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Biodegradación
https://doi.org/10.1007/s10532-020-09918-7

(0123456789().,-volV()0123458697().,-volV)
PAPEL ORIGINAL

Degradación microbiana de pesticidas organofosforados usando

células enteras y extractos enzimáticos

JY Santillán. A. Muzlera. M. Molina. ES Lewkowicz. AM Iribarren

Recibido: 10 febrero 2020 / Aceptado: 1 noviembre 2020

- Springer Nature BV 2020

ResumenEl uso de fosfotriesterasas microbianas en la fuentes, se probaron adicionalmente como biocatalizadores

degradación de compuestos organofosforados empleados como
pesticidas, plastificantes y aditivos de petróleo es una alternativa
sustentable para la biorremediación de aguas y suelos,
descontaminación de alimentos particulares y como antídoto
contra intoxicaciones. Células enteras de seis microorganismos
de tipo salvaje:Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces
setonii, Nocardia corynebacterioides, Nocardia asteroidesy dos
Arthrobacter oxydans—seleccionado en nuestro laboratorio
como fosfotriesterasa
Material complementario electrónicoLa versión en línea de este
artículo (https://doi.org/10.1007/s10532-020-09918-7) contiene
material complementario, que está disponible para los usuarios
autorizados.
JY Santillán - A. Muzlera - M. Molina -
ES Lewkowicz - AM Iribarren Laboratorio de Biocatálisis y
Bio transformaciones, Departamento de Ciencia y
Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, CONICET,
Roque Sáenz Peña 352, Bernal 1876, Buenos Aires,
Argentina
A. Muzlera
Laboratorio de Fisiologı́a y Genética de bacterias
beneficiosas para plantas, Centro de bioquı́mica y
microbiologı́a de suelos, Universidad Nacional de
Quilmes, Buenos Aires, Argentina
AM Iribarren (&)
Laboratorio de Biocatálisis y Bio transformaciones,
Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad
Nacional de Quilmes, RS Peña 352. Bernal (1876),
Buenos Aires, Argentina
correo electrónico: airibarren@unq.edu.ar
en la hidrólisis de paraoxón, metilparaoxón, metilparatión,
coroxón, cumafós, diclorvos y clorpirifos, destacando una
conversión del 98 % de clorpirifos en sus productos de
hidrólisis utilizando células enteras deS. phaeochromogenesa
pH 8 y 40 -C. También se evaluaron células enteras
inmovilizadas y extractos enzimáticos, observándose como
tendencia general, que no existe una variación significativa
en la actividad hidrolítica entre ellos. Estos resultados
sugieren que, según las circunstancias, se podrían utilizar
células enteras inmovilizadas (evitando la disrupción celular y
la centrifugación) o extractos enzimáticos (que pueden
manipularse más fácilmente).
Palabras claveFosfotriesterasas - Compuestos
organofosforados - Biodegradación - Pesticidas -
Bacterias - Biorremediación
Introducción
Los compuestos organofosforados (OP) se sintetizaron
como agentes de guerra química durante la Segunda
Guerra Mundial y luego comenzaron a usarse como
pesticidas, plastificantes y aditivos del petróleo (Singh
2009). Su uso excesivo en la agricultura y los hogares
produce contaminación ambiental y alta toxicidad en los
mamíferos (Kim et al.2014). Los OP previenen la hidrólisis
del neurotransmisor acetilcolina a colina al actuar como
inhibidores irreversibles de la acetilcolinesterasa.

