Carac WCFS

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
TRABAJO FIN DE MÁSTER
Caracterización estructural de enzimas

implicadas en la reducción de ácidos fenólicos
en L. plantarum WCFS1
Sandra Gómez Sanz
Rosario Muñoz Moreno Blanca de las Rivas Jose Miguel Mancheño Miguel Arroyo Sánchez
Biotecnología Bacteriana Biotecnología Bacteriana Dept. de Cristalografía y Departamento de

(ICTAN-CSIC) (ICTAN-CSIC) Biol. Estruc. (Instituto de Bioquímica y Biología
Química Física Molecular I (UCM)
Rocasolano-CSIC)
INDICE
Resumen / Abstract………………………………………............................1
I. Introducción………………………………………………………………..3
1. Compuestos fenólicos………………………………………………….3
1.1. Influencia de los compuestos fenólicos en las propiedades sensoriales de los alimentos.
1.2. Efectos de los compuestos fenólicos en la salud del consumidor.
1.3. Compuestos fenólicos en los residuos de la industria alimentaria.
2. Bacterias lácticas (BAL) en alimentos………………………………..5
2.1. Metabolismo de compuestos fenólicos en BAL
2.2. Metabolismo de compuestos fenólicos por Lactobacillus plantarum
2.3. Degradación de ácidos hidroxicinámicos por L. plantarum.
3. Flavoproteínas. ………………………………………………………….8
II. Objetivos…………………………………………………………………….9
III. Materiales y Métodos……………………………………………………10
1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos…………………..10
2. Medios y condiciones de cultivo………………………………………..11
3. Técnicas de AND…………………………………………………………11
3.1. Extracción de ADN plasmídico
3.2. Amplificación de secuencias de ADN mediante PCR
3.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa.
3.4. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa
3.5. Clonación independiente de ligación (LIC)
3.6. Manipulación de DNA con enzimas de uso común en biología molecular
3.7. Transformación genética de cepas bacterianas de E.coli
4. Técnicas de Proteínas…………………………………………………...14
4.1. Hiperproducción de proteínas recombinantes
4.2. Purificación de proteínas recombinantes.
5. Cristalografía de proteínas………………………………………………17
5.1. Ensayos de pre-cristalización
5.2. Ensayos de cristalización de alto rendimiento
6. Otros ensayos……………………………………………………………...19
6.1. Espectrometría de masas
6.2. Identificación de proteínas mediante huella peptídica y fragmentación MALDI TOF/TOF
IV. Resultados y Discusión………………………………………………….20
1. Análisis in silico de las secuencias de los genes lp_1424 y lp_1425.20
2. Clonación del gen lp_1424 y los dominios FMN y FAD del gen lp_1425 e
hiperproducción de las proteínas correspondientes…………………..22
3. Purificación y comportamiento en solución……………………………..24
3.1. Lp_1425FMN
3.2. Lp_1424:Lp_1425FMN
3.3. Lp_1425FAD
4. Cristalización………………………………………………………………..30
V. Conclusiones / Conclusions……………………………………………...32
Bibliografía………………………………………………………………………34
1 Máster en Biotecnología Industrial y Ambiental
RESUMEN / ABSTRACT
Resumen
Lactobacillus plantarum se encuentra presente en una gran variedad de sustratos
vegetales y productos agroalimentarios donde los compuestos fenólicos son
abundantes y tienen gran importancia por su influencia en las características
nutricionales y sensoriales de estos sustratos. Los ácidos hidroxicinámicos (C6‐C3)
son un importante grupo de fenoles de bajo peso molecular, entre los que destacan los
ácidos cumárico, cafeico y ferúlico. Respecto a la capacidad metabólica de L.
plantarum frente a estos fenoles recientemente el grupo de Biotecnología Bacteriana
del ICTAN ha identificado las reductasas implicadas en dicho metabolismo, que
incluyen las enzimas Lp_1424 y Lp_1425. Este trabajo pretende ampliar el
conocimiento estructural de dichas enzimas, Lp_1424 y Lp_1425, de L. plantarum
WCFS1 las cuales son responsables de la reducción del ácido p-cumarico a su
correspondiente ácido fenilpropiónico. Para ello se han estudiado diferentes
construcciones de ambas proteínas, con las que se ha podido determinar que el
módulo Lp_1425FAD es monomérico en solución y une FAD, por lo que
estructuralmente es un dominio, es decir, una unidad de plegamiento independiente.
Además, se ha podido determinar que la asociación entre Lp_1424 y Lp_1425 se
produce a través del módulo amino terminal flavodoxina de ésta última, siendo un
dímero estable en solución.
Abstract
Lactobacillus plantarum is present in a wide variety of plant substrates and agri-food

products where phenolic compounds are abundant and have great importance for their
influence on the nutritional and sensory characteristics of these substrates.
Hydroxycinnamic acids (C6-C3) are an important group of low molecular weight
phenols, including coumaric, caffeic and ferulic acids. Regarding the metabolic capacity
of L. plantarum in relation to these phenols recently, the Bacterial Biotechnology group
of the ICTAN has identified the reductases involved in this metabolism, including the
enzymes Lp_1424 and Lp_1425. This work aims to expand the structural knowledge of
these enzymes, Lp_1424 and Lp_1425, from L. plantarum WCFS1 which are
responsible for the reduction of p-coumaric acid to its corresponding phenylpropionic
acid. In orther to this, different constructions of both proteins have been studied, with
which it has been possible to determine that the Lp_1425FAD module is monomeric in
solution and binds FAD, so that it is structurally a domain, that is, an independent
folding unit. In addition, it has been determined that the association between Lp_1424
and Lp_1425 is produced through the flavodoxine amino terminal module of the latter,
being a solution-stable dimer.
Lista de abreviaturas
o FMN: flavín mononucleótido

o FAD: flavín adenín dinucleótido
o Lp1425FMN: Módulo de unión FMN de Lp_1425
o Lp1425FAD: Módulo de unión FAD de Lp_1425
o Lp_1424:Lp_1425FMN: Proteína Lp_1424 junto con módulo de unión FMN de
Lp_1425 (heterodímero de módulos favodoxina).
o LIC: Clonación independiente de ligación
I. INTRODUCCIÓN
1. Compuestos fenólicos.
Los compuestos fenólicos son un conjunto heterogéneo de moléculas que poseen en

su estructura uno o varios anillos bencénicos con uno o varios grupos hidroxilo
(Croteau et al., 2000). Se encuentran de forma natural en plantas, constituyendo el
principal grupo de metabolitos secundarios del reino vegetal. Fisiológicamente estos
compuestos son esenciales para el crecimiento y reproducción de plantas y actúan
como antipatógenos, antibióticos o pesticidas naturales; también están implicados en
el establecimiento de relaciones simbióticas, en polinización y confieren estabilidad
estructural a la planta. La mayoría de estas moléculas son bioactivas, interactúan con
el medio ambiente y desempeñan un importante papel de protección contra el estrés
abiótico y biótico en las plantas (Tohge et al., 2013). Se localizan principalmente en
frutos y órganos aéreos jóvenes, por lo que entran a formar parte de nuestra dieta
diaria de forma significativa (Harbone and Williams, 2000).
La mayoría de ellos se sintetizan en plantas superiores a partir del aminoácido L-

fenilalanina, a través de la ruta general de los fenilpropanoides (Robbins, 2003). Los
compuestos fenólicos se han clasificado tradicionalmente en flavonoides, ácidos
fenólicos, estilbenos y taninos, en función del número de anillos aromáticos que
contienen y de los elementos estructurales que unen los anillos entre sí (Manach et al.,
2004). Dentro de los ácidos fenólicos se pueden diferenciar dos grupos principales, los
ácidos benzoicos y los ácidos cinámicos. Estos compuestos se encuentran
mayoritariamente como ácidos hidroxibenzoicos e hidroxicinámicos tanto en forma
libre como conjugados. (Garrido y Borges , 2013). Los ácidos benzoicos más
frecuentes son los ácidos gálico, elágico, p-hidroxibenzoico, vanillínico, siríngico y
protocatéquico. Los ácidos cinámicos son los ácidos fenólicos más abundantes,
destacando entre ellos los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico. (Fig. 1)
A. B. C.
Figura 1. Estructura general de los ácidos cinámicos: ácido p-cumárico (A), ácido cafeico (B)
y ácido ferúlico (C).
1.1. Influencia de los compuestos fenólicos en las propiedades sensoriales de

los alimentos.
Algunas de las propiedades organolépticas de los alimentos y bebidas de origen

vegetal como el color, aroma y textura son originadas por los compuestos fenólicos,
influyendo de esta forma en la calidad final de los mismos. El color y el aspecto de un
alimento es la primera característica sensorial que percibe el consumidor. Aparte de
las clorofilas, los compuestos fenólicos son responsables del color de frutas y verduras
y pueden producir colores que varían del rojo brillante al púrpura. Estos efectos
sensoriales pueden ser deseados o no pudiendo disminuir la calidad de los alimentos.
También contribuyen de forma significativa al aroma (Tomás-Barberán and Espín,
2001), amargor y astringencia (Haslam, 2007).
1.2. Efectos de los compuestos fenólicos en la salud del consumidor.
En la actualidad los compuestos fenólicos son de especial interés y estudio debido a

las evidencias que señalan su efecto beneficioso en la salud humana (Selma et al.,
2009). Tradicionalmente a los compuestos fenólicos se les han asociado propiedades
antioxidantes, antiinflamatorias, antiestrogénicas, antiescleróticas, cardio-
neuroprotectoras y contra la carinogénesis y mutagénesis. A pesar de que se han
realizado importantes avances en el conocimiento del destino final de los compuestos
fenólicos una vez ingeridos, tanto en su absorción, distribución, metabolismo y
excreción, como en sus tejidos diana y efectos biológicos (Landete, 2012), todavía se
desconoce el efecto que ejerce la microbiota del tracto gastrointestinal (TGI) sobre
ellos (Van Duynhoven et al., 2011).
1.3. Compuestos fenólicos en los residuos de la industria alimentaria.
La gestión de residuos constituye uno de los problemas medioambientales más

