializada al 0.25 %
- HCl 0.05N
- Solucin yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio)
- Solucin cprico alcalina.
- Solucin fosfomolbdica.

Armar el siguiente sistema:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml.)
II
III
IV
VI
VII
VII
Solucin de almidn al 1 %
1.0
1.0
2.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Buffer acetato 0.1M pH 4.6
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
Buffer borato 0.1M pH 9.0
5.0
Solucin de NaCl al 2 %
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
1.4
Agua destilada
2.6
3.4
1.0
2.0
2.0
2.0
2.4
2.0
- Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al bao de agua a 37C, por cinco minutos, para el equilibrio de
la temperatura.
- El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0C y 4C durante cinco minutos.
12
- Agregar el preparado enzimtico a los tubos: del II al VIII, segn se indica y tomar el tiempo.
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (ml.)
II
III
IV
VI
VII
VIII
Preparado enzimtico (ml)
0.0
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.2
0.6
(Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimtico fue agregado a cada tubo)
Mezclar y continuar la incubacin.
Los controles de la actividad enzimtica:
- Por el sustrato residual, se realizar en toda la serie de tubos, del I al VIII, a los 20 minutos de
incubacin.
- Por los productos formados, se realizar solamente en los tubos III y V, a los 20 minutos de incubacin.
De acuerdo a los sistemas que a continuacin se presentan.
CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL

El control del sustrato no transformado se realiza por la reaccin del yodo, de la siguiente manera:
Cumplidos los 20 minutos de incubacin sacar los tubos del bao mara y luego armar una serie
paralela de tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado, 0.5 ml. del incubado de su
correspondiente tubo.
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (ml.)
II
III
IV
VI
VII
VIII
Incubado correspondiente
de cada uno de los tubos
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
HCl 0.05N
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
Solucin iodada
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos; valorando los cambios
de coloracin (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final.
CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS

El Control de los productos formados se har en base a la capacidad reductora de estos (glucosa,
maltosa) de la siguiente manera:
Esta determinacin slo se har en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.
Armar el siguiente sistema :
COMPONENTES
TUBOS
III
Incubado correspondientemente a los tubos III y V
1.0 ml.
1.0 ml.
Solucin cprico alcalina
1.0 ml.
1.0 ml.
Mezclar y poner en bao mara hirviendo por 8 minutos. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar
con agua corriente y agregar:
COMPONENTES
TUBOS
III
Solucin fosfomolbdica
1.0 ml.
1.0 ml.
Agua destilada
5.0 ml.
5.0 ml.
Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los
cambios de coloracin (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final.
13
CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR EL

SUSTRATO RESIDUAL:
(cambio de color)
A los 20 minutos:
I
II
III
IV
VI
VII
VIII
CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR LOS

PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color)
A los 20 minutos
III
IV. CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Cules son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimticas?
Cmo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidn como
sustrato?
Cmo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones
enzimticas?
Cmo puede demostrar el efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la
reaccin enzimtica?
Cmo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas?
Cmo puede demostrar el efecto de la presencia de un in activador sobre la velocidad de las
reacciones enzimticas?
14
PRACTICA N 06
DISTRIBUCIN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE XIDO-REDUCCIN

I. INTRODUCCION:
Los carbohidratos, cidos grasos, aminocidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el
organismo mediante sistemas enzimticos simples o complejos. Estos sistemas estn constituidos por
protenas, fosfolpidos, grupos prostticos y tomos metlicos.
De acuerdo a su estructura y funcin, las enzimas que intervienen en estos procesos se encuentran
clasificados en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimolgica.
Las enzimas de xido - reduccin tienen una distribucin caracterstica intracelularmente, encontrndosele
de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energa derivada de las oxidaciones es
"capturada" en la forma del intermediario macrorgico ATP. La finalidad del presente trabajo es objetivar la
distribucin intracelular de las enzimas de xido - reduccin usando los indicadores redox 2-6
diclorofenilindofenol y p-fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hgado de
rata obtenidos por centrifugacin diferencial mediante el mtodo de Schreider y col.
II. REACTIVOS A UTILIZAR
Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4
2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %
Succinato 0.1M
pfenilendiamina 1%
Homogenizado total de hgado de rata en sucrosa 0.25 M
Fraccin nuclear del homogenizado.
Fraccin mitocondrial del homogenizado.
Fraccin microsomal soluble del homogenizado.
KCl 0.154 M
Fraccionamiento Celular
- Sacrificar una rata albina, inmediatamente hacer un corte longitudinal en el abdomen
procediendo a extraer el hgado; el cual se coloca en una placa petri y se elimina la cpsula del
hgado y otros tejidos perifricos
- Homogenizado al 10%: Pesar 10g. de hgado. Cortar en trozos pequeos ycolocar en el
homogenizador potter, agregar solucin KCl 0.154 M. Hacer presin manualmente con el
mbolo, girando hacia el fondo. Todo debe trabajarse entre 0 y 4C.
- El homogenizado se centrifuga a 800 rpm. por 10 minutos en una centrfuga refrigerada. El
sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. El sedimento constituye la fraccin nuclear y
se coloca en un beaker de 100ml.
- El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 rpm. por 15 minutos en la centrfuga
refrigerada. Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fraccin microsomal con
el citosol. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fraccin mitocondrial.
Armar el siguiente sistema, usando 2,6-diclorofenolindofenol:
15
COMPONENTES
Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4
1.0
0.5
0.5
0.5
0.5
26 diclorofenolindofenol
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Succinato de sodio 0.1M
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
Fraccin nuclear
0.5
Fraccin mitocondrial
0.5
Fraccin microsomal soluble
0.5
Homogenizado total
0.5
Mezclar.
Dejar en reposo a temperatura ambiente.
Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los
resultados.
Armar el siguiente sistema, usando pfenilendiamina
COMPONENTES
Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4
1.5
1.0
1.0
1.0
1.0
p-fenilendiamina 1%
(sustrato + indicador)
Fraccin nuclear
0.5
-
0.5
0.5
0.5
-
0.5
-
0.5
-
Fraccin mitocondrial
0.5
0.5
-
0.5
Fraccin microsomal soluble

Homogenizado total
Mezclar.
Dejar en reposo a temperatura ambiente.
Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los
resultados.
IV. CUESTIONARIO:
1. Qu es el 2,6-diclorofenolindofenol y cmo acta en la cadena respiratoria?
2. Qu es el p-fenilendiamina y cmo acta en la cadena respiratoria?
3. Grafique usted en una cadena de xidoreduccin biolgica la accin de los indicadores rdox 2,6
diclorofenolindofenol y pfenilendiamina.
4. Qu es un homogenizado de hgado y cmo se obtienen las fracciones celulares por centrifugacin
diferencial?
5. En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de xidoreduccin?
6. Haga un esquema de la centrifugacin diferencial
16
II UNIDAD
METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS
PRACTICA N 07
DEMOSTRACIN DE LA DIGESTIN Y ABSORCIN DE LOS CARBOHIDRATOS:
GLUCOSA PRE Y POST PRANDIAL
I.
INTRODUCCION:
Histricamente, la glucosa fue una de las primeras sustancias determinadas en sangre y,
probablemente, la que ms mtodos se han sugerido para su determinacin en otros constituyentes.
La glucosa en sangre, proviene de dos orgenes: de origen exgeno que proviene de los alimentos, y de
origen endgeno, que proviene del hgado por glucogenlisis. Por otra parte, hay gasto de glucosa
cuando es removida de los tejidos perifricos (para su consumo) y por excrecin renal por la orina, por
lo tanto la concentracin de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto.
En el caso del hgado, el transporte de glucosa al interior de las clulas es por difusin pasiva, siendo el
hepatocito permeable para este metabolito. En casi todos los dems tejidos la glucosa no puede
penetrar en el interior de las clulas por simple difusin, sino que lo hace por un mecanismo de
difusin controlada, en particular en el tejido adiposo, el corazn y el msculo esqueltico.
El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a travs de las clulas de la mucosa
intestinal no es muy conocido. Se cree que est ntimamente ligado al transporte de Na+. Este
proceso, por ello, se llama cotransporte, y depende de su funcionamiento de que exista una alta
concentracin de sodio en fludo extracelular. En este caso la glucosa entra en la clula, posiblemente
porque se une a la misma protena transportadora que lleva el Na+. A su vez, el sodio, por la bomba de
sodio y potasio, volvera a salir de la clula.
Este mecanismo requiere ATP como fuente de energa. La entrada de la glucosa en estas clulas est
supeditada a que, al salir del Na+ mantenga alta concentracin en el lquido extracelular. Este es un
caso interesante en que un sistema de transporte a travs de la membrana favorecera a otro.
El conocimiento de la glicemia es importante no slo porque nos permite tener una idea general del
mecanismo de homeostasis existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos
estados patolgicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento.
El propsito de la siguiente prctica es demostrar la digestin y absorcin de la glucosa, cuantificando
la glicemia pre y post prandial en personas normales y/o patolgicas.
II.
-
III.
Estndar : Solucin de glucosa 1 g./l