123

En consecuencia, la acetilcolina se acumula en el cuerpo
causando una sobreestimulación de los impulsos nerviosos,
convulsiones, fallas respiratorias y eventualmente la muerte
(Theriot y Grunden2011). Por lo tanto, la identificación de
microorganismos capaces de degradar los OP es relevante
para aplicaciones como el monitoreo y la remediación
ambiental. Además, las hidrolasas OP microbianas
purificadas podrían usarse como antídoto contra el
envenenamiento por OP mediante el uso de liposomas y
otros portadores basados en polímeros biocompatibles para
administrar estas enzimas (Iyer e Iken2015; Liu et al.2015).
Por esta razón, se ha aislado y estudiado una variedad de
bacterias degradadoras de organofosforados, como
Brevundimonas diminuta, Flavobacteriumsp.,Alteromonas
sp.,Bacilo estearohemófilo, Nocardia sp.,Escherichia coli,
Arthrobacter, Corynebacterium glutamicumyBurkholderiasp.
(Manco et al.2018).
Dentro del grupo de las OP hidrolasas, las
fosfotriesterasas (PTEs, EC 3.1.8.1) constituyen un grupo
de enzimas que catalizan la hidrólisis estereoselectiva de
un gran número de fosfotriésteres (Elias et al.2008).
Ejercen su actividad mediante la escisión del enlace P-O,
P-N o P-S, y difieren en su especificidad de sustrato y
masa molecular (Sogorb et al.2004). Como consecuencia,
un gran número de estructuras OP como paraoxón,
clorpirifos, paratión, metilparatión, cumafós,
monocrotofós y fenamifós pueden ser hidrolizados por
estas enzimas, siendo este el primer y principal paso en
este proceso de desintoxicación. Luego, los productos de
hidrólisis de OP pueden ser utilizados como fuente de
carbono y/o fósforo por una amplia variedad de bacterias
del suelo y el agua (Iyer et al.2013; Kumar et al.2018).
Una alternativa rentable a la aplicación a gran escala
de hidrolasas organofosforadas aisladas consiste en el
uso de microorganismos como células enteras en
crecimiento o en reposo (Singh2009; de Carvalho2017).
En particular, para fines de biorremediación microbiana,
diferentes parámetros juegan un papel importante, pero
entre ellos el pH y la temperatura son especialmente
relevantes (Niti et al.2013). Singh et al. han informado
efectos del pH y la temperatura del suelo sobre la
degradación de clorpirifos y fenamifos observando un
aumento en la actividad a pH más altos y en el rango de
temperatura de 15 a 35 °C (Singh et al.2003a,b).
En nuestro laboratorio hemos evaluado y optimizado
previamente las condiciones de hidrólisis (pH y temperatura)
del metilparaoxon empleando como biocatalizadores seis
nuevas fuentes de PTEs bacterianas:Streptomyces
phaeochromogenes, Streptomyces setonii, Nocardia
123
Biodegradación
corynebacterioides, Nocardia asteroidesy dos
Arthrobacter oxydans (Santillán et al.2016). En el presente
trabajo se evaluaron estos microorganismos en la