importantes para las industrias alimentarias que utilizan productos vegetales como el
caso de las almazaras y bodegas en donde la mayoría de los residuos generados
poseen un alto contenido orgánico, mayoritariamente fenólico, lo que dificulta su
posterior degradación. Por otro lado los residuos fenólicos dificultan la degradación
biológica de los residuos en los que se encuentran al inhibir a muchos
microorganismos degradadores (Curiel, 2010).
Actualmente es de gran importancia el desarrollo de estrategias para la obtención de
productos de alto valor añadido a partir de estos subproductos, reduciendo así los
problemas medioambientales. Así, por ejemplo, residuos generados por la industria
vitivinícola representan una fuente importante de compuestos antioxidantes que en
algunos casos son explotados en la industria de la cosmética, alimentación animal o

empleados como fertilizantes orgánicos. De forma similar, en la producción de aceite
de oliva se generan muchos residuos altamente contaminantes por lo que se están
diseñando sistemas para recuperar compuestos fenólicos y reducir así el problema
medioambiental (Agalias et al. 2007).
2. Bacterias lácticas (BAL) en alimentos
El término bacterias del ácido láctico o bacterias lácticas (BAL) engloba una gran
diversidad de microorganismos fermentadores y productores de ácido láctico,
asociados a numerosos alimentos, siendo responsables de los cambios en el sabor,
aroma, textura, color y acidez. Las BAL incluyen bacterias de los géneros
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus,
Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus y Sporolactobacillus, entre otros. Un
grupo importante de estas bacterias participan en la fermentación de sustratos
vegetales o de origen animal, siendo utilizada esta fermentación espontánea para
conservar la vida útil de los alimentos incrementando su nivel de seguridad y calidad
por la inhibición de la microbiota alterante o patógena. Por otro lado, permiten obtener
mejoras en las propiedades nutricionales y sensoriales.
2.1 Metabolismo de compuestos fenólicos en BAL.
Las BAL se encuentran presentes en una gran variedad de sustratos vegetales y

productos agroalimentarios. En estos sustratos los compuestos fenólicos son
abundantes y tienen gran importancia por su influencia en las características
nutricionales y sensoriales. Los primeros estudios sobre el metabolismo de
compuestos fenólicos en BAL fueron descritos por Whiting y Carr (1957). En ellos se
describió que el ácido clorogénico desaparecía durante la fermentación de sidras y,
utilizando extractos de Lactobacillus paracollinoides, se demostró que en una primera
etapa este compuesto se hidrolizaba originando ácido cafeico y ácido quínico que
posteriormente se metabolizan. Más adelante se demostró que el ácido cafeico se
metaboliza a ácido dihidrocafeico y catecol (Whiting y Carr, 1959). Además se observó
que L. paracollinoides reducia distintos ácidos hidroxicinámicos que tras
descarboxilarse daban lugar a etilcatecol y etilfenol (Whiting y Coggins, 1969).
Posteriormente Cavin et al. (1993) realizaron estudios sobre el metabolismo de los
ácidos fenólicos demostrando que Lactobacillus brevis y Pediococcus pentosaceus
eran capaces de descarboxilar los ácidos p-cumarico y ferúlico produciendo vinilfenol y
vinilguayacol respectivamente, los cuales se reducen posteriormente a sus
correspondientes etil derivados. Se estudió la capacidad para producir fenoles

volátiles en 20 especies de bacterias lácticas concluyendo que solo las especies del
género Lactobacillus son capaces de reducir los vinil derivados a sus correspondientes
etil derivados.
2.2 Metabolismo de compuestos fenólicos por Lactobacillus plantarum
Lactobacillus constituye un género de bacterias heterofermentativas que pertenece al

filo Firmicutes, clase Bacilli, orden Lactobacillales y familia Lactobacillaceae. La
especie L. plantarum es una bacteria muy versátil presente en una gran variedad de
nichos ecológicos, encontrándose con frecuencia en fermentaciones de origen vegetal.
Además presenta uno de los genomas más grandes dentro de las BAL (Kleerebezem
et al., 2003) por lo que puede considerarse la bacteria láctica modelo para
fermentaciones de sustratos vegetales y, en general, para conocer los mecanismos
moleculares que determinan la respuesta frente a un ambiente rico en compuestos
fenólicos (Douillard & de Vos, 2014). A pesar de que los compuestos fenólicos
presentes en plantas son tóxicos y bacteriostáticos, L. plantarum ha sido capaz de
adaptarse a su presencia y posee rutas metabólicas que permiten su degradación.
Al tratarse de una bacteria GRAS (Generally Recognized as Safe), L. plantarum es la

especie más utilizada como cultivo iniciador en la fermentación de productos
alimentarios de origen vegetal. La interacción entre L. plantarum y un compuesto
fenólico va a producir cambios en ambos. La transformación del compuesto fenólico
originará nuevos compuestos que conferirán diferentes características sensoriales y
nutritivas a los alimentos, produciendo efectos en la microbiota del TGI y en la salud
del consumidor. Por otro lado, la presencia del compuesto fenólico desencadenará una
respuesta en L. plantarum, que podría estar asociada con mecanismos de
detoxificación, pudiendo llevar a una mejora en su capacidad fermentativa de
alimentos (López de Felipe, et al., 2010; Curiel et al., 2010) o bien a la inducción de
marcadores ligados a su supervivencia en el TGI.
Los primeros estudios realizados sobre el efecto de L. plantarum en los compuestos
fenólicos indicaron que esta especie era capaz de reducir ácido quínico (Whiting,
1975) y de degradar la oleuropeína del olivo (Ciafardini et al. 1994; Marsilio et al.,
1996). Por otro lado, Osawa et al. (1993) aislaron, a partir de alimentos fermentados,
cepas de L. plantarum que poseían actividades tanasa y galato descarboxilasa que
permiten la biotransformación de taninos. Posteriormente, se observó que L.
plantarum fue la única especie entre distintas bacterias enológicas que presentó
actividad tanasa. Finalmente, también se ha estudiado el efecto del crecimiento de

este microorganismo sobre el alpechín (Kachouri y Hamdi, 2004).
2.3 Degradación de ácidos hidroxicinámicos por L. plantarum.
Los ácidos hidroxicinámicos (C6‐C3) son un importante grupo de fenoles de bajo peso
molecular, entre los que destacan los ácidos cumárico, cafeico y ferúlico. Estos últimos
suelen encontrarse como derivados glicosilados, pero también esterificados con ácido
quínico, siquímico o tartárico. El ácido ferúlico suele estar presente de forma libre en
los tomates y la cerveza, siendo el compuesto fenólico más abundante en los granos
de cereales, mayoritariamente conjugado con arabinoxilanos de las paredes celulares
de los vegetales (Kroon y Williamson, 1999).
La descarboxilasa de ácidos hidroxicinámicos (PAD) ha sido la primera enzima
identificada en su metabolismo. Esta enzima decarboxila los ácidos p-cumÁrico,
cafeico y ferúlico formando los correspondientes 4-vinil derivados (Cavin et al. 1997).
Rodríguez et al. (2007) caracterizaron esta molécula y posteriormente determinaron su
estructura y mecanismo catalítico (Rodríguez et al., 2010). Posteriormente, el grupo de
Biotecnología Bacteriana del ICTAN ha identificado, mediante un estudio
transcriptómico de respuesta global de L. plantarum frente a vinil fenol, las enzimas
implicadas en la reducción de estos compuestos a sus correspondientes etil derivados
(datos no publicados). Además, Esteban-Torres et al. (2013) demostraron que los
ésteres de los ácidos hidroxicinamicos también pueden ser hidrolizados por acción de
una feruloil/cinamoil esterasa (Lp_0796) para originar el correspondiente ácido que
posteriormente se descarboxila por acción de la enzima PAD descrita previamente.
Los ácidos hidroxicinámicos también se pueden reducir a los correspondientes ácidos
fenil propiónicos (Rodríguez et al., 2008). (Fig. 2)
Figura 2: Esquema-resumen del metabolismo de ácidos hidroxicinámicos de L. plantarum.
En la actualidad el grupo de Biotecnología Bacteriana del ICTAN ha identificado,

mediante el análisis transcriptómico de la respuesta de L. plantarum frente a ácido p-
cumarico las enzimas implicadas en dicha reducción, Lp_1424 y Lp_1425 (datos no
publicados).
3. Flavoproteínas.
Las flavoproteínas son enzimas que catalizan reacciones de oxidación-reducción

utilizando flavín mononucleótido (FMN) o flavín adenín dinucleótido (FAD) como
cofactores (Fig. 3), los cuales provienen de la vitamina B2 o riboflavina.
El anillo de isoaloxazina de FMN o FAD es capaz de aceptar uno o dos electrones
originándose la forma semiquinona (FMNH, FADH), o las formas totalmente reducidas
(FMNH2, FADH2), respectivamente.
Figura 3: Estructura química de los nucleótidos de flavina.
Con respecto a actividades reductasas en el género Lactobacillus, recientemente