GOD/POD : Solucin de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Perxidasa (120 U/ml).
Reactivo 4- AF: Solucin de 4 aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l.
Reactivo Fenol : Solucin de Fenol 55 mmol/l.
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES :
OBTENCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE :
Se tomarn dos nuestras de sangre :
La primera:
La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra.
La segunda:
Esta muestra se tomar despus de una hora, como mximo, despus de la ingesta alimenticia.
En esos momentos, se extraern 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodrmica de 10
ml. y con aguja N 20.
17
Colocar las muestras en tubos de ensayo, dejar reposar 10minutos, luego centrifugar a 1500 rpm por 5
minutos. Separar el suero.
La determinacin de la glicemia se realizar por el mtodo Enzimtico de la glucosa oxidasa.
Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco), S (Standard), Dpre. (Desconocido preprandial) y Dpost.
(Desconocido post prandial).
COMPONENTES
B
Standard
----Muestra (Suero pre.)
----Muestra (Suero post.)
----Reactivo de trabajo.
2 ml.
S
20 ul.
--------2 ml.
Dpre.
Dpost.
--------20 ul.
-------20 ul.
2 ml.
2 ml.
Incubar todos los tubos 10 minutos en bao de agua a 37 C

Leer en Espectrofotmetro a 505 nm. en fotocolormetro con filtro verde (490530 nm.) llevando el
aparato a cero con el blanco.
Clculo de los resultados :
Glucosa pre prandial (g/l) = Dpre.xf
donde
f = 1,00 g/l
BI
OQ
UI
MI
CA
M
DI
CA
S
Glucosa post prandial (g/l) = Dpost. x f
A los tubos problema se les resta el blanco antes de multiplicar por el factor (f)
IV.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
Qu valores de glicemia espera encontrar en las muestras pre y post prandial?

Qu variaciones fisiolgicas de la glicemia puede sealar?
Qu enzimas participan en la digestin de los carbohidratos?
Cmo se realiza la absorcin de los carbohidratos?
Cules son los valores normales de glicemia?
18
PRACTICA N 08
REGULACIN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUNEA: EFECTO DE LA INSULINA
I.
INTRODUCCION:
La glucosa sangunea proviene de glucgeno heptico, aminocido, otros carbohidratos y de glucosa
absorbida por el intestino.
En condiciones normales, en ayunas, la glicemia es muy constante y tiene en el hombre un valor entre 80
a 120 mg por 100 ml de sangre (segn el mtodo de Folin- Wu). Siendo en la sangre arterial mayor que en
la venosa. La glicemia se eleva despus de la ingestin de un alimento rico en hidratos de carbono para
luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas despus de la ingestin vuelve
al nivel de ayunas. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos, pues es utilizada por todas las
clulas para producir energa y por algunas clulas para funciones ms especializadas por ejemplo
glucognesis, lipognesis y otras semejantes.
Los mecanismos reguladores de la concentracin de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible
que los primeros actan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las
glndulas de secrecin interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales
depende del equilibrio entre la produccin y la utilizacin de la glucosa sangunea; cuya sensibilidad est
regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y
de la adenohipfisis por el otro.
La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. Esta hormona es
producida por las clulas beta de los islotes de Langerhans del pncreas y es secretado en respuesta
directa al incremento de glucosa en la sangre. El efecto ms importante de una deficiencia insulnica es el
de un nivel sanguneo de glucosa elevado (hiperglicemia), una excesiva excrecin de glucosa por la orina
(glucosuria) y un reducido nivel de glucgeno en el hgado. La administracin de insulina va seguida de
hipoglicemia cuya magnitud depende de la dosis administrada; el efecto se debe fundamentalmente a
que la hormona favorece la formacin de glucgeno en el hgado y en el msculo, a la vez que acelera la
oxidacin de glucosa en diferentes tejidos. La insulina tambin favorece la conversin de los hidratos de
carbono en cidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeognesis a partir de los aminocidos. Se explica
as que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro
denominado Diabetes.
La secrecin de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia, de
manera que cada vez que se eleva la glicemia, se produce ms insulina que tiende a aminorarla.
La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variacin de glicemia
como consecuencia de administracin de insulina.
II.
- Conejos adultos de ms de 2 kg. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas.
- Solucin de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml.
- Jeringas hipodrmicas de 2,5 cc. 5,0 cc.
- Reactivo de glicemia enzimtica (GOD-PAP)
III.
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.

EFECTO DE LA INSULINA SOBRE LA GLICEMIA
Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la
cantidad de insulina a inyectar.
Dosis de la solucin de insulina cristalina (Lilly) (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de
peso corporal.
Utilizar una jeringa hipodrmica de 2,5 ml. 5,0 ml. que facilita la medida de la dosis.
EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINITRACION DE INSULINA.
Extraer una primera muestra de sangre por puncin cardaca y transferirla a un tubo de ensayo de
13x100 mm. Servir para establecer los valores basales de glicemia.
Inyectar por va subcutnea la cantidad calculada de insulina.
Luego extraer muestras de sangre a los 15, 30 y 60 minutos despus de inyectada la insulina, lo
que hace un total de tres muestras en una hora.
19
Centrifugar las muestras a 1500 rpm x 10 minutos; separar el suero.

Con cada una de las citadas muestras de suero realizar la determinacin de glucosa segn el
mtodo de la glucosa oxidasa.
DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE DE LOS ANIMALES TRATADOS CON INSULINA.

Utilizar 5 tubos de ensayo: Bco. (Blanco), Basal (B), Prob 15 min., prob. 30, prob. 60 min.
COMPONENTES Bco
Basal
Muestra basal
----20 ul.
Muestra 15 min
--------Muestra 30 min
--------Reactivo de trabajo. 2 ml
2 ml.
15 min
-----20 ul
----------2 ml.
30 min
--------20 ul
----2 ml.
60 min.
------------20 ul.
2 ml.

Clculo de los resultados:
Glucosa prob. (g/l) = abs prob x f
Anotar los resultados en relacin al tiempo.
- Hacer una grfica de glicemia vs tiempo
IV.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
Explique usted brevemente la regulacin de la glicemia, como resultado, en trminos generales, de la

tasa de llegada e ndice de salida de la glucosa de la sangre.
Explique de manera suscinta el efecto de la insulina sobre la glicemia: con especial referencia al
metabolismo de los carbohidratos.
Cul es el efecto metablico de la insulina sobre el hgado y sobre los msculos y qu efectos
produce sobre la glicemia?
20
REGULACIN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUNEA: EFECTO DE LA ADRENALINA

I.
INTRODUCCION:
La glucosa sangunea proviene directamente de diversas fuentes : glucgeno heptico, aminocido,
otros carbohidratos y de glucosa absorbida por los intestinos.
La glicemia se eleva despus de la ingestin de un alimento rico en hidratos de carbono para luego
descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas despus de la ingestin vuelve al
nivel de ayunas. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos, pues es utilizada por todas las
clulas para producir energa y por algunas clulas para funciones ms especializadas por ejemplo
glucognesis, lipognesis y otras semejantes.
El organismo dispone de mecanismos reguladores que de diferentes maneras aceleran o retardan la
entrega o el retiro de glucosa desde o hacia los tejidos. Los mecanismos reguladores son nerviosos y
endocrinos y es muy posible que los primeros actan en realidad mediante modificaciones en la
entrega de hormonas por las glndulas de secrecin interna, de modo que el mantenimiento de la
glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la utilizacin de la glucosa sangunea; cuya
sensibilidad est regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las
hormonas suprarrenales y de la adenohipfisis por el otro.
La adrenalina, hormona secretada por la mdula suprarrenal, tiene accin hiperglicemiante; ello se
debe a que favorece la conversin del glucgeno en glucosa (glucogenlisis) en el hgado, adems de
actuar en el msculo, por la ausencia en este de la glucosa 6- fosfatasa, la glucogenlisis se realiza
con la formacin de lactato el que va ha contribuir directamente a la formacin de glucosa y
glucgeno en la clula heptica por los mecanismos gluconeogenticos. El efecto glucogenoltico de
la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa.
La secrecin de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia,
si aparece hipoglicemia se segrega ms adrenalina y glucagn que aceleran la regulacin que
espontneamente debe realizar el hgado.
La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variacin de
glicemia como consecuencia de la administracin de adrenalina.
V.
- Conejos adultos de ms de 2 kg. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas.
- Solucin de adrenalina: 0.1 mg/ml.
- Jeringas hipodrmicas de 2,5 cc. 5,0 cc.
- Reactivo de glicemia enzimtica (GOD-PAP)
VI.

Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la
cantidad de adrenalina a inyectar.
Dosis de la solucin de adrenalina (0,1 mg/ml) inyectar 0,025 mg por cada kilogramo de peso
corporal que corresponde a 0,25 ml de la solucin a utilizar por kg de peso. Utilizar una jeringa
hipodrmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis.
EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINITRACION DE ADRENALINA.
Extraer una primera muestra de sangre por puncin cardaca y transferirla a un tubo de ensayo de
13x100 mm. Servir para establecer los valores basales de glicemia.
Inyectar por va subcutnea la cantidad calculada de adrenalina.
Luego extraer muestras de sangre a los 15, 30 y 60 minutos despus de inyectada la adrenalina,
lo que hace un total de tres muestras en una hora.
Centrifugar las muestras a 1500 rpm x 10 minutos; separar el suero.
Con cada una de las citadas muestras de suero realizar la determinacin de glucosa segn el
mtodo de la glucosa oxidasa.
DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE DE LOS ANIMALES TRATADOS CON ADRENALINA.