hidrólisis de diferentes OPs como paraoxon, metil
paratión, coroxon, cumafós, diclorvos y clorpirifos (Fig.1).
La actividad de la PTE se estudió empleando células
enteras y extractos enzimáticos, tanto libres como
inmovilizados en perlas de alginato de calcio.
materiales y métodos
quimicos
Paraoxon, metil paratión, cumafós, diclorvos y
clorpirifos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, EE. UU.). El paraoxon y el coroxon de metilo se
sintetizaron mediante desulfuración oxidativa a partir
de paratión de metilo y cumafós, respectivamente
(Bielawski y Casida1988).
Los disolventes de calidad analítica y HPLC eran de
Biopack, Sintorgan o JT Baker. Los reactivos de los medios
de cultivo se obtuvieron de Merck o Biopack.
microorganismos
Todos los microorganismos se cultivaron en condiciones
optimizadas según CECT.B. diminutaCIP 7129 (Bd),A.
oxydansATCC 14358 (C55) yA. oxydans ATCC 14359 (C64)
se cultivaron en medio de agar nutritivo II (1 g de
extracto de carne, 5 g de peptona, 2 g de extracto de
levadura, 5 g de NaCl, 1 LH2O).Streptomyces
phaeochromogenesCCRC 10811 (C13) yS. setoniiATCC
39116 se cultivaron en medio Streptomyces (4 g de
glucosa, 10 g de extracto de malta, 4 g de extracto de
levadura, 2 g de CaCO3, 1 izq.2O).N. asteroidesATCC 19296
(C49) se cultivó en medio Bennett-s (4 g de glucosa, 10 g
de extracto de malta, 4 g de extracto de levadura, 1 LH2
O), mientras queN. corynebacterioidesATCC 14898 (C39)
en agar nutritivo I con 1 % de maltosa (5 g de extracto de
carne, 10 g de peptona, 10 g de NaCl, 10 g de maltosa, 1
LH2O). Todos los cultivos se realizaron durante 72 h.
Biodegradación
Figura 1aReacción general de hidrólisis de compuestos organofosforados.bCompuestos organofosforados utilizados como sustratos en este trabajo
biocatalizadores
Células enteras
Las cepas de bacterias se cultivaron como se mencionó
anteriormente (en ''microorganismos'' sección) y la densidad
óptica se midió a 600 nm. Se recolectó una alícuota que contenía
la cantidad requerida de células por centrifugación a 86009g
durante 5 min. Los sedimentos celulares resultantes se
emplearon directamente como biocatalizadores.
extracto de enzima
Se obtuvo la fracción de membrana de cada bacteria y se
estudió como biocatalizador. Pellet celular que contiene
1,291010celdas (obtenidas como en ''Células enteras''
sección) se resuspendió en 10 ml de agua destilada y se
rompió por ultrasonicación usando el disruptor Vibra-cell,
VCX130 (Sonics, EE. UU.), al 50% de amplitud durante 5
ciclos a 4 °C. Posteriormente, esta suspensión se
centrifugó a 86009g durante 15 min y el sedimento
resultante que contenía la fracción de membrana se
analizó más como biocatalizador, ya que las PTE suelen
estar asociadas con la membrana celular (Mulbry y Karns
1989).
123