Hertzberger et al. (2014) purificaron una flavoreductasa dependiente de NADH
implicada en la producción de H2O2 en L. johnsonii. Esta enzima resultó ser un
heterodímero, como posteriormente mostraron Valladares et al. (2015), que está
codificada por dos genes contiguos y muy similares (lj_0548 y lj_0549), que codifican
sendas cadenas polipeptídicas de 20 kDa, siendo estas secuencias dominios de unión
de FMN (módulos flavodoxina). De manera similar a lo observado por el grupo de
Biotecnología Bacteriana con los genes lp_1424 y lp_1425 en la reducción de los
ácidos hidroxicinámicos, la interrupción de cada uno de los genes lj_0548 y lj_0549 en
L. johnsonii ocasiona la pérdida de la actividad reductasa lo que identifica a estos
genes como responsables de la actividad enzimática. La hiperexpreesión de cada uno
de estos genes de manera individual (lj_0548 o lj_0549) no permite la producción de la
correspondiente enzima recombinante. Sin embargo, cuando se hiperexpresaron
simultáneamente sí obtuvieron proteína, aunque no pudieron determinar cuál de las
dos era, Lj_0548 o Lj_0549, aspecto que quedó resuelto en el trabajo de Valladares et
al. (2015). Estos resultados son consistentes con el hecho de que estudios de
complementación con los dos genes delecionados lj_0548 y lj_0549 indicaron la
necesidad de los dos para la actividad reductasa. Además este último grupo de
investigación demostró la necesidad de la formación del heterodímero para la unión

del cofactor FMN.
II. OBJETIVOS
Tanto en la fermentación de sustratos vegetales como en el TGI humano. L. plantarum

está expuesto a la presencia de compuestos fenólicos. La elucidación del metabolismo
de estos compuestos es imprescindible para caracterizar las fermentaciones de
alimentos de origen vegetal así como y para conocer los efectos saludables que
ejercen estos compuestos en el consumidor. L. plantarum es un microorganismo
presente tanto en estas fermentaciones vegetales, siendo el que mayoritariamente se
aísla, como en el TGI humano. A esto se une el hecho de que posee uno de los
mayores genomas entre las BAL por lo que resulta un buen modelo para abordar este
tipo de estudios del metabolismo de compuestos fenólicos. De la capacidad
metabólica que presenta L. plantarum frente a ácidos hidroxicinámicos únicamente
quedaban por identificar genéticamente las reductasas implicadas en el metabolismo
de dichos compuestos. En la actualidad el grupo de Biotecnología Bacteriana ha
identificado estas reductasas. Este trabajo pretende ampliar el conocimiento
estructural de las enzimas responsables de la reducción del ácido p-cumarico a su
correspondiente ácido fenilpropiónico.
El objetivo de este trabajo es abordar las primeras etapas de la caracterización
estructural de las enzimas Lp_1424 y Lp_1425 de L. plantarum WCFS1 lo que
indudablemente contribuirá a avanzar en el estudio de su mecanismo catalítico. Para
conseguirlo se plantean los siguientes objetivos específicos:
1. clonación conjunta del gen lp_1424 y el fragmento del gen lp_1425 que
codifica el módulo N-terminal de unión a FMN de Lp_1425, así como producción
heteróloga de las proteínas correspondientes
2. clonación del fragmento del gen lp_1425 que codifica el módulo N-terminal de
unión FMN de Lp_1425, así como producción heteróloga de la proteína
correspondiente.
3. clonación del fragmento del gen lp_1425 que codifica el módulo C-terminal de
unión a FAD de Lp_1425, así como producción heteróloga de la proteína
correspondiente.
4. purificación de las proteínas producida: Lp_1424:Lp_1425FMN, Lp_1425FMN y
Lp_1425FAD.
5. primeros ensayos de cristalización de alto rendimiento de las proteínas con
características adecuadas de solubilidad.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos.
Para el desarrollo de este trabajo se han utilizado las cepas de Escherichia coli y los
plásmidos indicados en las tablas 1 y 2 respectivamente así como los oligonucleótidos
sintéticos descritos en la Tabla 3.
cepas Genotipo/Fenotipo relevante Referencia/Origen

F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74
DH10B recA1 endA1 deoR araD139 Δ(ara leu)7697 galU galK rpsL Durfee et al., 2008
nupG λ–
fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ΔhsdS λ DE3 = λ
BL21
sBamHIo ΔEcoRI B int::(lacI::PlacUV5::T7 gene 1) i21 Δnin5 Studier et al., 1990/Novagen
(DE3)
T1
Tabla 1. Estirpes bacterianas empleadas en este trabajo
Plásmido Genotipo/Fenotipo relevante Referencia/Origen

R
pURI3-Cter derivado de pT77, Amp Curiel et al., 2011
R
pURI3-Cter (1424 + 1425) Amp Este estudio
R
pURI3-Cter( 1424+ dominioFMN1425) Amp Este estudio
R
pURI3-Cter domino FMN 1425 Amp Este estudio
R
pURI3-Cter dominio FAD 1425 Amp Este estudio
AmpR, resistente a ampicilina
Tabla 2. Plásmidos empleados en este trabajo.
Oligonucleótido Secuencia (5´→3´)

1731 TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATTTGTTGGAATTGTT
1732 GCTATTAATGATGATGATGATGATGCCGCATCTCGGCGACGATGG
1735 GCGACCATCGTCGCCGAGATGCGGCATCATCATCATCATCATTAA
1736 GCTATTAATGATGATGATGATGATGCCGCATCTCGGCGACGATGGTCGC
1793 TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCAGGTCGCTCAACCTGCTGTCA
890 GCTATTAATGATGATGATGATGATGGGCCGTCACCGGATCAACGTGCTC
Tabla 3. Oligonucleótidos empleados en este trabajo

2. Medios y condiciones de cultivo.
Las cepas de Escherichia coli se convervaron congeladas a -80ºC en el medio de

cultivo al que se añadió glicerol estéril al 10%. Durante los procesos de clonación y
transformación con los plásmidos de interés, se cultivaron de manera rutinaria en el
medio de Luria-Bertani (LB) tanto en su versión líquida como en sólida (añadiendo
agar al 1,5%), a 37ºC en ambos medios. En el caso que fue necesario se añadió
ampicilina a una concentración final de 100 μg/mL.
3. Técnicas de ADN:
3.1 Extracción de ADN plasmídico
Para obtener ADN plasmídico de alta pureza se realizó la extracción con los sistemas
comerciales High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) y FavorPrep Plasmid Extraction
Mini Kit (FAVORGEN Biotech Corp) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez
extraídos se conservaron a -20ºC hasta su uso.
Por otro lado, se realizó una extracción rápida del plásmido para verificar que las
células de E. coli se habían transformado con los plásmidos recombinantes que
contenían los genes de interés. Para ello, se cogió con una punta estéril la colonia
crecida en medio sólido y se resuspendió en 20 μL de una solución con lisozima 0,5
mg/mL, EDTA 25 mM pH 8,0, Tris HCl 25 mM pH 7,5, RNasa 0,1 mg/mL, azul de
bromofenol 0,02% y glicerol 0,015%. La preparación se incubó a temperatura
ambiente durante 15 minutos y posteriormente se añadieron 5 μL de
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se mezcló vigorosamente. La mezcla se
centrifugó a 12500 x g durante 2 minutos para que se separasen las dos fases. De la
fase superior acuosa, que contiene el ADN, se cargaron 10 μL en un gel de agarosa y
se realizó una electroforesis convencional. Las células transformadas con los
plásmidos recombinantes se seleccionaron debido la diferencia de tamaño con
respecto al DNA plasmídico original.
3.2 Amplificación de secuencias de ADN mediante PCR
Para la amplificación de las secuencias se utilizaron los reactivos de las casas

comerciales Applied Biosystems y Takara biotechnology, excepto los oligonucleótidos
que se sintetizaron en MWG Operon Technologies. Las reacciones de amplificación se
realizaron con un volumen final de 25 - 50 μL, y contenían la ADN polimerasa
PrimeSTARTM HS (Takara) 1,25 U/µL, tampón de reacción con MgCl2 5mM,
desoxinucleótidos (dNTPs) 0,2 mM, ADN molde y los oligonucleótidos usados como
cebadores a una concentración final 1 µM.
El proceso de amplificación se llevó a cabo en los termocicladores Personal y
Mastercycler gradient (Eppendorf) siguiendo las siguientes condiciones: 30 ciclos de
tres fases cada uno, una fase de desnaturalización del DNA 95 °C durante 30
segundos para AmpliTaq GoldTM y 98 °C durante 10 segundos para PrimeSTARTM HS,
una fase de hibridación de los oligonucleótidos con el DNA molde cuya temperatura
varía dependiendo del ensayo que se esté realizando, de 30 segundos para AmpliTaq
GoldTM y de 5 segundos para PrimeSTARTM HS, y una fase de elongación o síntesis de
DNA realizada a 72 °C durante un tiempo proporcional al tamaño del fragmento a
amplificar. En la reacción realizada con la DNA polimerasa AmpliTaq GoldTM hubo que
introducir una etapa previa de 95 °C durante 10 minutos para su activación, puesto
que esta enzima se suministra en estado inactivo.
3.3 Electroforesis de ADN en geles de agarosa.
Para resolver las muestras de ADN se utilizaron geles de agarosa al 0,7% ó 2% en

tampón TAE (Tris-HCl 40 mM; ácido acético 20 mM; EDTA 2 mM, pH 8,0). El mismo
tampón se utilizó como electrolito. A las muestras se les añadió un 20% de su volumen
de una solución compuesta por azul de bromofenol 0,25%, xilencianol FF 0,25% y
glicerol 30% en agua. La electroforesis se realizó a 90 V y, una vez finalizada, los
geles se tiñeron con GelRedTM Nucleic acid Gel Stain (Biotium) siguiendo las
indicaciones suministradas por el proveedor. Los fragmentos de ADN se visualizaron
mediante radiación ultravioleta (λ=302 nm) en un sistema de captura y análisis de
imágenes ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Como marcadores de tamaño se utilizaron ADN
del fago Lambda cortado con EcoT14I (Takara) y el marcador 100 bp ladder (Biotools).
3.4 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa
Este proceso se llevó a cabo mediante el kit QIAquick Gel extraction (QIAGEN)
siguiendo las indicaciones suministradas por el proveedor.
3.5 Clonación independiente de ligación (LIC)
En este trabajo se utilizó como vector de expresión pURI3-Cter de la familia pURI

(Curiel et al., 2011) , que deriva del plásmido pT7-7 (De las Rivas et al., 2007). La
clonación de los genes de interés se realizó mediante el método de clonación
independiente de ligación (LIC) descrito por De las Rivas y colaboradores (De las
Rivas et al., 2007). El vector pURI-Cter presenta una secuencia líder que está
constituida por un residuo de metionina en el extremo amino terminal y la cola de

afinidad que codifica seis residuos de histidina se localiza a 280 pb del residuo de
metionina, seguida de cuatro codones de terminación en tándem. De esta forma la
cola de histidinas se inserta en el extremo C-terminal del gen clonado. (Fig.4)
Figura 4. Esquema del plásmido pURI3-Cterminal