Utilizar 4 tubos de ensayo: Bco. (Blanco), Prob 15 min, prob 30 min., prob 60 min.
21
COMPONENTES Bco
Basal
Muestra basal
----20 ul.
Muestra 15 min
--------Reactivo de trabajo. 2 ml
2 ml.
15 min
-----20 ul
----------2 ml.
30 min
--------20 ul
----2 ml.
60 min.
------------20 ul.
2 ml.

Clculo de los resultados :
Glucosa prob. (g/l) = abs prob x f
Anotar los resultados en relacin al tiempo.
- Hacer una grfica de glicemia vs tiempo
II.
CUESTIONARIO:
1.
Explique usted brevemente la regulacin de la glicemia, como resultado, en trminos generales,

de la tasa de llegada e ndice de salida de glucosa de la sangre.
2.
Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia; con especial referencia
al metabolismo de los carbohidratos.
3.
Cul es el efecto metablico de la adrenalina sobre el hgado y sobre el tejido muscular y qu

efecto produce sobre la glicemia?
22
PRACTICA N 09
PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA
I.
INTRODUCCION:
La prueba de Tolerancia a la glucosa es un test que permite establecer la respuesta insulnica frente a un
estmulo fisiolgico por glucosa.
La rpida absorcin de glucosa desencadena la liberacin de insulina pre-formada en las clulas beta del
pncreas, en cantidad suficiente para cubrir las necesidades se aumenta la captacin de la glucosa por los
tejidos especialmente por el hgado en donde se utiliza y almacena como glucgeno.
La ingesta de glucosa es seguida de un aumento transitorio en el nivel de la glicemia, debido a que la
velocidad de absorcin intestinal excede a la capacidad del hgado y los tejidos para su utilizacin. En
sujeto normal, el nivel mximo de glucosa despus de la absorcin rara vez pasa de 150 mg/100 ml. El
organismo vuelve a ajustar el nivel de la glicemia, a los valores del estado de ayuno con un perodo de una
hora y media o dos horas y media de iniciada la prueba.
En condiciones normales de utilizacin de glucosa la elevacin y reajuste de la glicemia se aparta del
patrn normal teniendo estas variaciones valor diagnstico y pronstico.
A travs de la prueba, la orina de personas aparentemente sanas se presenta siempre libre de glucosa. La
desventaja de esta prueba es que incluye un factor que no guarda relacin con la respuesta insulnica, la
velocidad de absorcin a partir del tubo digestivo.
La finalidad del trabajo experimental es establecer la capacidad del organismo para manejar una dosis fija
de glucosa administrada por va oral en condiciones estndar.
II.
- Reactivos para glicemia por el Mtodo Enzimtico.
- Solucin de glucosa al 25 %
- Reactivos de Benedict.
III.
ACTIVIDADES INTRUCCIONALES : Procedimiento

- El paciente debe ser preparado para esta prueba, indicndole una dieta diaria que contenga 300
g. de Hidratos de carbono, durante los tres das anteriores de la prueba.
- En nios el perodo de ayuno vara: as, en nios menores de cuatro meses basta un ayuno de 4
horas, entre cuatro y ocho meses hacen falta 6 horas de ayuno y entre ocho meses y dos aos , 8
horas.
- 0btener una muestra de sangre y por miccin voluntaria recoger una muestra de orina del
paciente en ayunas (Basales).
- Administrar por va oral una solucin de glucosa al 25% (75 gr. en 300 ml), si se desea, puede
mejorarse el sabor de la solucin con jugo de limn.
- Extraer muestras de sangre a los 30, 60, 90 y 120 minutos.
- Colectar muestras de orina a los 60 y 120 minutos.
- Determinar la concentracin de glucosa en cada una de las muestras de sangre obtenidas,
conforme al mtodo Enzimtico.
- Determinar cualitativamente la presencia de glucosa en las muestras de orina con el reactivo
cualitativo de Benedict.
- En un papel milimtrado graficar los resultados obtenidos de glicemia en cada muestra, contra el
tiempo.
Durante la prueba, el paciente debe permanecer en estado de reposo y no debe fumar. La prueba
de tolerancia puede ser modificada por el ejercicio, fiebre, enfermedades agudas y estados post
traumticos.
CIFRAS NORMALES
La tolerancia normal de la glucosa y sus posibles variaciones se muestran en el siguiente cuadro:
Determinacin
Tiempo
Basal
Ayunas
IC.
30 min.
IIC.
1 hr.
IIIC.
2 hrs.
23
Glucosa sangre mg/dl 70- 110

Glucosa en orina
no hay
< 200
no hay
< 200
no hay
< 140
no hay
OBSERVACION: En caso de realizar esta prueba en nios, se recomienda la administracin de 1.75g por kilo
de peso.
IV.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Describa y explique usted el comportamiento de la curva de tolerancia a la glucosa, a los

30, 60, 90 y 120 minutos.
Qu efecto producir en la curva de tolerancia a la glucosa, un estado de tirotoxicosis y
en el Sndrome de mala absorcin intestinal?
Si a los 30 min. en la prueba de tolerancia a la glucosa usted obtiene una glicemia de 185
mg % Cmo explicara este hecho? Existira o no glucosuria?
Qu recomendaciones, sobre dieta y actividad fsica, indicara usted a un paciente al que
se le va a aplicar una prueba de tolerancia a la glucosa?
Diga cmo influye sobre la curva de tolerancia a la glucosa: algunos desrdenes
endocrinos y algunas drogas farmacolgicas. Diga as mismo cmo influye el embarazo.
En que casos indicar al paciente realizar una Prueba de Tolerancia a la glucosa?
Qu es el dintel renal a la glucosa?
Explique las relaciones que puede establecer entre los resultados de la curva de tolerancia
a la glucosa y la determinacin de glucosa en orina.
24
PRACTICA N 10
DETERMINACIN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA Y SU
DIFERENCIACIN DE OTRAS SUSTANCIAS REDUCTORAS EN ORINA
I.
INTRODUCCION:
En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azcares en orina. Sin embargo, es
posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0,5 y 1,5
g/l. Loa azcares forman ms o menos la dcima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que
su totalidad est constituda por glucosa.
La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados
proximales, y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina, pero cuando la glicemia supera los
180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se
supera la capacidad del rin para reabsorverla (dintel renal).
Cuando la capacidad de reabsorcin renal disminuye, la glucosa en orina aparece aunque sta se
encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes inspida). Por el contrario, cuando existe
insuficiencia renal (menor filtracin) no aparece glucosa en la orina aunque la concentracin de glucosa se
encuentra elevada por encima de 180 mg %.
En la orina, adems de glucosa, puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que
podemos sealar:
a) Otros azcares reductores: lactosa, fructosa, galactosa y pentosas.
b) Otros compuestos orgnicos: cido homogentsico, creatinina, cido rico, cido glucurnico, cido
ascrbico.
c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato, cloral, formaldehdo, etc.
Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza
para determinar glucosa en orina, pero como anotamos ste identifica a las sustancias con capacidad
reductora y por tanto es de carcter inespecfico.
La glucosa puede ser determinada de manera especfica utilizando como reactivo bsico la glucosa
oxidasa (mtodo enzimtico), de uso generalizado en clnica. La prueba est basada en que la glucosa
urinaria en presencia de oxgeno, por accin de la glucosa oxidasa produce cido glucurnico ms
perxido de hidrgeno. Este, en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) ms
agua.
La glucosa oxidasa, en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de ste 2 iones hidrgeno (2H+)
formando gluconolactona), el cual es hidratado a cido glucnico. Los iones hidrgeno removidos se
combinan con el oxgeno atmosfrico y forman perxido de hidrgeno (H2O2 ). El perxido de hidrgeno
en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul.
La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias
reductoras, utilizando un mtodo especfico a base de glucosa oxidasa y otro inespecfico en base al
reactivo de Benedict.
II.
III.
Reactivo de Benedict.
Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly).
Determinacin de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict.
1.
2.
3.
4.
5.
Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml.