inmovilización
1.291010Las células o los extractos enzimáticos obtenidos a partir
del mismo número de células se resuspendieron en una solución
de alginato de sodio al 2% (p/v). A continuación, estas
suspensiones se añadieron gota a gota a una disolución de CaCl
100 mM bien agitada.2solución. Las perlas de gel de alginato de
calcio obtenidas se mantuvieron en el mismo CaCl2solución con
agitación suave durante 1 h para dejarlas endurecer y finalmente
se lavaron con solución fisiológica (NaClac
0,9%).
Ensayos de actividad
Los gránulos que contienen 29109células enteras,
obtenidas como se menciona en el ''microorganismos'' y ''
Células enteras'', se agregaron a la mezcla de reacción
que consta de OP 2 mM en 1 ml de tampón Tris-HCl 50
mM pH 8. La hidrólisis enzimática se ensayó en
condiciones estándar (pH 8 y 30 -C) y condiciones
optimizadas para cada biocatalizador:S.
phaeochromogenes a pH 8–40 -C;S. setonii, N. asteroides
yA. oxydans C64 a pH 8–50 -C;B. diminuta, N.
corynebacterioidesyA. oxydansC55 a pH 8–60 -C (Santillan
et al.2016) utilizando como sustratos paraoxón,
metilparatión, cumafós, coroxón, diclorvos y clorpirifos.
La misma mezcla de reacción sin células se usó como
control químico, mientras que esta mezcla de reacción
pero usandoB. diminutaLas células como biocatalizador
se utilizaron como control positivo. La determinación de
las velocidades de reacción iniciales (V0) se llevó a cabo
analizando 50yoL muestras tomadas a los 0, 15, 30, 45,
60, 90, 120 y 150 min.
Degradación de compuestos organofosforados
biocatalizados
Las reacciones se realizaron en 6 ml de mezclas de
reacción que contenían una solución de OP 0,15 mM en
tampón Tris-HCl 50 mM pH 8, y los biocatalizadores libres
o inmovilizados deS. phaeochromogenes, S. setonii, N.
asteroides, A. oxydansC55 yA. oxydansC64 (dependiendo
del OP en estudio) usando condiciones estándar y
optimizadas (como se detalla en ''Ensayos de actividad''
sección. Santillán et al.2016) durante 21 días. Además, se
ensayó un control químico en las mismas condiciones
pero sin biocatalizador.
123
Biodegradación
Métodos de análisis de muestras
Metil paraoxón, paraoxón y metil paratión
La producción depags-El nitrofenol (PNF) se cuantificó
midiendo la absorbancia a 405 nm en una placa de 96
pocillos utilizando un Cytation 5 (BioTek Instruments,
Inc., EE. UU.). La curva de calibración se construyó
utilizando soluciones estándar de PNF (0, 0,01, 0,025,
0,05, 0,075 y 0,1 mM).
Coroxon y cumafós
Chlorferon (CF), el producto fluorescente de la
hidrólisis enzimática de coroxon y cumafós (kellos=
355nm, kex= 460 nm), se detectó empleando un
Cytation 5 (BioTek Instruments, Inc., EE. UU.). La
cuantificación de clorferón se realizó empleando la
correspondiente curva de calibración (0, 0,01, 0,025,
0,05, 0,075 y 0,1 mM).
Diclorvos y clorpirifos
La hidrólisis de diclorvos y clorpirifos se determinó
por consumo de sustrato utilizando un HPLC (Gilson,
EE. UU.) con detección UV y un C18Columna (Gracia
Apolo 5yometro, 15094,6 mm, HiChrom, Inglaterra).
Las condiciones analíticas de diclorvos fueron: fase
móvil acetonitrilo:agua 48:52 durante 16 min, flujo 0,9
mL min-1, 280nm; mientras que para el clorpirifos las
condiciones analíticas fueron acetonitrilo:ácido
fosfórico acuoso al 1% 80:20 como fase móvil durante
16 min, flujo 0,9 mL min-1, 235 nm. La cuantificación se
realizó empleando una curva de calibración con
patrones de diclorvos y clorpirifos (0.01 a 0.1 mM).
análisis estadístico
La significación estadística se evaluó utilizando el software
estadístico Prism 5 (Graph Pad, Inc., EE. UU.). Todos los
experimentos fueron realizados por triplicado. Los resultados se
expresaron como valores medios±DAKOTA DEL SUR. Para las
comparaciones múltiples entre los grupos experimentales se
realizó ANOVA de dos vías [seguido de la prueba de comparación
del intervalo de confianza (IC) del 95% medio]. Los niveles
significativos se definieron como p <0,05.
Biodegradación
Resultados y discusión
Actividad de PTE contra diferentes compuestos
organofosforados por células completas microbianas
Previamente en nuestro laboratorio, seis bacterias de
tipo salvaje fueron seleccionadas y estudiadas como
biocatalizadores de células enteras para la hidrólisis de
metilparaoxón, elegidas como sustrato modelo, y usando
B. diminutacomo biocatalizador de referencia. La
actividad hidrolítica se determinó
espectrofotométricamente en condiciones estándar (30