El proceso de clonación se llevó a cabo amplificaron los genes de interés con la ADN
polimerasa PrimeSTARTM HS (Takara) utilizando los oligonucleótidos diseñados con
extremos 5’ complementarios a regiones presentes en los vectores de expresión
(Tabla 3). De esta manera, en una segunda amplificación utilizando el vector como
molde y el gen amplificado como cebador, los extremos 5’ hibridan en el plásmido,
permitiendo a la enzima ADN polimerasa copiar el resto del plásmido y la consiguiente
inserción del gen de interés en el mismo.
Para seleccionar los plásmidos que contienen el gen de interés, se realizó una
digestión de la mezcla anterior con la enzima DpnI (Roche) durante 10 horas a 37 °C,
ya que estos no presentan secuencias metiladas y, por lo tanto, no van a ser digeridos
por dicha enzima. En algunos clonajes se llevó a cabo una segunda digestión con NotI
(Takara) durante 4 horas a 37 °C en tampón H (Takara), ya que esta diana de
restricción se encuentra en la región intergénica no codificante presente sólo en el
plásmido original y no en los plásmidos que han incorporado el inserto.
Posteriormente, ambas enzimas se inactivaron mediante una incubación a 65°C
durante 25 min y una vez inactivadas, las células competentes de E. coli DH10B se
transformaron con el producto de la digestión (ver apartado 3.4). Como medio de
selección se utilizaron placas de LB suplementadas con ampicilina a 100 μg/mL.
3.6 Manipulación de DNA con enzimas de uso común en biología molecular
Las enzimas utilizadas fueron DpnI (Roche) y NotI (Takara). Las enzimas y sus
correspondientes tampones se utilizaron siguiendo las indicaciones recomendadas por
cada proveedor.
3.7 Transformación genética de cepas bacterianas de E.coli
Para la transformación genética de E. coli, se prepararon células competentes

obtenidas mediante el método de cloruro de rubidio (Hanahan, 1983). Las células
competentes se obtuvieron cultivando células de E. coli DH10B o BL21 (DE3) en 100
mL de LB hasta una DO600 de 0,48, posteriormente se mantuvieron en hielo durante 30
min y el cultivo se centrifugó a 3800 x g durante 7 min a 4°C. El sedimento celular se
resuspendió en 30 mL de la solución TFBI (RbCl 100 mM, MnCl2 50 mM, KOAc 30
mM, CaCl2 10 mM y glicerol 15%) durante 90 min a 4°C. Pasado ese tiempo, la
suspensión celular se centrifugó a 3800 x g durante 7 min a 4°C y el sedimento se
resuspendió suavemente en 4 mL de la solución TFBII (MOPS 10 mM, RbCl 10 mM,
CaCl2 75 mM y glicerol 15%) hasta obtener una suspensión homogénea de células
competentes. La suspensión se repartió en alícuotas de 200 μL y éstas se
conservaron a -80°C.
La transformación de las células obtenidas se realizó incubándolas con el plásmido
(100 ng) durante 15 min en hielo, seguido de 3 min a 37°C y de 5 min en hielo.
Posteriormente, se añadió 1 mL de LB a las células y se incubaron a 37°C durante una
hora. Terminada la incubación las células transformadas se seleccionaron en placas
de LB conteniendo el antibiótico correspondiente y se incubaron a 37°C hasta la
aparición de colonias.
4. Técnicas de Proteínas:
4.1 Hiperproducción de proteínas recombinantes
Para la obtención de las proteínas analizadas en este trabajo, los genes que las
codifican se clonaron, como se ha indicado antes, en el vector de expresión pURI3-
Cter (Curiel et al., 2011) mediante el sistema de clonación LIC (de las Rivas et al.,
2007). Estos vectores de expresión presentan promotores inducibles por IPTG y una
secuencia líder que codifica una cola de afinidad de seis histidinas (His6), con objeto
de hiperproducir y purificar las proteínas recombinantes en un único paso.
Inicialmente el plásmido se propagó y amplificó en células de E. coli DH10B, pero para
la hiperexpresión se utilizó la cepa E. coli BL21 (DE3) puesto que es necesario que
contenga la RNA-polimerasa T7 del fago defectivo DE3. Las células de E. coli
transformadas con los plásmidos recombinantes se incubaron a 37 °C con agitación en
medio LB con ampicilina a una concentración final de 100 μg/mL. Una vez que el
cultivó alcanzó una densidad óptica a 600 nanómetros (DO600nm) entre 0,4 y 0,6, se
indujo con IPTG a una concentración final 0,4 mM. Después de añadir el inductor se
incubaron 24 horas a 22 °C con agitación. En algunos casos en los que el medio

contenía sorbitol -para mejorar la producción- se indujo con IPTG y se mantuvo el
cultivo 5 días en agitación a 22 °C. La concentración de proteínas se determinó
midiendo la absorbancia a 280 nm y utilizando el coeficiente de extinción molar teórico
de cada proteína.
4.2 Purificación de proteínas recombinantes.
Finalizado el periodo de inducción las células se recogieron mediante centrifugación a

7000 × g durante 15 min. El sedimento se sometió a tres lavados en solución salina
para eliminar restos del medio y, posteriormente, se resuspendió en tampón fosfato
sódico 50 mM, pH 7,0. Esta suspensión celular se rompió mediante tres pases por una
prensa de French (Amicon French pressure cell, SLM Instruments) a una presión de
1100 psi y posteriormente el lisado se centrifugó a 17400×g durante 40 min para
eliminar las células completas y los restos celulares. El sobrenadante obtenido se filtró
en un tamaño de poro de 0,2 µm (Millipore) obteniendo así los extractos proteicos
libres de células.
Tras obtener los extractos proteicos libres de las distintas proteínas sobreexpresadas
se purificaron mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC)
haciendo uso de la cola de poli-histidinas que éstas poseen. En función de los ensayos
a realizar la purificación se realizó bien mediante TALON® (Clontech), o bien mediante
columna de HisTrap de 5 mL (GE Healthcare Life Sciences) seguida de una etapa
cromatográfica de exclusión molecular con una columna Superdex 200 prep grade
HiLoad 16/600 (GE Healthcare Life Sciences).
Cromatografía IMAC con TALON® (cobalto inmovilizado)

La cromatografía de afinidad de unión a metales (IMAC) empleando TALON®
(Clontech) se realizó de este modo: el extracto celular se puso en contacto durante 20
min a temperatura ambiente con 1 mL de la resina con cobalto previamente
equilibrada con tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,0 conteniendo 300 mM NaCl. Una
vez unida la proteína a la resina, se realizó un lavado con el mismo tampón
conteniendo 10 mM imidazol. La elución de la proteína se realizó aplicando el mismo
tampón con 150 mM imidazol.
Cromatografía IMAC con HisTrap (níquel inmovilizado)

Para esta cromatografía se empleó una columna HisTrap de 5 mL (GE Healthcare Life
Sciences) acoplada a un sistema cromatográfico ÄKTAprime Plus (GE Healthcare Life
Sciences). El protocolo empleado fue el siguiente: el homogeneizado celular se aplicó
a la columna previamente cargada de Ni2+ y equilibrada en tampón 20 mM Tris, pH 8.0

con 100 mM NaCl con una bomba peristáltica P-1 (GE Healthcare Life Sciences) con
un flujo de 5 mL/min. Una vez cargada la muestra, la columna se acopló al sistema
ÄKTAprime Plus. Tras un exhaustivo lavado de la columna con tampón 20 mM Tris,
pH 8.0 con 100 mM NaCl y 10 mM imidazol, se aplicó un gradiente lineal de imidazol
(10-500 mM) con un volumen final de 150 mL y un flujo de 5 mL/min. El perfil de
elución se analizó midiendo la absorbancia a 254 nm, recogiéndose fracciones de 3
mL.
Cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200 HiLoad 16/600 prep grade)
Tras recoger las fracciones que contienen la proteína de interés y concentrarlas
mediante ultrafiltración hasta un volumen final de 3 mL se llevó a cabo una
cromatografía de exclusión por tamaño con Superdex 200 HiLoad 16/600 prep grade.
El objeto es doble: por un lado, eliminar el imidazol de la etapa cromatográfica anterior,
así como los posibles agregados solubles y, por otro, tener una idea real de la
polidispersión de la muestra en solución así como una estimación del estado
oligomérico de la proteína. Como en el caso anterior, el perfil de elución se analizó
midiendo la absorbancia a 254 nm, recogiéndose fracciones de 2 mL. Las fracciones
conteniendo la proteína se juntaron, procediéndose a concentrar la proteína mediante
ultrafiltración (5000g; ciclos de 10 min) con filtros Millipore (10 kDa cutoff) hasta una
concentración final aproximada de 10 mg/mL. La concentración de proteína se estimó
mediante medidas espectroscópicas con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000
(NanoDrop), empleando un coeficiente E0.1% (280nm, 1cm) teórico de acuerdo a ProtParam
de ExPASy.
Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-
PAGE)
La electroforesis de proteínas se realizó en condiciones desnaturalizantes en
presencia de dodecilsulfato sódico (SDS). La técnica utilizada fue la descrita por
Laemmli (Laemmli, 1970) utilizando geles de poliacrilamida a una concentración de
acrilamida del 10%. Las muestras que contenían la proteína a resolver se llevaron a
80°C durante 10 min en presencia de un tampón Tris-HCl 6,5 mM pH 6,8; SDS 2%; β-
mercaptoetanol 5%; glicerol 10% y azul de bromofenol 0,005%. La electroforesis se
realizó a temperatura ambiente, utilizando como electrolito el tampón Tris-HCl 25 mM;
glicina 192 mM; SDS 0.1%. Las proteínas presentes en los geles se tiñeron con azul
brillante de Coomassie R-250 (Sigma). Como marcador de masa molecular se empleó
SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range (BioRad).
5. Cristalografía de proteínas
5.1 Ensayos de pre-cristalización

Una vez obtenida una muestra de proteína pura (> 98% de pureza) y homogénea, se
procedió a determinar la concentración óptima de la misma para llevar a cabo
experimentos de cristalización de alto rendimiento. Para ello se empleó el producto
comercial PCT (PreCrystallization Test) de Hampton Research®. La concentración de
partida de cada proteína fue por defecto 10 mg/mL. Los ensayos se realizaron a 18 °C
con placas 48-well Maxi Plate, empleando un volumen de 150 μL en cada reservorio y
gotas de 2 μL (1 μL solución de precristalización más 1 μL de proteína). Este ensayo
considera cuatro disoluciones precipitantes diferentes, dos basadas en sulfato
amónico (Tris-HCl, pH 8.5 2 M sulfato amónico y Tris-HCl, pH 8.5 1 M sulfato amónico)
y dos en polietilénglicol 4K (Tris-HCl, pH 8.5, 200 mM cloruro de magnesio y PEG 4K
30% (w/v) y Tris-HCl, pH 8.5, 200 mM cloruro de magnesio y PEG 4K 15% (w/v)). Tras
alcanzarse el equilibrio mediante difusión de vapor se analizó el aspecto de las gotas
bajo un microscopio. Esencialmente, gotas claras indican una concentración baja de
proteínas mientras que la presencia de precipitados masivos indican concentraciones
demasiado altas.
Figura 5: Esquema estructura de placas Innovaplate SD2 y ampliación de pocillo para resaltar
la relación de volumen.
5.2 Ensayos de cristalización de alto rendimiento
Screening de condiciones de cristalización