Llevar al bao de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1
min.Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del lquido contenido en el tubo.
Agitar para evitar que el lquido se proyecte hacia fuera del tubo.
Agregar orina problema: 5 gotas.
Colocar en bao de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullicin por 1 min.
25
6.
Observar si hay cambio de color y precipitado. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo, la
reaccin demuestra la presencia de sustancias reductoras.
Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, realizamos la

siguiente determinacin con la misma muestra de orina.
Determinacin enzimtica de la glucosa en orina (Mtodo de la glucosa oxidasa). Procedimiento:

1.
2.
3.
IV.
Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recin emitida

contenida en un depsito de 5- 10 ml.
0bservar si a los 60 segundos, despus de humedecida la cinta, adquiere o no color azul.
Compare la intensidad de la coloracin azulada con una escala adjunta que representa
aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Diga usted qu resultados posibles se dara al tratar una muestra problema de orina, primero
con el reactivo de Benedict y luego por el mtodo de la glucosa oxidasa.
Qu presunciones planteara usted si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de
Benedict da resultado positivo, y sin embargo al ser tratada con el mtodo de la glucosa oxidasa
da negativo?
Explique usted por qu el reactivo de Benedict es inespecfico para determinar glucosa?
Ante una prueba positiva de glucosa en orina: Qu presunciones en relacin a la glicemia del
paciente podra usted plantear?
Diga usted el fundamento del reactivo de Benedict y de la glucosa oxidasa.
Diga Usted en que casos obtendra resultados falsos negativos utilizando la prueba de la glucosa
oxidasa?
26
III UNIDAD
METABOLISMO DE LIPIDOS
PRACTICA N 11
DEMOSTRACIN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION
EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIN DE LA LIPASA
PANCRETICA SOBRE LOS TRIGLICRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I.
INTRODUCCION:
Los triglicridos son los principales lpidos de la dieta. En el estmago ocurre la accin de la lipasa
gstrica y la licuefaccin de la masa de lpidos de los alimentos por contracciones peristlticas. La
principal digestin ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lpido y su velocidad depende
del rea de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento
peristltico del intestino combinado con la accin emulsificante de los cidos biliares. Los cidos biliares
son molculas amfipticas sintetizados por el hgado a partir del colesterol y secretados como
conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancretica (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrlisis de los
triglicridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto
con cidos grasos. La actividad enzimtica de la lipasa pancretica se incrementa grandemente cuando
contacta la interfase agua-lquido, un fenmeno conocido como activacin interfacial. La unin a la
interfase agua-lquido requiera la colipasa, una protena de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con
la lipasa pancretica (449 residuos), con cambios conformacionales que forma una superficie
hidrofbica y deja libre el centro activo. La alteracin en la digestin o absorcin de las grasas produce
esteatorrea
La finalidad de la prctica es demostrar la accin emulsificante de las sales biliares sobre las grasas
comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la accin de la lipasa pancretica sobre los
triglicridos y el efecto de las sales biliares.
II.
-
III.
Cloroformo
Aceite vegetal, de olivo
Solucin de sales biliares
Buffer fosfato 0.1M pH 8,0
Emulsificacin de aceite vegetal
Solucin de fenolftaleina (Solucin alcohlica)
NaOH 0.1N
PROCEDIMIENTO
Accin emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm.
COMPONENTES
Aceite de olivo(gotas)
Agua destilada (ml)
Cloroformo (ml)
Sales Biliares (ml)
Tubo 1
3
5
-
Agitar enrgicamente los tubos

Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos
Tubo 2
3
3
2
Tubo 3
3
2
-
27
Accin de la lipasa pancretica sobre los triglicridos y efecto de las sales biliares sobre la reaccin
enzimtica utilizando tubos de 20 25 x 150 mm.
COMPONENTES (ml) TUBOS
Emulsificacin de aceite vegetal
Solucin de sales biliares 1 %
Solucin de extracto pancretico 1 %
Agua destilada
II
2
2
2
3
III
3
2
2
2
IV
3
2
2
2
3
2
2
2
-
Mezclar los 4 tubos y llevar al bao mara a 37 C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando.
Al finalizar el tiempo de incubacin retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftalena.
Mezclar bien y luego realizar la titulacin.
TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo
de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparicin de un color rosado tenue persistente.
Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados.
Anotar los resultados para su interpretacin.
IV.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
Haga un esquema de la estructura de las sales biliares

Explique Ud. el mecanismo de accin de las sales biliares
Explique la accin de la lipasa y la colipasa
Cules son los productos de la accin de la lipasa pancretica sobre los triglicridos?
Cul sera el efecto de la falta de sales biliares?
28
PRACTICA N 12
IDENTIFICACIN Y DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS
EN ORINA
I.
INTRODUCCION:
La beta oxidacin de los cidos grasos en el hgado, a nivel mitocondrial, produce acetil CoA que ingresa al
Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la sntesis de cuerpos cetnicos (cetognesis). Estos son el cido
acetoactico, el cido beta hidroxibutrico y la acetona. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente
de energa en los tejidos extrahepticos como el corazn y el msculo esqueltico, incluyendo el cerebro
en el ayuno prolongado. Los cuerpos cetnicos son eliminados por la orina y la acetona tambin por la
respiracin.
Su concentracin normal en orina es de 125 mg/ 24 horas, y en sangre hasta 1mg/dl. Aumentan en sangre
(cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiolgicas como el ayuno prolongado, en 1a dieta
pobre en carbohidratos.. En condiciones patolgicas como la Diabetes mellitus, el hiperinsulinismo, en la
enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis, en los vmitos, en el sndrome de Fanconi, en toda
hipercatabolia como la fiebre, hipertiroidismo. En la Diabetes mellitus, el aumento de la liplisis, de la
beta oxidacin y de la cetognesis, al superar la capacidad de oxidacin de los tejidos extrahepticos lleva
a niveles aumentados de cuerpos cetnicos. Dado que stos son cidos se produce acidosis metablica, la
denominada cetoacidosis diabtica. El diagnstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su
determinacin en sangre y/u orina.
II.
REACTIVOS
- Sulfato de amonio, cristales.
- Nitroprusiato de sodio, solucin al 10% en H2O
- Cloruro Frrico, solucin al 5% en H2O.
III.
PROCEDIMIENTO
INVESTIGACION DE ACETONA
Prueba de Legal
El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetnicos, especialmente de acetona,
rinde un color azul violeta. Procedimiento:
COMPONENTES
TUBO
Orina
3 ml
Cristales de sulfato de amonio
0.5 g
Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio.
Nitroprusiato de sodio 10%
3 gotas
Amonaco (agregar lentamente por las paredes del tubo,
sin mezclar)
1ml
_________________________________________________________________________
Prueba de Rothera
Es otra variante, se hace utilizando nitroprusiato en polvo, de la siguiente manera:
En una lmina de porcelana con excavaciones colocar 0.2 g de reactivo slido de nitroprusiato de
sodio en cada excavacin. Diluir la orina al 1/10, 1/20, 1/30, etc. Agregar una gota de cada una de
las diluciones en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo. Observa la mxima dilucin
de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar el denominador de la dilucin
alcanzada por 10 y se tendr la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml.
Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reaccin positiva solo cuando en la orina
sin diluir alcanza la concentracin mnima de 10 mg% de acetona y por eso, para calcular la
concentracin en orina diluida, se debe multiplicar por 10 el nmero de veces que se ha diluido
sta.
29
Este mtodo con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguneo, para investigar acetona y
tener una cifra aproximada en su cuanta.
Uso de tira reactiva. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. Esperar 20 segundos, leer en
escala colorimtrico, estimando la concentracin como negativo, 5, 15, 50, 150 mg/dl.
INVESTIGACIN DE ACIDO ACETOACETICO

Prueba de Cloruro Frrico o de Gerhart. Se basa en que en presencia de cloruro frrico, el cido
acetoactico rinde una coloracin rojo burdeos.
Procedimiento (Se utiliza orina filtrada):
COMPONENTES
Orina filtrada
Cloruro Frrico, solucin 5% en agua
IV.
TUBO
5 ml
gota a gota hasta la aparicin del
Color rojo burdeos si existe cido
Acetoactico
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
Hacer un esquema de la sntesis y degradacin de los cuerpos cetnicos

Importancia energtica de los cuerpos cetnicos
Causas de aumento de los cuerpos cetnicos
Mtodos para la determinacin de los cuerpos cetnicos
Importancia de la cuantificacin de los cuerpos cetnicos
30
PRACTICA N 14
DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO
I.
INTRODUCCION:
El colesterol es un componente importante de las biomembranas, regulando su fluidez. A partir de l se
forman los cidos biliares y las hormonas esteroideas. Es transportado principalmente por la LDL que es
considerada aterognica, y el resto en la VLDL y HDL. Los triglicridos an ayunas circulan unidas a las
VLDL.y son fuente de energa para los tejidos., su incremento tambin es considerado factor de riesgo
coronario. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol.de los tejidos hacia el hgado y es
considerada antiaterognica .El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el
colesterol, el HDL, y el LDL. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl, limtrofe alto
200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). El HDL colesterol, 3 niveles: Bajo o de
riesgo < 40, normal a 40 a 59, alto o protector mayor o igual a 60. El LDL colesterol, 5 niveles: ptimo <
100 mg/dl, En los triglicridos se considera: normal menos de 150mg/dl, limtrofe de 150 a 199,
Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499, severa 500 o ms
La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. Entre las hipercolesterolemias
primarias se sealan: La hipercolesterolemia familiar, la hipercolesterolemia polignica, la
hiperlipidemia familiar combinada, la disbetalipoproteinemia. Entre las secundarias: La diabetes, el
lipoteroidismo, el sndrome nefrtico, ictericia obstructiva, cirrosis biliar.. La hipertrigliceridemia puede
deberse a causa primarias o familiares, o secunadrias a otras enfermedades. Son hipertrigliceridemias
primarias, la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia, l ahipertrigliceridemia familiar.
Son causas secundarias: la diabetes, el hipotiroidismo, la gota, el alcoholismo, el uso de anticonceptivos
orales, etc.. La hipertrigliceridemia se asocia a disminucin de HDL, obesidad central, resistencia a la
insulina, hiperglicemia e hipertensin, en el denominado sndrome metablico.
En la presente prctica, se realizar la determinacin de colesterol sanguneo, por el mtodo enzimtico
y la determinacin de HDL, previa precipitacin de las otras lipoprotenas.
II.
REACTIVOS:
- Reactivo enzimtico para la determinacin de colesterol.
- Reactivo precipitante de HDL.
- Reactivo enzimtico pra la determinacin de triglicridos
III.
PROCEDIMIENTO
DETERMINACIN DE COLESTEROL SANGUNEO
Armar el siguiente sistema: utilizando tubos de 15 x 125 mm.
Componente
Suero
Estndar 200 mg/dl
Reactivo enzimtico
Blanco
Problema
10 ul
1 ml
1 ml
Incubar a 37 por 10 min.