-C, pH 8) y las tasas iniciales de hidrólisis (V0), medidas
durante las primeras 2,5 h de reacción, se usaron para
comparar la actividad. Posteriormente se evaluaron
diferentes condiciones de pH y temperatura,
seleccionando una condición optimizada para cada
biocatalizador.S. setoniifue el microorganismo que
exhibió mayor capacidad degradante en el tratamiento
del sustrato modelo, mostrando 33 veces más actividad
queB. diminutay un aumento de 30 veces en la actividad
en condiciones optimizadas con respecto a las
condiciones estándar (Fig.2a) (Santillán et al.2016).
En el presente trabajo se utilizaron los microorganismos
previamente estudiados como biocatalizadores para la
degradación de diferentes OPs: paraoxon, metil paratión,
coroxon, cumafós, diclorvos y clorpirifos. Para seleccionar un
biocatalizador óptimo para la biodegradación de cada
sustrato, se determinaron los datos de degradación a lo largo
del tiempo en condiciones estándar y optimizadas (Fig. S1).
Figura2muestra la V correspondiente0valores de estos
compuestos. En general, cuando se evaluó el metil paratión
como sustrato, se observó una marcada disminución de la
hidrólisis en comparación con la obtenida para el
correspondiente análogo oxigenado (metil paraoxon). La
única diferencia estructural entre estos sustratos es la
sustitución del oxígeno fosforilado del metilparaoxón por
azufre en el metilparatión. La menor electronegatividad del
azufre provoca una disminución de la naturaleza electrofílica
del átomo de fósforo y, en consecuencia, una disminución de
su reactividad frente a la hidrólisis (Hong y Raushel 1996). Sin
embargo, vale la pena resaltar queA. oxydansLa cepa C64 en
condiciones optimizadas catalizó la hidrólisis de metil
paratión de manera más eficiente (2 veces mayor Vo) que la
hidrólisis de metil paraoxon. Además, este biocatalizador era
10 veces más
activa en la hidrólisis de metilparatión que la cepa de
controlB. diminutaen las mismas condiciones (Fig.2b).
Cuando se empleó paraoxon como sustrato (Fig.2c) la
mayoría de los microorganismos mostraron una
disminución de la actividad con respecto a la obtenida
para el metilparaoxon, a excepción deN. asteroidesque
exhibió una velocidad de reacción similar en condiciones
optimizadas. Es más,N. asteroidesen esas condiciones de
reacción mostró la mayor actividad, excediendo 148
veces la V0valor obtenido en condiciones estándar. Estas
variaciones podrían estar correlacionadas con el reporte
de Dornaski (1989) quien estudió la relación entre la
estructura del sustrato y la actividad de PTE deB.
diminuta.La sustitución de etoxi por grupos metoxi en el
sustrato produjo un aumento en la Km sin cambios
significativos en la Vmax. Sin embargo, cuando estos
grupos se cambiaron a los grupos propilo y butilo, los
valores de Vmax y km disminuyeron sustancialmente, lo
que sugiere que el sitio activo que se une a la porción
alquilo del sustrato sería hidrofóbico (Donarski et al.1989
).
Cuando se evaluaron OP estructuralmente diversos
como coroxon y cumafós,N. asteroidesfue la cepa que
catalizó más eficientemente la degradación de coroxon,
mientras queS. phaeochromogenesfue el mejor
biocatalizador para la hidrólisis de cumafós (Fig.2d, e).
Este último biocatalizador fue 3 veces más activo en
condiciones optimizadas y también dos veces más activo
que la cepa control. Al comparar la hidrólisis de coroxon y
cumaphos, como se esperaba y de acuerdo con el
informe de Horne (2002) quien evaluó la actividad
hidrolítica dePseudomonas monteilliC11 para estos dos
OP, el oxon se degradó más rápido (Horne et al.2002).
Además, estos OP más voluminosos se hidrolizaron de
manera menos eficiente que el metilparaoxón, el
paraoxón y el metilparatión.
Para el diclorvos, la mayoría de los biocatalizadores
ensayados mostraron actividades hidrolíticas más altas
que para los otros derivados del oxón. Este resultado
podría atribuirse al hecho de que, estructuralmente, este
OP es el sustrato probado más pequeño. Además, el
grupo saliente del diclorvos (alcohol diclorovinílico) se
tautomeriza a dicloroacetaldehído y, al ser muy volátil, no
se acumula en el medio de reacción, alterando el
equilibrio y favoreciendo así la hidrólisis. En particular,A.
oxydansC55 exhibió las tasas de hidrólisis más altas,
hasta 100 y 2,5 veces más altas que
B. diminutaen condiciones de reacción estándar y
optimizadas, respectivamente (Fig.2F).
123
 Biodegradación