Con la concentración adecuada de cada proteína, se llevaron a cabo experimentos de
cristalización de alto rendimiento con un robot Innovadyne Nanodrop ExtY (Solve
Scientific). Se emplearon placas Innovaplate SD2 de 96 pocillos (Fig.5 ) previamente

preparadas conteniendo 96 disoluciones distintas procedentes de kits comerciales de
Hampton Research®, Qiagen y Jena Bioscience (Tabla 4.). El volumen final de las
gotas se ajustó a 500 nL, resultado de mezclar 250 nL de solución de proteína con 250
nL de solución de cristalización, y se equilibró frente a 65 μL de solución de
cristalización presente en cada uno de los pocillos. De esta manera, se pueden probar
rápidamente cientos de soluciones diferentes.
Kits comerciales
JBS Classic 1-4 (Jena Bioscience)
Crystal Screen 1 y 2 (Hampton Research)
Index (Hampton Research)
PACT (Qiagen)
JCSG (Qiagen)
Tabla 4 : Screening microplacas.
Optimización de Condiciones de cristalización

Tras determinar las condiciones preliminares de cristalización se procedió a la
optimización de las mismas. Para ello, en primer lugar, se procede a replicar
manualmente los experimentos a una escala de volúmenes de microlitros usando
disoluciones preparadas en el laboratorio. Estos experimentos se realizan en placas
Linbro de 24 pocillos (Hampton Research) con volúmenes del reservorio de 150 µL y
gotas de entre 2 y 5 µL (se prueban diferentes relaciones de volumen de
proteina:precipitante). Estas placas permiten realizar experimentos de cristalización
mediante difusión de vapor con gota sentada.
Una vez escalados los experimentos, se procede a realizar un análisis
multidimensional, preparando disoluciones en las que se varía la concentración de los
diferentes componentes de la solución de cristalización (Tabla 5.) Finalmente, en caso
de ser necesario, se procede a etapas posteriores de optimización de la mejor
condición de cristalización mediante el empleo de kits de aditivos y/o detergentes.
Relación de volúmenes % %
Tampón
(Prec:Prot) PEG Isopropanol
1:1 Citrato sódico 0,1M pH 4
2:1 Citrato sódico 0,1M pH 4,6 Citrato
6%
1:2 10% sódico 0,1M pH 5 Citrato sódico
8%
2:2 12,5% 0,1M pH 5,6
10%
15% Citrato sódico 0,1M pH 6,2
12%
[Proteína] 17,5% BisTris 0,1 M pH 6,5
15%
25 mg/ml 20% BisTrisPropano 0,1M pH 7,5
20%
20 mg/ml BisTrisPropano 0,1M pH 8
BisTrisPropano 0,1M pH 9,5
Tabla 5 : Condiciones de optimización.
6. Otros ensayos:
6.1 Espectrometría de masas

La masa molecular y la homogeneidad de las proteínas se analizó mediante
espectrometría de masas en el Servicio de Espectrometría de Masas del Instituto de
Química Física “Rocasolano” (IQFR, CSIC). Se empleó un espectrómetro Voyager DE
PRO (Applied Biosystems) equipado con un láser de nitrógeno (λ= 337 nm, anchura
de pulso 10 ns y frecuencia de 3 Hz) y una fuente iónica con extracción retardada. La
ionización de las muestras se lleva a cabo por MALDI (ionización por láser asistida por
matriz).
6.2 Identificación de proteínas mediante huella peptídica y fragmentación

MALDI TOF/TOF
Con objeto de identificar algunas de las proteínas hiperproducidas de forma soluble o

las que se encontraban en la fracción insoluble, las bandas correspondientes del gel
SDS-PAGE se cortaron y analizaron mediante MALDI TOF/TOF. Dicha identificación
se llevó a cabo en el Servicio de Proteómica del Centro de Investigaciones Biológicas
(CIB), CSIC, Madrid.
Brevemente, se realizó una digestión de las muestras con la proteasa tripsina y,
posteriormente, ésta se analizó en el espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF
Autoflex III (Bruker). El espectro de masas resultante presentó una serie de masas
(m/z) que correspondían a los péptidos trípticos característicos de las proteínas
presentes en la muestra. Esas masas y sus fragmentaciones se combinaron y
enfrentaron a una base de datos de proteínas (NCBInr). Empleando el motor de

búsqueda Mascot se compararon todas las masas trípticas teóricas de las proteínas
contenidas en la base de datos frente a las masas experimentales obtenidas a partir
de la muestra. El resultado fue una lista de candidatos estadísticamente validados con
una determinada puntuación (score) para un determinado p-valor (p <0,05).
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Análisis in silico de las secuencias de las proteínas Lp_1424 y Lp_1425
Tal y como se ha comentado anteriormente, el grupo de Biotecnología Bacteriana

determinó que las enzimas involucradas en la reducción de los ácidos fenil propiónicos
eran Lp_1424 y Lp_1425. Un primer análisis de las secuencias de ambas proteínas
mediante la herramienta Standard Protein BLAST®, revela para el caso de Lp_1424
un alto grado de similitud con flavodoxinas, es decir, reductasas dependientes del
cofactor flavín mononucleótido (FMN; Fig. 6), en tanto que para la secuencia de
Lp_1425 revela la presencia de dos módulos: un módulo N-terminal de unión a FMN,
similar a Lp_1424 (Fig. 7), y otro C-terminal de unión a flavín adenín dinucleótido
(FAD) (Fig. 8). Estos resultados son coherentes con la función biológica determinada
para Lp_1424 y Lp_1425. En particular, en la figura 6 aparece el alineamiento de la
secuencia de Lp_1424 con la de la flavodoxina de Pseudomonas aeruginosa, en tanto
que en la figura 7 aparece la comparación entre las secuencias de Lp_1424 y la región
N-terminal de Lp_1425. Por otro lado, la asignación de la región C-terminal de
Lp_1425 como un módulo de unión de FAD se puede deducir de la elevada similitud
de secuencia con la secuencia del dominio homólogo de la fumarato reductasa de
Shewanella oneidensis (Fig. 8). En la figura 9 se muestra la secuencia completa de
Lp_1425 resaltando las dos regiones funcionales deducidas anteriormente.
1rtt MSLSDDIKVLGISGSLRSGSYNSAALQEAIGLVPPGMSIELADISGIPLYNEDVYALGFP
Lp_1424 ------MKFVGIVGTNATKSTNRQLLQYMQRHFQQQATIEICEIKDLPAFNEPED-RTAP
1rtt PAVERFREQIRAADALLFATPEYNYSMAGVLKNAIDWASRPPEQPFSGKPAAILGASAGR
Lp_1424 VAIQQLSDKITAADGVIFATPEYDHSIPAVLKSAIEWLSYT-TRPLINKPVMIVGASNGS
1rtt FGTARAQYHLRQTLVFLDVHPLNKPEV--MISSAQNAFDAQGRLLDDKARELIQQQLQAL
Lp_1424 LGTSRAQAHLRQILEAPELKALVMPNIEYLLGRSLQAFDDQGDLTYPDKVQELDNAFGEF
1rtt QLWVREG-------------------------
Lp_1424 IDFVDLTNKIMPSSQFFEKSKQFSWRQVTGEE
Figura 6. Comparación de la secuencia de la proteína Lp_1424 con la flavodoxina de P.

aeruginosa (código PBD: 1rtt). Los residuos con fondo rojo indican posiciones idénticas y los
que aparecen con fondo azul son posiciones altamente conservadas.
Lp_1424 MKFVGIVGTNATKSTNRQLLQYMQRHFQQQATIEICEIKDLPAFNEPEDRTAPVAIQQLS
Lp_1425 MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQTDSTIIQNFA
Lp_1424 DKITAADGVIFATPEYDHSIPAVLKSAIEWLSYTTRPLINKPVMIVGASNGSLGTSRAQA
Lp_1425 TKIATADGVIIASPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYSVQGSSRAQL
Lp_1424 HLRQILEAPELKALVMPNIEYLLGRSLQAFDDQGDLTYPDKVQELDNAFGEFIDFVDLTN
Lp_1425 HLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAKFQKFATIVA
Lp_1424 KIMPSSQFFEKSKQFSWRQVTGEE
Lp_1425 EMRAPEALSFAPGTYQVTATGHNGELPMRVTLSADRIENIEIDTSSETQGIADV
Figura 7. Comparación de la secuencia de la proteína Lp_1424 con la región N-terminal de