Leer las absorbancias a 505 nm. en fotocolormetro.
Restar el blanco tanto a los tubos problema como al estandar.
Luego calcular el Factor (F):
200 mg/dl
F = -----------------------------Absorbancia del standar
Problema (mg/dl) = F (Absorbancia de la muestra problema)
Estndar
10 ul
1 ml
31
DETERMINACIN DE HDL-COLESTEROL (HUMAN)

En un tubo de prueba medir 0.50 ml de reactivo precipitante y agregar 0.25 ml de muestra de
suero. Mezclar y esperar 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 15 minutos a 3000
rpm. Usar el sobrenadante lmpido como muestra de la siguiente forma:
Sobrenadante
Reactivo de trabajo
100 ul
1 ml
Mezclar e incubar 10 minutos a 37C. Retirar del bao y enfriar. Leer en espectrofotmetro a 505
nm.
CALCULOS:
HDL Colesterol (mg/dl) = Absorbancia Desconocido x 180

DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS
Componentes
Suero
Estndar
Reactivo enzimtico
blanco
problema
10ul
1ml
1ml
Estndar
10ul
1ml
Incubar a 37 por 5 min.

Leer las absorbancias a 505 nm. en fotocolormetro.
Restar el blanco tanto a los tubos problema como al estandar.
Luego calcular el Factor (F):
200 mg/dl
F = -------------------------------Absorbancia del standard
Problema (mg/dl) = F (Absorbancia de la muestra problema)

DETERMINACIN DEL LDL
Aplicar la frmula de Friedwald:
LDL = Colesterol Total ( HDL + TG/5 )
IV.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Seale la importancia del colesterol.

Seale los valores de referencia del Colesterol, HDL-Colesterol y LDL-Colesterol.
Causas de hipercolesterolemia.
Importancia del HDL como antiaterognico.
Importancia de la LDL como aterognico.
Haga un esquema de la estructura de los triglicridos.
Causas de hipertrigliceridemia.
Explique por qu la hipertrigliceridemia es un factor de riesgo coronario
32
IV UNIDAD
PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO
PRACTICA N 15
DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS

PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA
I.
INTRODUCCION:
La digestin de la protena, o degradacin hasta aminocidos en el tubo digestivo, es un proceso
complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteoltica Entre estas enzimas
proteoliticas tenemos: a) de origen gstrico: pepsina y renina; b) de origen pancretico: tripsina,
quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; c) de origen intestinal: aminopeptidasas, dipeptidasas. Son
endopeptidasas: pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y
aminopeptidasa. La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y es especifica de los enlaces
peptidicos sobre el lado carboxlico de residuos de aminocidos bsicos: lisina y arginina solamente. La
quimotripsina es especfica para los enlaces peptidicos de los aminocidos sin carga como los aromticos:
tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una especificidad amplia, ataca a los residuos
pequeos, como la glicina, alanina y serina. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptdico
carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas.
La falta de enzimas proteolticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las
heces, que provienen de la carne de los alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados
en las heces). En el lactante con ausencia congnita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de
activacin de quimotripsingeno y procarboxipeptidasa, existe hipoproteinemia, con retardo marcado del
crecimiento.
La presente prctica tiene como finalidad demostrar la accin hidroltica de las enzimas digestivas
contenidas en el pncreas sobre la casena o protena de la leche, determinando los productos
(aminocidos) con ninhidrina
II.
REACTIVOS.
-
III.
Casena al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8.0

Buffer fosfato 0,1 M pH 8.0
Solucin de extracto pancretico.
Solucin acuosa de ninhidrinan al 0,25% saturada con butanol.
Acido tricloroactico al 10%.
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

COMPONENTES (ml)
Casena al 1%
Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0
Solucin de extracto pancretico
Agua destilada
II
III
1
1
1
---
1
1
--1
--1
1
1
Pasos:
* Mezclar y colocar al bao de agua a 37C por 30 minutos.
33
*
*
*
*
*
*
IV.
Despus del tiempo de incubado tomar alcuotas de 0,5 ml, de cada uno de los tubos de
incubacin y trasladarlos a otro sistema numerado (I, II, III).
A cada uno de los tubos del paso anterior agregar 1 ml de solucin de ninhidrina.
Mezclar y llevar a un bao de agua hirviendo (franca ebullicin), durante 3 a 5 minutos.
Observa los cambios de color de cada tubo.
A los tubos de incubacin agregue gota a gota 1 ml de cido tricloactico al 10% agitando
continuamente.
Observe las variaciones que se produce en cada tubo.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
Seale las enzimas digestivas pancreticas y los sustratos sobre los cules acta.
Cmo se explica los cambios de color, despus de la reaccin con ninhidrina en un sistema donde
se produce digestin de las protenas?
Qu efecto tiene el cido tricloroactico sobre las protenas? Qu variaciones se obtienen en un
sistema de digestin de protenas, despus de agregar cido tricloroactico?
34
PRACTICA N 16
CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS
I. INTRODUCCION:
Las protenas plasmticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones:
coagulacin, excrecin, conservacin del equilibrio cido bsico, regulacin del equilibrio hdrico, defensa
contra las infecciones, transporte, regulacin del metabolismo, etc. El origen de las protenas plasmticas es
heptico con excepcin de las globulinas gamma que se forman en las clulas plasmticas. Las protenas
plasmticas por mtodos qumicos se clasifican en albmina, globulina y fibringeno. En el suero solo se
encuentran albmina y globulina. Las fracciones globulnicas contienen varias protenas especficas:
inmunoglobulinas, haptoglobina, la transferrina, ceruloplasmina, etc.; que se pueden determinar por
electroforesis, inmunodifusin o inmunoelectroforesis. La concentracin srica de las protenas totales es de
6.1 a 7.9 g/dl de las cuales albmina es: 3.5 a 4.8 g/dl y globulinas: 2.6 a 3.1 g/dl.
Las cifras de protenas plasmticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en
la hemoconcentracin; con inversin de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma mltiple, en la
macroglobulinemia de Waldenstrm, en el kala-azar, en las colagenopatas, etc La disminucin de protenas
totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez estn
acompaadas con pequeos cambios en las globulinas. Los bajos niveles de albmina pueden ser debidos a:
incrementadas prdidas de albmina en la orina, disminucin de la formacin en el hgado como en la
cirrosis, insuficiente ingestin de protena., en la gastroenteropata exudativa con prdidas fecales de
protenas. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros.
La presente prctica tiene por finalidad determinar las concentraciones sricas de protenas totales y
fraccionadas en personas normales y/o con procesos patolgicos, por el mtodo colorimtrico.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Determinacin de Protenas Totales:
Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico, en medio alcalino, para dar un
complejo color violeta con mximo de absorcin a 540nm., cuya intensidad es proporcional a la
concentracin de protenas totales en la muestra.
Determinacin de Albmina:
La albmina reacciona especficamente sin separacin previa con la forma aninica de la bromocresolsulfon
ftaleina (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8.
El aumento de absorbancia a 625 nm, respecto del Blanco del reactivo, es proporcional a la cantidad de
albmina presente en la muestra.
II.
REACTIVOS A UTILIZAR. (WIENER)

-
III.
Reactivo EDTA/Cu
Reactivo Bromocresol verde.

Determinacin de Protenas Totales
CONDICIONES DE REACCIN
- Longitud de onda: 540nm en espectrofotmetro
- Temperatura de reaccin: 37C.
- Tiempo de reaccin: 15 minutos.
- Volumen de muestra: 10 ul.
35
Volumen de Reactivo Biuret: 1.0ml.