123
 Biodegradación
bFigura 2Comparación de velocidades de reacción iniciales (V0) obtenido por
Degradación de compuestos organofosforados en condiciones
estándar (30 -C, pH 8) y optimizadas (S. phaeochromogenes (C13):
pH 8 y 40 -C;S. setonii (C35),N. asteroides (C49) y
A. oxydans (C64): pH 8 y 50 -C;B. diminuta (bd),N.
corynebacterioides (C39) yA. oxydans (C55): pH 8 y 60 -C) por
células enteras microbianas. Los resultados se expresan como
media±SD, ANOVA de dos vías seguido de prueba post hoc de
Bonferroni. Se realizaron análisis estadísticos comparando las
condiciones de reacción entre sí para cada cepa (***P\ 0,001,
**P\0,01, *P\0,05). Se compararon las actividades de PTE entre
biocatalizadores para cada sustrato (###P\0.001)
El clorpirifos es uno de los OP más utilizados por su bajo
costo y fácil acceso. Cuando se analizó su degradación,
cuatro de los seis microorganismos de tipo salvaje
estudiados en este trabajo:S. phaeochromogenes, A. oxydans
C55,S. setoniiyN. corynebacterioidesmostró alta actividad,
siendo 3,5, 3, 2,5 y 2 veces más activa queB. diminutaen
condiciones estándar (Fig.2gramo). Estos resultados son
particularmente interesantes considerando que el clorpirifos
es un derivado del tiofosfotriéster y, como se mencionó
anteriormente, estos compuestos son menos susceptibles a
la hidrólisis. Es destacable el hecho de que para este sustrato,
en contraste con la mayoría de los resultados obtenidos, se
observaron velocidades de hidrólisis más altas en
condiciones estándar que en condiciones optimizadas. Esto
demuestra que aunque la selección de las condiciones
generales de reacción puede ser útil, en este caso particular
sería más apropiada la optimización para cada sustrato.
Los resultados obtenidos en este trabajo permitieron
seleccionar especies bacterianas novedosas capaces de
degradar de manera eficiente cada uno de los OP ensayados
(Tabla1). Si bien, el uso deStreptomyces chattanoogensis y
Streptomyces olivochromogenesha sido reportada en la
degradación de clorpirifos en medios mínimos a tasas
similares a las obtenidas en este trabajo paraS.
phaeochromogenes,el hecho de que este último
biocatalizador no requiera nutrientes para llevar a cabo la
hidrólisis de los OPs, le confiere una ventaja frente a la
biodegradación mediante células en crecimiento.
Biodegradación de compuestos organofosforados utilizando
diferentes formas de biocatalizadores
Extracto enzimático frente a células enteras
Con vistas a desarrollar un biocatalizador adecuado para un
biorreactor, se estudiaron más a fondo las bacterias que
exhibían la mayor actividad de PTE para cada OP. Dado que
la PTE a menudo es una proteína de la membrana celular, los
OP deben difundirse a través de la membrana externa para
interactuar con la enzima, lo que representa una desventaja
con respecto a las enzimas extracelulares. Para superar esta
limitación, se ha desarrollado la expresión de la proteína en
superficies bacterianas (Ghanem y Raushel 2005; Kapoor y
Rajagopal2011; Yuan et al.2011). Como alternativa,
proponemos en este trabajo el uso de extractos enzimáticos
generados por sonicación y centrifugación de las bacterias
seleccionadas. Este procedimiento produce gránulos que
contienen el PTE asociado a los desechos de la membrana.
Este extracto enzimático expone la enzima al medio de
reacción, y además, ayudaría a preservar el entorno natural
de la proteína, manteniendo su plegamiento y actividad. La
biodegradación de OPs se llevó a cabo durante 21 días en
condiciones estándar y optimizadas ya que transcurrido este
tiempo no se observaron diferencias significativas en el perfil
de hidrólisis (Fig. S2). Se utilizaron soluciones compuestas por
0.15 mM de OPs considerando que en general esta es la
concentración de las formulaciones comerciales utilizadas en
la agricultura como plaguicidas (Álvarez et al.2013).
En la mayoría de los casos, los extractos enzimáticos
mostraron actividades de PTE más altas que las células
enteras correspondientes.S. setonii El extracto enzimático
produjo un 21 % más de degradación de metilparaoxon que
las células enteras en condiciones estándar, mientras que en
condiciones optimizadas no se observaron diferencias
significativas (Fig.3a). El paratión de metilo se hidrolizó
completamente en condiciones optimizadas medianteA.
oxydansextracto de enzima C64, mientras que solo se
observó una degradación del 15% con células completas (Fig.
3b). Adicionalmente, la eficiencia hidrolítica alcanzada por
estos microorganismos tanto en condiciones estándar como
optimizadas podría aprovecharse combinándolos para
descontaminar ambientes tratados con metilparatión, ya que
el metilparaoxón siempre está presente en estos ambientes,
como producto de la oxidación fotolítica del metilparatión
(Jaga y Dharmani2006).
123
 Biodegradación