Lp_1425. Los residuos con fondo rojo indican posiciones idénticas y los que aparecen con
fondo azul son posiciones altamente conservadas. En gris aparece parte de la secuencia de
Lp_1425 no homóloga a Lp_1424.
Lp_1425 RIPKEIIAGQTLAVDAISGASITSHGVIDGVARAVKEAGANPDDLKKRRATKQVAQPAVK
1d4c SCH----KGHEKSVAYCD--ACHSFGFDMPFG-GKWERKFVPVDAD--KAAQDKAIAAGV
Lp_1425 EVTTDVVVVGAGGAGMTAAAKVLQAGHQAVVLEKFPAVGGNTVRAGGPMNAADPDWQRQF
1d4c KETTDVVIIGSGGAGLAAAVSARDAGAKVILLEKEPIPGGNTKLAAGGMNAAETKPQAKL
Lp_1425 AALPGEKQTLKDLSERDESTIAPEYRADFRKLKQQIDAYLTANTNQKGTLFDSTLLHRIQ
1d4c GIEDK-KQ----------------------------------------IMIDD-------
Lp_1425 TYLGGQRTDLNGQEIHGQYDLVKELTDNALDSVKWLQSIGVKFDESQVTMPVGAIWRRGH
1d4c --------TMKGGRNINDPELVKVLANNSSDSIDWLTSMGADMTDV--GRMGGASVNRSH
Lp_1425 KPMGDLGFAYIKTL--RAFVEQQGGTIM-TETPVKELLVTDGQVRGVIATNAAHEKVIVH
1d4c RPTGGAGVGAHVAQVLWDNAVKRGTDIRLNSRVVRILEDASGKVTGVLVKGEYTGYYVIK
Lp_1425 ADAVILASGGFAANTKMLQKYNTYWTAIDDDVKTTNSPAMTGDGIRLGTSVGAALVGMGF
1d4c ADAVVIAAGGFAKNNERVSKYDPKLK----GFKATNHPGATGDGLDVALQAGAATRDLEY
Lp_1425 SQMMPVSDPETGELFSGLQVPPANFVMVNQQGKRFVNEYGSRDELTQAAID-NGSLFYLI
1d4c IQAHPTYSPAGGVMITE-AVRGNGAIVVNREGNRFMNEITTRDKASAAILQQKGESAYLV
Lp_1425 ADDEIKKTAYNTTQAKIDQQVANGTLFRADTLTDLAQQIGMDPAALTKTIADYNRYVDAG
1d4c FDDSIRKSLKA-----IEGYVHLNIVKEGKTIEELAKQIDVPAAELAKTVTAYNGFVKSG
Lp_1425 EDPEFHKTAFDLKVAVAPFYATPRKPATHHTMGGLKIDSDAHVL-NTDGQVIDGLYAAGE
1d4c KDAQFERPDLPRELVVAPFYALEIAPAVHHTMGGLVIDTKAEVKSEKTGKPITGLYAAGE
Lp_1425 VAGGIHAGNRLGGNSLSDIFTFGRIAAAHAVAEHVDPVTA
1d4c VTGGVHGANRLGGNAISDIVTYGRIAGASAAKFAKDN---
Figura 8: Comparación de la región C-terminal de la proteína Lp_1425 con la región homóloga

de la fumarato reductasa de Shewanella oneidensis (código PDB: 1d4c). Los residuos con
fondo rojo indican posiciones idénticas y los que aparecen con fondo azul son posiciones
altamente conservadas. En gris aparecen zonas N-terminales no homólogas.
Una observación importante realizada en nuestros trabajos previos de producción y

purificación de la proteína Lp_1425 es que ésta se hidrolizaba, originando un solo
fragmento peptídico de unos 55 kDa de acuerdo a los resultados electroforéticos (Fig.
10). De hecho, el análisis de esta banda mediante espectrometría de masas y huella
peptídica revela que su masa es 56065 Da. Teniendo en cuenta este dato junto con
los péptidos identificados (Fig. 9), pudimos identificar la secuencia específica de este
fragmento, que se corresponde con los 523 últimos residuos. Esta región, por lo tanto,
correspondería al módulo de unión a FAD, que va a ser analizado en este trabajo.
MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQTDSTIIQNFATKIATADGVIIAS
PEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYSVQGSSRAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRA
QTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAKFQKFATIVAEMRAPEALSFAPGTYQVTATGHNGELPMRVTLSADRIEN
IEIDTSSETQGIADVAFERIPKEIIAGQTLAVDAISGASITSHGVIDGVARAVKEAGANPDDLKKRRATKQVA
QPAVKEVTTDVVVVGAGGAGMTAAAKVLQAGHQAVVLEKFPAVGGNTVRAGGPMNAADPDWQRQFAALPGEKQ
TLKDLSERDESTIAPEYRADFRKLKQQIDAYLTANTNQKGTLFDSTLLHRIQTYLGGQRTDLNGQEIHGQYDL
VKELTDNALDSVKWLQSIGVKFDESQVTMPVGAIWRRGHKPMGDLGFAYIKTLRAFVEQQGGTIMTETPVKEL
LVTDGQVRGVIATNAAHEKVIVHADAVILASGGFAANTKMLQKYNTYWTAIDDDVKTTNSPAMTGDGIRLGTS
VGAALVGMGFSQMMPVSDPETGELFSGLQVPPANFVMVNQQGKRFVNEYGSRDELTQAAIDNGSLFYLIADDE
IKKTAYNTTQAKIDQQVANGTLFRADTLTDLAQQIGMDPAALTKTIADYNRYVDAGEDPEFHKTAFDLKVAVA
PFYATPRKPATHHTMGGLKIDSDAHVLNTDGQVIDGLYAAGEVAGGIHAGNRLGGNSLSDIFTFGRIAAAHAV
AEHVDPVTA
Figura 9. Secuencia de Lp_1425 mostrando sus módulos funcionales. Con fondo rojo aparece
señalado el dominio flavodoxina implicado en la unión de FMN y en azul el módulo de unión a
FAD. Asimismo, se indican péptidos encontrados experimentalmente en el análisis de huella
peptídica (subrayado en negro; ver texto para detalles).
Figura 10. Análisis electroforético de la

proteína Lp_1425 recombinante de L.
plantarum WCFS1. 1, proteína
congelada 7 días a -20ºC tras su elución;
2, proteína dializada durante 16 h a 4ºC.
2. Clonación de Lp_1424 y los dominios FMN y FAD de Lp_1425 e

hiperproducción de las proteínas correspondientes
Basándonos en los resultados observados in silico y tras el análisis proteómico, para

desarrollar el estudio estructural de Lp_1424 y Lp_1425 se hicieron las siguientes
construcciones:
o pURI3-Cter (1424+dominio FMN1425): para la producción heteróloga el
heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN
o pURI3-Cter dominio FMN1425: para la produción heteróloga de Lp_1425FMN
o pURI3-Cter dominio FAD1425: para la producción heteróloga de Lp_1425FAD
Todas las construcciones se llevaron a cabo utilizando un método de clonación en

ausencia de ligación (LIC) tal y como se describe en el apartado 3.5 de Materiales y
Métodos.
Para obtener la construcción pURI3-Cter (1424+dominio FMN1425) se utilizaron los
oligonucleótidos 1735 y 1736 (Tabla 3.) y como molde la construcción pURI3-Cter
(1424+1425) de la cual ya se disponía previamente en el laboratorio. En el caso de la
construcción pURI3-Cter dominio FMN1425 en primer lugar se amplificó el fragmento
de lp_1425 correspondiente al dominio FMN mediante PCR utilizando como molde
DNA de L. plantarum WCFS1 y los oligonucleótidos 1731 y 1732 (Tabla 3.) tal y como
muestra la figura 11 A. Una vez amplificado dicho fragmento se purificó siguiendo el

protocolo descrito en el apartado 4.2 de Materiales y Métodos. Con el fragmento
purificado se llevó a cabo la clonación mediante el método LIC descrito previamente
(Apartado 3.5 de Materiales y Métodos) utilizando como plásmido molde pURI3-Cter.
En el caso de la construcción pURI3-Cter domino FAD1425 el abordaje fue el mismo
amplificándose en este caso el fragmento correspondiente al dominio C-ter de 1425,
dominio FAD, con los oligonucleótidos 1793 y 890 (Fig. 11B) para posteriormente, con
este fragmento amplificado y purificado, llevar a cabo la clonación del dominio FAD en
el plásmido pURI3Cter.
Figura 11. Amplificación mediante PCR del fragmento

del gen que codifica (A): el dominio N-terminal de
Lp_1425 (dominio FMN) utilizando los oligonucleótidos
1731 y 1732; (B): el dominio C-terminal de Lp_1425
(dominio FAD) utilizando los oligonucleótidos 1793 y
890
Para seleccionar los plásmidos recombinantes que contenían los genes o fragmentos
de genes de interés se realizó una digestión con la enzima DpnI (tal y como se
describe en el Apartado 3.6 de Materiales y Métodos, con estas digestiones se
transformó la cepa de E. coli DH10B (ver Apartado 3.7 de Materiales y Métodos). De
las colonias obtenidas se hizo una extracción rápida de plásmido (ver Apartado 3.1 de
Materiales y Métodos) y se seleccionó por tamaño la construcción buscada que se
confirmó posteriormente mediante secuenciación (Fig.12)
Figura 12: chequeo de las construcciones (A) pURI3-Cter (1424+dominio FMN1425); (B)
pURI3-Cter domino FMN 1425 y (C) pURI3-Cter dominio FAD1425 mediante el método de
extracción rápida de plásmidos. (A): línea 1,marcador de peso molecular λ T14I (Takara); línea
2, control (pURI3-Cter (1424+1425)) , líneas 3, 4, 5, 7 y 8 pURI3-Cter (1424+dominio
FMN1425), línea 6 pURI3-Cter (1424+1425). (B): línea 1,marcador de peso molecular λ T14I
(Takara); línea 2 control pURI3-Cter; líneas 3,4,5 ,7 y 8 pURI3-Cter dominio FMN1425; línea 6
pURI3-Cter.(C): línea 1,marcador de peso molecular λ T14I (Takara); línea 2, control pURI3-
Cter; líneas 3 y 7 pURI3-Cter; líneas 4, 5, 6 y 8 pURI3-Cter dominio FAD1425.
Una vez seleccionadas las distintas construcciones, con el fin de hiperproducir las
proteínas correspondientes se transformó con cada una de ellas la cepa E.coli
BL21(DE3) de la misma forma que en el caso de la cepa E.coli DH10B descrito
previamente. Esta cepa posee la polimerasa del fago T7 necesaria para la expresión
de los genes clonados en el plásmido pURI3-Cter. Las condiciones de inducción que
se utilizaron fueron 22ºC durante 16 horas, excepto en los casos en los que se
necesitó aumentar la producción y se añadió sorbitol, se indujo con IPTG y se
mantuvo el cultivo 5 días en agitación a 22ºC.
3. Purificación y comportamiento en solución
La estrategia de purificación de las proteínas con las que se ha trabajado con fines
estructurales implica una primera etapa de cromatografía de afinidad a metales
inmovilizados (IMAC) usando una columna de Ni2+-NTA, seguida de una cromatografía
de exclusión molecular con una columna Superdex® 200 prep grade (16/60). Para
poder llevar a cabo la primera etapa cromatográfica se incluyó en las secuencias de
las proteínas recombinantes una etiqueta de 6 histidinas (ver Apartado 4.1 de
Materiales y Métodos). La segunda cromatografía resulta muy eficaz no solo en
términos de purificación sino que también nos permite deducir cómo de homogénea es
la muestra así como estimar la masa molecular de la proteína en solución y, por lo
tanto, su posible carácter oligomérico y finalmente, nos permite separarla del imidazol
empleado para su elución en la primera cromatografía.
3.1. Lp_1425FMN
Este estudio parte del conocimiento previo de la producción y purificación de Lp_1424,