Volumen final de reaccin: 1,1 ml.
PROCEDIMIENTO I (Laboratorio Wiener) :

En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
B
1,0 ml.
Suero Patrn
Muestra
Reactivo Biuret
S
10 ul
1,0 ml.
D
10 ul.
1,0 ml.
Mezclar e incubar 10 minutos a 37C. Leer en espectrofotmetro a 540 nm. En fotocolorimetro

con filtro verde (520-560 nm) llevando a cero con el Blanco de Reactivo.
PROCEDIMIENTO II (Laboratorio Linear Chemicals)
En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
B
1,0 ml.
Suero Patrn
Muestra
Reactivo Biuret
S
20 ul
1,0 ml.
D
20 ul.
1,0 ml.
Mezclar e incubar 10 minutos a 37C. Leer en espectrofotmetro a 540 nm. En fotocolorimetro

con filtro verde (520-560 nm) llevando a cero con el Blanco de Reactivo.
Determinacin de Albmina.
CONDICIONES DE REACCIN:
- Longitud de onda: 620 nm. en Espectrofotmetro
- Temperatura de reaccin: 15-28C.
- Tiempo de reaccin: 5 minutos.
- Volumen de muestra: 10 ul.
- Volumen de Reactivo BCG: 3.5 ml.
- Volumen final de reaccin: 3.51 ml.
PROCEDIMIENTO (Laboratorio Wiener):
En tres tubos de ensayo marcados B(Blanco) S (Standard) y D (Desconocido), colocar:
B
Suero Patrn
Muestra
Reactivo BCG
3.5ml.
S
10 ul
3.5 ml.
D
10 ul.
3.5 ml.
Mezclar, mantener los tubos entre 15 y 28C durante 5 minutos. Leer en espectrofotmetro a 620
nm llevando a cero con el blanco de reactivo.
CALCULOS DE LOS RESULTADOS:

Protenas Totales (g/dl) = (D - B) x F
Albmina: (g/dl) = (D - B) x F
Globulina: = Prot. Totales Albmina
Relacin A/G =
Albmina (g/dl) .
36
PT (g/dl) Alb. (g/dl)

IV.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
Qu importancia clnica tiene la determinacin de las protenas sricas totales y las fracciones
albmina y globulinas?
Qu importancia tiene determinar la relacin albmina/ globulina, en clnica?
En qu se basa la determinacin de las protenas totales y fraccionadas en nuestro
experimento?
Qu importancia clnica tiene el diverso origen de las protenas sricas?
Qu presunciones diagnsticas de laboratorio planteara usted en base a sus resultados
obtenidos?
37
PRACTICA N 17
DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE LAS PROTEINAS EN ORINA
I.
INTRODUCCION:
La orina normal contiene una pequea cantidad de protenas solubles (albminas, algunas enzimas, etc.);
la cantidad es pequea alcanzando mximo de 150 mg en orina de 24 horas, es decir, menos de 10 mg/dl.
Las protenas son casi completamente absorbidas en los tbulos.
Cuando el glomrulo es injuriado por enfermedad, molculas proteicas de variado tamao incluyendo las
ms largas, escapan en el filtrado de forma que los tbulos son incapaces de captar la gran cantidad de
protenas y resulta una masiva proteinuria. Las protenas de peso molecular relativamente bajo y de
pequeo tamao pasan primero a travs de los glomrulos injuriados, por ejemplo la protena de Bence
Jones, hemoglobina, albmina; luego las globulinas.
La proteinuria puede ser renal o extrarremal. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa,
glomerulonefritis focales proliferativas, sndrome nefrtico, nefropata diabtica, nefropata lpica,
nefropata txica, en la eclampsia, tuberculosis renal, rin poliqustico etc . Extrarrenal: proteinuria
ortosttica, gravdica, febril, mieloma mltiple. La proteinuria fisiolgica (proteinuria ortstatica) se
presenta despus de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posicin de pie, sin que exista evidencia
de lesin renal. En el mieloma mltiple y macroglubinemia de Waldestrom, aparece la protena de Bence
Jones. La protena de Bence Jones est constituda por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que
constituye la protena Monoclonal.
La presente prctica tiene por finalidad determinar la presencia de protenas en la orina y de
cuantificarlas en caso que estn presentes en casos normales y en estados patolgicos.
II.
REACTIVOS A UTILIZAR.
-
III.
Acido tricloroactico, 12,5% (en agua destilada)

Cloruro de sodio 0,85%.
Standard de protena: Pueden usarse suero claro normal de concentracin conocido o un suero
control adquirido comercialmente. Se diluye con cloruro de sodio 0,85% a una concentracin final de
25 mg/ml. Esta dilucin debe ser preparada el mismo da.
Acido actico al 2%.

DETERMINACIN CUALITATIVA DE LAS PROTENAS EN ORINA:
Coagulacin por el calor.
COMPONENTE (ml)
TUBO
Orina previamente a filtrada
5,0
Someter a ebullicin. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la
presencia de protenas o fosfatos. Aadir:
Solucin de cido actico al 2%
IV gotas
Si desaparece la turbidez, se trata de fosfatos que se han disuelto en medio cido. Si la
turbidez desaparece o se ha hecho ms intenso o se forma un precipitado, se trata de
protenas.
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS EN LA ORINA:

Mtodo turbidimtrico de Heavy.
38
En tres tubos marcados previamente agregar:

COMPONENTES (ml)
/TUBOS
Solucin standard de protena
Orina previamente filtrada
Agua destilada
Acido tricloroactico 12,5%
I
4,0
4,0
1,0
II
1,0
III
4,0
1,0
Dejar reposar 5 a 10 min. y leer en fotocolormetroa 420 nm). Leer el standard (I) calibrando con
agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III).
NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire
puedan interferir con la lectura.
CALCULO:
Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml
entonces:
Calcular de la siguiente manera:
Absorbancia problema Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. orina
Absorbancia del standard
Volumen total en ml orina
------------------------------------ = protena total de orina de 24 H en mg.
mg/100 ml orina x 100
IV.
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
Cmo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no corresponde a protenas en

orina?
Seale algunos tipos de protenas anormales que pueden ser encontradas en la orina.
En qu consiste el mtodo de Heavy para la determinacin de protenas
Seale algunas causas de proteinuria fisiolgica y patolgica.
39
PRACTICA N 18
DETERMINACION DE HEMOGLOBINA
I.
INTRODUCCION:
La hemoglobina es una hemoprotena, tetramrica, con dos 2 subunidades alfa y 2 beta, cuya funcin es
el transporte de oxgeno. Se sintetiza en la mdula sea por una va comn a la sntesis de porfirinas,
que termina con la adicin del hierro por la ferroquelatasa. La concentracin normal es de 12 a 16 g/dl
en mujeres y de 14 a 18 g/dl en varones en nuestro medio y al nivel del mar. El defecto enzimtico en
algunas de las etapas de sntesis del grupo Hemo, da lugar a las diferentes tipos de porfirias. La
disminucin de su sntesis de la hemoglobina, por diferentes causas, produce disminucin de su
concentracin dando lugar a la anemia por menor produccin como en la anemia ferropnica, que
tambin puede deberse a problemas en la maduracin de los glbulos rojos como la deficiencia de cido
flico. Pero la hemoglobina puede tambin disminur por prdida de sangre como en las hemorragias o
por hemlisis (anemias hemolticas). En este ltimo grupo, una causa pueden ser las hemoglobinopatas
por defecto sea en la sntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una
de las subunidades por mutaciones que cambian un aminocido por otro como en la hemoglobina S. En
la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su sntesis llevando a la policitemia, que
puede tener tambin otras causas como la Policitemia Vera
La OMS basa su definicin de anemia en la concentracin de hemoglobina, de modo que en mujeres se
considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones menor de 14 g/dl, en nios existe variacin con la
edad.
En la prctica mdica es por ello importante determinar la concentracin de la hemoglobina, que es sin
duda uno de los exmenes ms solicitados
II.
REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS

Cianometahemoglobina
tubos de vidrio
lancetas
pipetas
III.
ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES
Armar el sgte sistema
Componentes
Tubo blanco
Estndar
Problema
Reactivo de
Cianometahemoglobina
5 ml
5 ml
5ml
Estndar
------
20 ul
---
Muestra
-------
--------
20 ul
Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente y leer a 540 nm en espectrofotmetro contra el

blanco
Determinar el factor
F = concentracin del estndar / lectura del estndar
Determinar la concentracin de la muestra:
Lectura problema x F
IV.
CUESTIONARIO:
1. Haga un esquema de la sntesis de la hemoglobina sealando los defectos enzimticos y los tipos
de porfirias
40
2. Cul es el criterio aceptado para la defincin de anemia?

3. Qu tipos de anemias conoce?
4. Cul es la anemia ms frecuente?
5. Seale algunas hemoglobinas anormales indicando el cambio de aminocido y la cadena
en que se produce
PRACTICA N 19
DETERMINACION DE BILIRRUBINA
I.
INTRODUCCION:
Los hemates tienen una vida media de 120 das, al cabo de la cual son destruidos en el sistema retculo
endotelial. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem, ste es convertido en biliverdina y
luego en bilirrubina. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albmina. La bilirrubina
indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albmina, despus de un proceso de
captacin y conjugacin con dos molculas de cido glucurnico por la enzima bilirrubina glucuronil
transferasa, se convierte en una forma soluble, denominada bilirrubina directa o conjugada, que es
finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo; da color a las heces y
ultrafiltra el glomrulo. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. La
concentracin sangunea de bilirrubina total es de 1 mg / dl, siendo en su mayora bilirrubina indirecta,
que no se excreta por orina. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada
como en las anemias hemolticas o en los defectos congnitos de conjugacin, o de la bilirrubina
conjugada en las hepatopatas, donde el defecto limitante es la excrecin, o en las enfermedades
extrahepticas obstructivas.
La manifestacin clnica ms importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia, y el origen de esta
alteracin obedece a causas de origen pre heptico, heptico y post heptico, que varan con la edad de
presentacin y tambin en cuanto a su gravedad
La bilirrubina directa da una reaccin inmediata con el diazorreactivo; la indirecta, slo reacciona despus
de agregar alcohol a la mezcla. La finalidad de la presente prctica es determinar la concentracin total de
las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia, por el mtodo de
Malloy Evelyn, que utiliza el diazorreactivo de Erlich
II.
REACTIVOS
- Desarrollador o solvente
- Reactivo sulfanlico
- Nitrito de Sodio
- Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanlico. Rotular y
fechar.
III.
ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento

Armar el sgte sistema:
COMPONENTES
Muestra de Suero
Agua destilada
Desarrollador
R. Sulfanlico
Diazorreactivo
Blanco
200 ul
2,5 ml
--200 ul
---
Bilirrubina Directa
200 ul
2,5 ml
----200 ul
Bilirrubina Total
200 ul
2,5 ml
--200 ul
Mezclar de inmediato por inversin y leer a los 5 minutos a 540 nm en un espectrofotmetro

CALCULOS:
Bilirrubina total (mg/L) = (Abs. B. total - Abs. Bco) x F
Bilirrubina Directa (mg/L) = Abs. B. Directa - Abs Bco.) x F
41
Bilirrubina Libre (indirecta) = B. total - B. Directa

IV.
CUESTIONARIO:
1. Haga un esquema del metabolismo de la bilirrubina
2. Cules son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada?
3. Cules son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada?
4. Por qu se denomina bilirrubina directa?
5. Cul es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recin nacido?
PRACTICA N 20
DETERMINACION DE CREATININA SERICA Y URINARIA
I.
INTRODUCCION:
La creatina, precursora de la creatinina, aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por sntesis,
aunque una pequea cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. La creatina fosfato se forma en
los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energa en la contraccin muscular.
Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente; la cantidad
total depende de la masa muscular. La creatinina es fcilmente difusible y es igualmente distribuida en el
agua corporal. Es excretada fundamentalmente por el rin el cual clarifica el plasma de creatinina. La
concentracin de creatinina en suero no es afectada por la dieta, catabolismo de protenas, edad, sexo o
ejercicios. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la funcin renal est muy alterada y
aunque el mismo tipo de informacin acerca del diagnstico y pronstico se obtiene por la determinacin
de nitrgeno ureico o creatinina, esta ltima determinacin se prefiere porque proporciona mayor
informacin relacionada con el estado de la funcin renal, ya que los niveles de creatinina srica
dependen del grado de excrecin, siendo la produccin endgena constante.
El suero es depurado de creatinina en el rin por filtracin glomerular proporcionando una buena base
para el test de clearance. La concentracin normal en suero vara de 0,5 a 1,4 mg /100 ml. El clearence de
creatinina normal es mayor de 100 ml / min.
La determinacin de creatinina tiene utilidad en la prctica mdica para la evaluacin de la funcin renal,
la cual puede alterarse por diversas causas; las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la
insuficiencia cardaca; renal, como las glomerulonefritis o la nefropata diabtica o post renal, como las
uropatas obstructivas
La creatinina en medio alcalino reacciona con el cido pcrico para dar un tautmero de picrato de
creatinina de color anaranjado (reaccin de Jaffe). La determinacin de hace de ordinario en un filtrado
libre de protenas obtenido a partir del suero. Usando mtodos enzimticos para determinar
especficamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reaccin de Jaffe en personas
normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente
un 90% del total, mientras que en eritrocitos slo corresponde a un 40%. Esto, hace remarcable la
necesidad de usar suero y no sangre total para la determinacin de creatinina por el mtodo
colorimtrico.
La creatinina es un constituyente habitual de la orina, y es excretada en una cantidad casi constante, las
variaciones fluctan entre 0, 9 - 1, 5 g / 24hs. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino
generalmente es ms grande que en las de sexo femenino. La creatinina urinaria disminuye en la
insuficiencia renal y es til para medir el grado de filtracin glomerular y lo poco que es transferido a
travs de las clulas tubulares. La creatininuria es determinada mediante el mtodo colorimtrico.
II.
- Reactivo 1: Acido pcrico 41,4 mmol/l
- Reactivo 2: Buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.
- Standard: Solucin de creatinina 20 mg/l.
III.

PROCEDIMIENTO
42
En caso de que la muestra a utilizar sea en suero, debe efectuarse una desproteinizacin de la siguiente
manera: a 0,4 ml de suero agregar 2,0 ml de Reactivo 1. Mezclar por inversin. Dejar reposar 10 minutos
y centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos como mnimo.
En tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco), S (Standard), DS y Do (Desconocidos suero y orina),
colocar:
COMPONENTES
B
S
DS
Do
Desproteinizado
Standard
Orina diluida (1:50)
Agua destilada
Reactivo 1
Reactivo 2
0,5 ml
1 ml
0,25 ml
0,25ml
0,25 ml.
1 ml
0,25 ml
1,5 ml.
0,25 ml
0,25ml
0,25ml
1 ml
0,25ml
Mezclar por inversin. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Luego leer en espectrofotmetro a
510 nm o en fotocolorimetro con filtro verde (500-540 nm), llevando a cero el aparato con agua
destilada.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL.
El color de la reaccin es estable durante 10

minutos por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de ese lapso. El Blanco y el Standard pueden
leerse hasta los 60 minutos.
CALCULO DE LOS RESULTADOS.
Corregir las lecturas S y D restndoles el Blanco (B).
Creatinina en suero (mg/l) = DS
20 mg/l
F = -------------------S
Creatinina en orina (g/24 h.) = Do x 0,020 g/l x 50 x V
S
Donde:
0,020 g/l = concentracin del Standard
50 = factor de dilucin
V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas
Depuracin de creatinina Endgena (D.C.E.):
D.C.E. ml/min = Creatinina en orina (g/24 hs) x 694 ml/min
Creatinina en suero (mg/l)
Donde:
694 ml/min = g/24 hs
mg/l
IV.
= 1000 mg x 1000 ml = 1.000.000 ml

1 mg x 1440 min
1440 min
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
Qu informacin o presuncin obtiene al dosar la creatinina srica?

Por qu se prefiere la determinacin de creatinina urinaria a la de nitrgeno ureico?
Por qu se prefiere suero y no sangre total para la determinacin de creatinina?
Metablicamente Qu expresa una concentracin srica de creatinina?
Qu importancia tiene, determinar el clearence de creatinina?
43
PRACTICA N 21
CUANTIFICACION DE LA CONCENTRACION DE UREA EN SANGRE
I.
INTRODUCCION:
La urea es sintetizada en el hgado, es el principal producto final del catabolismo de las protenas y se
distribuye en todos los tejidos. Normalmente no tiene funcin til en el organismo, es excretado casi
enteramente por los riones. La urea en el plasma es filtrada por los glomrulos renales, pero en
condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa por difusin a la sangre. La
importancia clnica de la urea viene del hecho de una elevada concentracin sangunea puede estar
asociada con una mala funcin renal. El grado de azoemia depende de la extensin y tipo de lesin renal.
La concentracin de la urea en la corriente sangunea es el resultado del balance entre el grado de
degradacin de las protenas y el grado de eliminacin por los riones.
Los valores normales de urea en suero (como nitrgeno ureico sanguneo o BUN) es de 9 19 mg/100 ml.
Las concentraciones de urea en sangre total, suero o plasma, son muy similares. La uremia es
determinada colorimtricamente por el uso de ureasa. Este mtodo es altamente especfico y aunque
est basado en reacciones de urea, es convencionalmente reportado como nitrgeno ureico. Los valores
de urea se reportan siguiendo la siguiente frmula:
Nitrgeno ureico sanguneo x 2,14 = UREA
En sentido inverso, conociendo los valores de urea, se informa el BUN segn la siguiente frmula:
Urea x 0,4665 = Nitrgeno ureico sanguneo
Los riones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea.
La ureasa descompone especficamente a la urea produciendo dixido de carbono y amoniaco; ste
reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina
colorimtricamente.
Cuando el nitrgeno ureico es determinado por el mtodo de la ureasa, sta transforma a la urea en
carbonato de amonio y con la adicin del reactivo de Nessler el amonaco liberado forma un compuesto
de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolormetro. La finalidad de la presente prctica
es cuantificar la uremia por el mtodo de la ureasa, en personas normales y / o con procesos patolgicos.
II.
III.
- Reactivo 1: Reactivo desecado conteniendo fenol, nitroferricianuro de sodio.