que resultó ser una proteína muy soluble y homogénea, con una masa molecular en
solución consistente con la de un homodímero en solución (47 kDa; resultados no
mostrados). Teniendo en cuenta estos resultados positivos y el alto grado de similitud
de secuencia con el módulo N-terminal de Lp_1425 predicho como módulo de unión
de FMN (Lp_1425FMN) se procedió a producir y purificar esta última construcción que
como puede verse en la figura 9 posee 182 residuos.
A diferencia de lo observado con Lp_1424, el comportamiento de Lp_1425FMN en la
cromatografía de exclusión molecular (Fig. 13) revela la presencia de agregados
solubles masivos, presentes en el volumen de exclusión, así como diferentes especies
de alta masa molecular, desde alrededor de 80 kDa hasta más de 400 kDa. La
conclusión, por lo tanto, es que la muestra es heterogénea en solución, lo cual es
debido a fenómenos de agregación. Esta polidispersión en solución de Lp_1425FMN
no desaparece cuando se añade al medio glicerol (10% v/v), agente frecuentemente
usado con objeto de solubilizar/estabilizar proteínas en estudios estructurales
(Benvenuti & Mangani, 2007). Interesantemente, el volumen del pico de la especie con
menor tamaño presente en el perfil de elución es consistente con una especie

molecular con una masa en solución alrededor de los 43 kDa, lo que indicaría que
Lp_1425FMN formaría especies diméricas en solución, de modo similar a Lp_1424.
El comportamiento mostrado por Lp_1425FMN impidió, en esta etapa preliminar de su
análisis, continuar su estudio mediante cristalografía de proteínas.
Figura 13. Perfil de elución de una muestra de Lp_1425FMN empleando una columna de
exclusión molecular en Superdex® 200 prep grade (16/60). Se indican las masas moleculares
aproximadas de las especies correspondientes a los distintos picos.
3.2. Lp_1424:Lp_1425FMN
La segunda proteína que se ha analizado en este trabajo ha sido el heterodímero

Lp_1424:Lp_1425FMN. La hipótesis de partida de su existencia se basa en resultados
previos de nuestro grupo que demostraron la formación en solución del heterodímero
Lp_1424:Lp_1425. Teniendo en cuenta que ambas proteínas poseen un módulo
flavodoxina (Lp_1424 es, de hecho, un módulo flavodoxina) y que Lp_1424 es un
dímero en solución, lo más razonable es pensar en que el heterodímero
Lp_1424:Lp_1425 se formaría mediante la asociación entre estos dominios
flavodoxina. A su vez, la producción de esta proteína nos hablaría acerca de la posible
estabilización de Lp_1425FMN una vez se asocia con Lp_1424.
De un modo similar al caso anterior, partiendo de homogenizados celulares de cultivos

de E. coli BL21 (DE3) conteniendo pURI3-Cter(1424-1425FMN), la primera etapa
cromatográfica fue una cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC)
usando una columna de Ni2+-NTA. Es de destacar, que la construcción empleada se
diseñó específicamente de manera que solo Lp_1425FMN posee cola de histidinas,
por lo que la presencia de Lp_1424 en el eluido de la columna solo puede explicarse
por su asociación a Lp_1425FMN.
Tal y como puede verse en la figura 14.A, el perfil de elución de esta cromatografía de
afinidad revela un pico en el gradiente de imidazol que, a diferencia de lo observado
con Lp_1425FMN, poseía un fuerte color amarillo indicativo de que la especie o
especies eluidas llevaban unido FMN oxidado. Una vez recogidas las fracciones y
concentradas, la muestra fue aplicada en la columna de Superdex® 200. El perfil de
elución (Fig. 14B) muestra la presencia de un único pico de proteína, con una masa
estimada aproximada de 50 kDa, lo cual es coherente con la existencia del esperado
heterodímero (masa esperada 44 kDa).
Figura 14. Comportamiento cromatográfico del heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN a lo largo

de su purificación. (A) Perfil de elución de la columna de Ni2+-NTA; (B) perfil de elución de la
columna de exclusión molecular en Superdex® 200 prep grade (16/60). Se indica la masa
molecular estimada del heterodímero.
Las fracciones correspondientes al pico se juntaron y la muestra resultante se

concentró, no apareciendo en ningún momento agregación de proteína; de hecho, el
espectro de absorción de la muestra en la región UV-VIS no mostró ningún indicio de
dispersión. En la figura 15 se muestra el espectro de absorción, destacando la
absorbancia en el amarillo.
longitud de onda (nm)

Figura 15. Espectro de absorción en la región del UV-VIS de Lp_1424:Lp_1425FMN. Se puede
observar el máximo local en la región del amarillo (λ= 455 nm). Los máximos a 376 y 455 nm
son característicos del cofactor FMN.
De esta muestra concentrada, se tomó una alícuota y se diluyó en agua bidestilada

para realizar una medida de espectrometría de masas (ver Apartado 6.1 de Materiales
y Métodos). Los resultados revelaron la existencia de dos especies moleculares con
masas de 20953 Da y 22924 Da, las cuales se corresponden con la masa de
Lp_1425FMN (masa por secuencia: 20954 Da) y Lp_1424 (masa por secuencia:
22925 Da).
En su conjunto, estos resultados indican que efectivamente, se ha podido purificar el
heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN, el cual es soluble y estable en solución. Se
podría incluso sugerir que la asociación de Lp_1424 con Lp_1425FMN conlleva una
estabilización de esta última cadena polipeptídica. La proteína, al mostrar un
comportamiento las anteriores características, fue posteriormente empleada para
realizar experimentos de cristalización.
3.3. Lp_1425FAD
La siguiente proteína que se ha analizado en este trabajo ha sido el dominio C-

terminal de Lp_1425, responsable de la unión del cofactor FAD (Fig. 8 y 9). En
realidad, estrictamente, habría que hablar del módulo de unión de FAD de Lp_1425
(Lp_1425FAD). Tal y como se ha descrito anteriormente, el vector de expresión de
Lp_1425FAD se diseñó de acuerdo con los resultados observados con Lp_1425, que
demostraron su degradación para formar una sola especie, posteriormente identificada
mediante espectrometría de masas y huella peptídica. Esta especie tendría 523
aminoácidos y su secuencia aparece en la figura 9.
El protocolo empleado para su purificación es el descrito anteriormente para las otras

proteínas. La cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC) usando una
columna de Ni2+-NTA, reveló la presencia de un pico en el eluido (Fig. 16.A), cuyas
fracciones mostraban un evidente color amarillo que a priori puede asignarse a la

presencia de FAD oxidado. Esto es ya muy importante pues es una evidencia de que
el módulo Lp_1425FAD tiene el sitio de unión del cofactor funcional, coherente con
que el módulo se encuentre bien plegado. Tras concentrar la muestra, ésta se aplicó a
la columna de Superdex® 200, cuyo perfil de elución mostró unas características
similares a lo visto con Lp_1425FMN: presencia de agregados masivos en el volumen
de exclusión y diferentes especies de masas moleculares elevadas (Fig. 16.B). Esto es
indicativo de que el módulo es inestable en solución, formando agregados.
Figura 17. Comportamiento cromatográfico del módulo Lp_1425FAD a lo largo de su

purificación con tampones sin glicerol. (A) Perfil de elución de la columna de Ni2+-NTA; (B)
perfil de elución de la columna de exclusión molecular en Superdex® 200 prep grade (16/60).
Se indica la masa molecular estimada de las distintas especies observadas.
Este mismo protocolo se empleó con tampones conteniendo glicerol 10% (v/v) con
objeto de comprobar su efecto en la solubilidad de la proteína. Mientras que el
comportamiento en la primera etapa cromatográfica fue similar al anterior caso (Fig.
18.A), lo observado en la cromatografía de exclusión molecular indicó un marcado
afecto estabilizador del glicerol (Fig. 18.B): en este caso, se observa el predominio de
un pico que se correspondería con una especie de aproximadamente 60 kDa, es decir,
una masa que correspondiente a un monómero de Lp_1425FAD. Las fracciones
correspondientes a este pico se juntaron y la muestra se concentró, no observándose
síntomas de agregación.
Figura 18. Comportamiento cromatográfico del módulo Lp_1425FAD a lo largo de su

purificación con tampones con glicerol (10 %, v/v). (A) Perfil de elución de la columna de Ni2+-
NTA; (B) perfil de elución de la columna de exclusión molecular en Superdex® 200 prep grade
(16/60).
El espectro de absorción de esta muestra, como era de esperar por su color amarillo,
mostró máximos en esta región del espectro, propios del cofactor FAD (Fig. 19).
Figura 19. Espectro de absorción en la región del UV-VIS de Lp_1425FAD. Se puede observar
el máximo local en la región del amarillo (λ= 460 nm). Los máximos a 375 y 460 nm son
característicos del cofactor FAD.
De la misma manera que antes, se tomó una alícuota de esta muestra para realizar
análisis de espectrometría de masas, que proporcionó un valor de 56894 Da (valor
teórico considerando la cola de 6 histidinas: 56888 Da).
Estos resultados junto con los obtenidos con el heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN y

permiten proponer la idea de que el heterodímero Lp_1424:Lp_1425 se formaría
mediante la asociación de Lp_1424 con el módulo N-terminal flavodoxina de Lp_1425.
El buen comportamiento observado con Lp_1425FAD en presencia de glicerol (10%,
v/v) ha permitido llevar a cabo experimentos preliminares de cristalización.
4. Cristalización
Con objeto de caracterizar la estructura tridimensional del heterodímero