- Reactivo 2: Reactivo concentrado de hipoclorito de sodio e hidrxido de sodio.
- Standard: Solucin de rea 0.60 g/l.
- Ureasa: Solucin estabilizada y tamponada.
ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES:
PROCEDIMIENTO
TECNICA EN SUERO O PLASMA
En tres tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco), S (standard) y D (Desconocido) colocar una o
dos gotas de agua y agregar:
COMPONENTES
B
S
Standard
20 ul
Suero o Plasma
Ureasa
1 gota
1 gota
Mezclar por agitacin suave e incubar 5 minutos a 37C. Luego agregar:
Reactivo 1
1 ml
1 ml
Reactivo 2
1 ml
1 ml
Mezclar por agitacin suave e incubar 5 minutos a 37C. Luego agregar:
Agua destilada
10 ml.
10 ml.
Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 10 minutos leer en
D
20 ul.
1 gota
1 ml
1 ml
10 ml.
44
fotocolormetro con filtro verde (510-550nm) o en espectrofotmetro a 540 nm,

llevando a cero con el Blanco.
CALCULOS:
Urea (g/l) = (Abs. Desconocido - Abs. Blanco) x F
Donde:
IV.
0,60 g/l
F = --------------------------------------Abs. Standard - Abs. Blanco
CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Qu importancia clnica tiene para usted, conocer las concentraciones sricas de rea?
Qu influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentracin srica de rea?
En relacin a las concentraciones sricas de rea y NH4+. Seale las caractersticas comunes
que se encuentran en los efectos enzimticos hereditarios del ciclo de la rea.
Qu alteraciones en las concentraciones sricas de rea y NH4+ podran encontrarse en el
coma heptico?
Cul es la importancia metablica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hgado de los
seres humanos?
Cul es la importancia metablica que en el hgado humano exista una relacin entre el ciclo
de los cidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina?
45
PRACTICA N 22
EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTNICAS E HIPOTNICAS SOBRE LAS
MEMBRANAS CELULARES
I.
INTRODUCCION:
La membrana de los eritrocitos es semipermeable. Cuando estos son colocadas en una solucin
hipertnica pierden liquido arrugndose y destruyendose hasta que se establece el equilibrio osmtico
con el liquido circulante. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solucin hipotnica
aceptan liquido (hinchndose) hasta que se alcanza el equilibrio osmtico o hasta que se rompen. Sin
embargo en ciertas anemias hemolticas adquiridas, la resistencia de los eritrocitos a las soluciones
hipotnicas disminuye. Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las clulas resulta de la
alteracin de su forma y disminucin de su resistencia a las fuerzas osmticas ms que a un cambio en la
composicin de la clula o su osmolaridad, de all que se emplee el trmino de fragilidad. Las clulas
esferociticas se rompen ms rpidamente que las dems y de hecho la prueba de la fragilidad osmtica
puede ser considerada como un ndice ms sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en
solucin hipotnica, es observada en la talasemia, anemia falciforme y en la anemia hipocrnica
ordinaria (ferropnica).
Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible
comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de
hipotonicidad, lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmtica de los eritrocitos (0,5 - 0,3%).
La presente prctica tiene la finalidad: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio
extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos, cuando estos son puestos en
soluciones hipertnica e hipotnica respectivamente.
Demostrar la fragilidad osmtica de los eritrocitos cuando stos son colocados en diversas soluciones
de CINa de diversas concentraciones.
II.
EXPERIMENTO N1
- NaCl al 4,5%
- NaCl al 15%.
- NaCl al 8,5%
EXPERIMENTO N2
- Solucin salina amortiguada concentrada 10%.
- Cloruro de sodio (180 g).
- Na2P04 (27,31 g).
- NaH2 PO4.2H2O (4,86 g).
Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0 C (dura varios meses).
- Heparina
III.

FRAGILIDAD OSMTICA DE LOS ERITROCITOS:
PRECAUCIONES:
La muestra de sangre debe ser obtenida con un mnimo de estancamiento y de trauma.
La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible despus de tomada.
Utilizar heparina como anticoagulante de eleccin. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos
que comprende la adicin de sales osmticamente activas son indeseables.
Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas, no deben hacer
46
contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar hemlisis.
PREPARACIN DE LAS DILUCIONES
Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba:
1. Conviene preparar una solucin al 1% a partir de la solucin concentrada al 10% y armar la
siguiente serie de tubos:
N de
NaCl al 1%
Agua destilada
% de NaCl
tubo
(ml)
(ml)
1
0.50
4.50
0.10
2
1.00
4.00
0.20
3
1.50
3.50
0.30
4
1.75
3.25
0.35
5
2.00
3.00
0.40
6
2.25
2.75
0.45
7
2.50
2.50
0.50
8
2.75
2.25
0.55
9
3.00
2.00
0.60
10
3.25
1.75
0.65
11
3.50
1.50
0.70
12
4.00
1.00
0.80
2. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre.
3. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas, con las precauciones sealadas, en
tubos heparinizados. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea
rojo brillante (plenamente oxidado).
4. Utilizando con precisin una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada, aadir
0,02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera. (Se sugiere
que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo).
5. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de
una segunda hilera. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de
cada mesa de trabajo).
6. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos.
Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.
7. LECTURA:
Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemlisis, objetivado por
el color rojizo plido que toma el lquido sobrenadante en los tubos centrifugados. Marcar el
tubo donde la hemlisis es completa (color rojo intenso).
Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0,40
y 0,45% de NaCl).
Anotar los resultados.
EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA
INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS:
(Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular, por accin de
soluciones salinas de diferente concentracin).
Procedimiento:
Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano, con un algodn empapado en alcohol yodado.
Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estril pinchar el dedo.
Depositar una gota de sangre en cada una de las tres lminas porta-objeto.
Proceder de la siguiente manera:
47
Lminas (gotas)
Sangre del pulpejo de dedo
Solucin isotnica de CINa 8,5%
Solucin hipertnica de CINa 15%
Solucin hipotnica de CINa 4,5%
I
1
2
-
II
1
2
-
III
1
2
Mezclar bien.
Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las lminas.
Establecer las comparaciones morfolgicas y/o lisis de los glbulos rojos en relacin a cada tipo de
soluciones empleada en cada caso.
Anotar los resultados.
IV. CUESTIONARIO:
1.
2.
3.
4.
Si el test de fragilidad osmtica de los eritrocitos de un modo general evala la relacin entre
el rea superficial y el volumen de la clula, diga:
A. Cul es la relacin normal existente que permite la forma de disco bicncavo del eritrocito?
B. Cules son las relaciones normales existentes para la formacin de los esferocitos y de las
clulas tipo tiro al blanco? (target cell).
Segn observacin cuidadosa, seale la concentracin o porcentaje de NaCl del tubo en el
cual empez la hemlisis; as mismo el tubo en donde la hemlisis fue completa.
De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmtica de los eritrocitos, seale los
porcentajes de inicio y finalizacin (total) de la hemlisis.
Seale causas de alteraciones en la fragilidad osmtica

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO.

GUIA DE PRACTICA LABORATORIO

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS MDICAS

DOCENTES DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA MDICA

DR. JUAN MANUEL VALLADOLID ALZAMORA. (JMVA)

Prof. Principal Tiempo Completo.

Dra. MARIA ESTHER DAISY REYES BELTRAN. (MRB)

Prof. Auxiliar Tiempo Completo.

Ms. WALTER OBESO TERRONES.(WOT)

Prof. Principal Tiempo Completo.

Jefe del departamento de Ciencias

Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA. (JHS)

Prof. Principal Tiempo Completo.

Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO. (CAA)

Prof. Asociado Tiempo Completo.

Ms. ANGEL ALFREDO LARIOS CANTO. (ALCA)

Prof. Auxiliar Tiempo Parcial.

Prof. Auxiliar Tiempo Parcial

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

cido Tricloroactico 20%

Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6

a. Observar el aspecto y color producido e interpretar.

Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6

e. Preincubar por dos minutos a 37C.

sistema (B), agregar:

Observe el color producido e interprete los resultados.

Cul es el mecanismo de accin de las sales pesadas sobre la protena (enzima)?

Casena 0.1N (sal)

Mezclar al instante por inversin .

pK del cido Actico = 4.7

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Solucin de almidn 1% pH 6.0

Solucin de NaCl 0.1M

Colocar los tubos en bao maria a 37C por 5 minutos.

A. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL.

De los tubos I y II: Etapa A

Solucin Cprica alcalina

Qu mtodos conoce para determinar la actividad enzimtica?

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES:

ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA:

Succinato de sodio 0.1 M

Succinato de sodio 0.5 M

Cloruro de mercurio 0.1 M

Malonato de sodio 0.1 M

Buffer fosfato 0.1M pH 7.2

Dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente.

FACTORES FSICOS-QUMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento)

Buffer acetato 0.1M pH 4.6

Buffer fosfato 0.1M pH 6.6

Buffer borato 0.1M pH 9.0

Preparado enzimtico (ml)

CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS

Incubado correspondientemente a los tubos III y V

Solucin cprico alcalina

CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR EL

CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR LOS

DISTRIBUCIN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE XIDO-REDUCCIN

Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4

Succinato de sodio 0.1M

Fraccin microsomal soluble

Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4

Fraccin microsomal soluble