Lp_1424:Lp_1425FMN y del módulo Lp_1425FAD se han realizado los primeros
experimentos de cristalización de ambas proteínas en el Grupo de Cristalografía y
Biología Estructural del Instituto Rocasolano (CSIC). Brevemente, la estrategia general
que se ha seguido conlleva dos etapas: una primera de determinación de condiciones
de cristalización mediante técnicas de alto rendimiento empleando sistemas
automáticos (robots de cristalización), y una segunda de optimización de esas
condiciones preliminares, mediante técnicas manuales
Los resultados de la precristalización (Apartado 5.1 de Materiales y Métodos)

mostraron que con una concentración de 10 mg/mL para ambas proteínas se
observaron precipitaciones cuya magnitud respondía a las concentraciones de los
agentes precipitantes. Por ello, se usó inicialmente esta concentración para las dos
proteínas.
Una vez concluido este primer test inicial, se procedió al uso del robot Innovadyne
Nanodrop ExtY (Solve Scientific). El volumen final de las gotas se ajustó a 500 nL,
resultado de mezclar 250 nL de solución de proteína con 250 nL de solución de
cristalización, y se equilibró frente a 60 μL de solución de cristalización presente en
cada uno de los pocillos. Estos experimentos se realizaron a 18 ºC. (Apartado 5.2 de
Materiales y Métodos) Las placas empleadas contenían diferentes disoluciones de
cristalización derivadas de productos comerciales (Tabla. 4). Una vez realizadas las
mezclas, las placas se sellan con cinta adhesiva para impedir la desecación y se
mantienen a 18ºC.
Después de 24 horas de haber puesto las placas se pudo comprobar para el caso del
heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN la presencia de cristales en una condición del kit
Crystal Screen I y II de Hampton Research ® conteniendo 20% isopropanol, 20%
PEG 4K y 0,1 M citrato sódico, pH 5,6 (Fig. 19).
Figura 19. Cristales del heterodímero Lp1424:Lp_1425FMN obtenidos en 20% isopropanol,

20% PEG 4K y 0,1 M citrato sódico, pH 5,6.
Los resultados obtenidos con Lp_1425FAD, al contrario que los anteriores, fueron
negativos, e indicaron como resultado mayoritario la presencia de precipitados de
proteína desnaturalizada. Por este motivo, nos concentramos en la optimización de las
condiciones determinadas para el heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN. En primer
lugar, lo que se realizó fue la preparación manual de las mismas mezclas, pero con
volúmenes en la escala de microlitros (1 μL proteína más 1 μL condición de
cristalización). Los resultados fueron positivos y aparecieron cristales a los dos días.
Una vez comprobada la repetitividad de la cristalización en la escala de microlitros, se
llevó a cabo un refinamiento de las condiciones de cristalización, variando
sistemáticamente las concentraciones de sus diferentes componentes. (Tabla 5.) De
esta manera, pudimos llegar a unas condiciones optimizadas: 8% Isopropanol, 17,5%
PEG 4K y 0,1 M citrato sódico, pH 5,6. Es de destacar, que los cristales obtenidos son
amarillos, lo cual es una evidencia de que son cristales de proteína (que contienen
FMN oxidado). Esta es una observación importante por cuanto un aspecto que ha de
considerarse en estos experimentos, es que en numerosos casos, se obtienen
cristales de sal. Finalmente, los cristales optimizados eran una barras con tenían unas
dimensiones aproximadas de 0,1 x 0,2 x 0,3 mm3.
Los resultados alcanzados en este trabajo han supuesto un notable avance en el

proyecto de caracterización estructural del heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN, y de
hecho en la actualidad estamos en la fase de preparación de cristales para hacer
experimentos de difracción de rayos X en fuentes de radiación sincrotrón.
Previsiblemente, los resultados van a permitir resolver su estructura lo cual supondría
alcanzar resultados importantes en el modo mediante el cual las dos principales
proteínas implicadas en la reducción de ácidos hidroxicinámicos llevan a cabo esta
función.
V. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS
Conclusiones
Los resultados obtenidos en este trabajo permiten llegar a las siguientes conclusiones:
o Se ha podido producir y purificar satisfactoriamente el heterodímero
Lp_1424:Lp_1425FMN y el módulo Lp_1425FAD, en tanto que ambas proteínas son
estables en solución.
o El módulo Lp_1425FAD es monomérico en solución y une FAD, por lo que
estructuralmente es un dominio, esto es, una unidad de plegamiento independiente.
Teniendo en cuenta esto, junto con la evidencia previa de que existe el heterodímero
Lp_1424:Lp_1425 (resultados previos), se puede inferir que la asociación entre
Lp_1424 y Lp_1425 se produce a través del módulo amino terminal flavodoxina de
ésta última. La relevancia funcional de este hecho aún no la comprendemos y se está
investigando.
o El módulo Lp_1425FMN es inestable en solución, evolucionando a agregados
masivos. Los resultados cromatográficos indican no obstante la presencia de un
dímero en solución como unidad de menor tamaño molecular. Puesto que el
heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN es estable en solución, parece evidente que
deben existir elementos estructurales específicos que hacen que la asociación entre
monómeros de Lp_1425FMN sea energéticamente desfavorable. Es indudable que la
estructura del heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN ofrecerá claves para comprender
este hecho.
Conclusions
The results obtained in this work lead to the following conclusions:

o The Lp_1424: Lp_1425FMN heterodimer and the Lp_1425FAD module have
been satisfactorily produced and purified; both proteins are stable in solution.
o The Lp_1425FAD module is monomeric in solution and binds FAD, so it can be
defined as a domain, that is, as an independent folding unit. Taking this into account,
together with the evidence that the Lp_1424: Lp_1425 heterodimer exists (previous
results), it can be inferred that the association between Lp_1424 and Lp_1425 occurs
through the flavodoxin amino terminal module of the latter. The functional relevance of
this fact is not yet understood and is being investigated.
o The Lp_1425FMN module is unstable in solution, evolving into massive
aggregates. The chromatographic results indicate, however, the presence of a dimer in
solution as the smallest molecular unit. Since the Lp_1424: Lp_1425FMN heterodimer
in solution, it seems clear that there must be specific structural elements which make
the association between Lp_1425FMN monomers energetically unfavorable. There is
no doubt that the structure of the Lp_1424: Lp_1425FMN heterodimer will provide
clues to understanding this fact.
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

TRABAJO FIN DE MÁSTER

Caracterización estructural de enzimas

Biotecnología Bacteriana Biotecnología Bacteriana Dept. de Cristalografía y Departamento de

Lactobacillus plantarum is present in a wide variety of plant substrates and agri-food

o FMN: flavín mononucleótido

Los compuestos fenólicos son un conjunto heterogéneo de moléculas que poseen en

La mayoría de ellos se sintetizan en plantas superiores a partir del aminoácido L-

1.1. Influencia de los compuestos fenólicos en las propiedades sensoriales de

Algunas de las propiedades organolépticas de los alimentos y bebidas de origen

1.2. Efectos de los compuestos fenólicos en la salud del consumidor.

En la actualidad los compuestos fenólicos son de especial interés y estudio debido a

La gestión de residuos constituye uno de los problemas medioambientales más

algunos casos son explotados en la industria de la cosmética, alimentación animal o

2. Bacterias lácticas (BAL) en alimentos

2.1 Metabolismo de compuestos fenólicos en BAL.

Las BAL se encuentran presentes en una gran variedad de sustratos vegetales y

correspondientes etil derivados. Se estudió la capacidad para producir fenoles

2.2 Metabolismo de compuestos fenólicos por Lactobacillus plantarum

Lactobacillus constituye un género de bacterias heterofermentativas que pertenece al

Al tratarse de una bacteria GRAS (Generally Recognized as Safe), L. plantarum es la

actividad tanasa. Finalmente, también se ha estudiado el efecto del crecimiento de

2.3 Degradación de ácidos hidroxicinámicos por L. plantarum.

Figura 2: Esquema-resumen del metabolismo de ácidos hidroxicinámicos de L. plantarum.

En la actualidad el grupo de Biotecnología Bacteriana del ICTAN ha identificado,

Las flavoproteínas son enzimas que catalizan reacciones de oxidación-reducción

Figura 3: Estructura química de los nucleótidos de flavina.

Con respecto a actividades reductasas en el género Lactobacillus, recientemente

investigación demostró la necesidad de la formación del heterodímero para la unión

Tanto en la fermentación de sustratos vegetales como en el TGI humano. L. plantarum

III. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos.

cepas Genotipo/Fenotipo relevante Referencia/Origen

Tabla 1. Estirpes bacterianas empleadas en este trabajo

Plásmido Genotipo/Fenotipo relevante Referencia/Origen

Oligonucleótido Secuencia (5´→3´)

Tabla 3. Oligonucleótidos empleados en este trabajo

2. Medios y condiciones de cultivo.

Las cepas de Escherichia coli se convervaron congeladas a -80ºC en el medio de

3.1 Extracción de ADN plasmídico

3.2 Amplificación de secuencias de ADN mediante PCR

Para la amplificación de las secuencias se utilizaron los reactivos de las casas

3.3 Electroforesis de ADN en geles de agarosa.

Para resolver las muestras de ADN se utilizaron geles de agarosa al 0,7% ó 2% en

3.4 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa

3.5 Clonación independiente de ligación (LIC)

En este trabajo se utilizó como vector de expresión pURI3-Cter de la familia pURI

constituida por un residuo de metionina en el extremo amino terminal y la cola de

Figura 4. Esquema del plásmido pURI3-Cterminal

3.6 Manipulación de DNA con enzimas de uso común en biología molecular

3.7 Transformación genética de cepas bacterianas de E.coli

Para la transformación genética de E. coli, se prepararon células competentes

4.1 Hiperproducción de proteínas recombinantes

incubaron 24 horas a 22 °C con agitación. En algunos casos en los que el medio

4.2 Purificación de proteínas recombinantes.

Finalizado el periodo de inducción las células se recogieron mediante centrifugación a

Cromatografía IMAC con TALON® (cobalto inmovilizado)

Cromatografía IMAC con HisTrap (níquel inmovilizado)

a la columna previamente cargada de Ni2+ y equilibrada en tampón 20 mM Tris, pH 8.0

5.1 Ensayos de pre-cristalización

5.2 Ensayos de cristalización de alto rendimiento

Screening de condiciones de cristalización

Scientific). Se emplearon placas Innovaplate SD2 de 96 pocillos (Fig.5 ) previamente