123
 Biodegradación

bFig. 3Porcentaje de compuestos organofosforados biodegra- Se estudió cumafós 0,15 mM, no se observó producción de
dación empleando células enteras libres o inmovilizadas y
clorferón (datos no mostrados), probablemente debido a su
extractos enzimáticos en condiciones estándar (30 -C, pH 8) y
baja solubilidad en comparación con otros OP. Sin embargo,
optimizadas (S. setonii, N. asteroidesyA. oxydansC64: pH 8 y 50 -C;
S. phaeochromogenes:pH 8 y 40 -C yA. oxydansC55: pH 8 y 60 -C) al igual que el par metil paratión-metil paraoxon, el cumafós
a los 21 días de reacción. La mezcla de reacción sin biocatalizador puede oxidarse por fotólisis, lo que da como resultado el
se utilizó como control de degradación química. Los resultados se
coroxon, por lo que el uso deN. asteroides podría ser una
expresan como media±SD, ANOVA de dos vías seguido de prueba
alternativa para la remediación de ambos contaminantes.
post hoc de Bonferroni: ***P\0.001,
* * P\0.01 y *P\0.05 significados al comparar las condiciones
de reacción para cada tipo de biocatalizador,###P\0.001 y Por otra parte, el tratamiento del diclorvos con
##
P\ 0,01 significación cuando se compararon células A. oxydansLas células enteras C55 en condiciones
completas y extractos enzimáticos.???P\0.001 y??P\0.01
optimizadas produjeron un 70% de hidrólisis, lo que
significancia cuando se compararon biocatalizadores libres e
inmovilizados representa un 17% más de degradación con respecto al
extracto enzimático (Fig.3mi). Según este resultado,S.
phaeochromogeneslas células enteras fueron el mejor
biocatalizador para la biodegradación de clorpirifos (98%) en
Cuando se estudió la hidrólisis de paraoxon utilizando
condiciones optimizadas (pH 8, 40 -C) (Fig.3F). Este resultado
el extracto enzimático deN. asteroidescomo
es mejor que el informado por Vidya Lakshmi et al., quienes
biocatalizador se alcanzó un 80% de hidrólisis, lo que
emplearon consorcios microbianos que permitieron una
representa un incremento del 15% respecto a la
degradación del 46–72 % de 50 mg L-1clorpirifos como única
conversión obtenida con células enteras en condiciones
fuente de carbono en medio acuoso a 37 -C después de 20
optimizadas (Fig.3C). Además, la degradación alcanzada
días. (Vidya Lakshmi et al.2008).
usandoN. asteroides las células enteras en condiciones
estándar son similares o incluso superiores (1,5 mg L-1d-1)
Biocatalizadores libres vs inmovilizados
que los reportados empleandoStenotrophomonas
maltophilia, Aeromonas hydrophiliayExiguobacterium
Con la perspectiva de desarrollar un biorreactor para el
indicum,que degradó 1,4 mg L-1d-1y 0,46 mg L-1d-1de
tratamiento de agua contaminada con pesticidas
paraoxon a pH 7, 30 -C (Iyer e Iken2013).
organofosforados, tanto las células enteras como los extractos
Siguiendo la misma tendencia, los estudios de degradación de
enzimáticos fueron inmovilizados por atrapamiento en perlas de
coroxon mostraron los mejores resultados utilizando el extracto
alginato de calcio. En la mayoría de los casos, una disminución de
enzimático deN. asteroidesen condiciones optimizadas (82%) (Fig.
la actividad hidrolítica de los biocatalizadores inmovilizados
3d). En cambio, cuando la degradación de

tabla 1Velocidades de reacción iniciales (V0) calculado para la (S. phaeochromogenes:pH 8 y 40 -C;S. setonii, N.
degradación de diferentes compuestos organofosforados empleando asteroidesyA. oxydansC64: pH 8 y 50 -C;B. diminuta, N.
los microorganismos que exhibieron la mayor actividad para cada corynebacterioidesyA. oxydansC55: pH 8 y 60 -C)
sustrato en condiciones estándar (30 -C: pH 8) y optimizadas

Compuesto organofosforado Microorganismo V0(yomol min-1)

Condición estándar Condición optimizada

paraoxón de metilo S. setonii 0.89±0.04 27.2±0.2***

paratión de metilo A. oxydansC64 0.19±0.05 1.82±0.01***
Paraoxón N. asteroides 0.07±0.01 9.6±0.2***
Coroxón N. asteroides 0.12±0.01 0.17±0,02**
cumafós S. phaeochromogenes 0.008±0.002 0.024±0,003**
Diclorvos A. oxydansC55 1.01±0.09 6.68±0,12***
clorpirifos S. phaeochromogenes 31.5±2.6 16.4±4.9*

La comparación de V0entre las condiciones de reacción para cada sustrato y los resultados se expresaron como media±SD,
ANOVA de dos vías seguido de prueba post hoc de Bonferroni (***P\0.001, **P\0.01, *P\0.05)

123

se observó tanto en condiciones estándar como optimizadas
(Fig.3), que es una consecuencia habitual de las técnicas de
inmovilización por atrapamiento. Esta menor actividad se
relacionó con posibles problemas de transferencia de masa,
ya que los sustratos deben pasar a través de la matriz de
alginato de calcio para acceder al biocatalizador. A pesar de
esta desventaja, la inmovilización permite una mayor
estabilidad, una separación más fácil del biocatalizador del
medio de reacción y, como consecuencia directa, una
reutilización más eficiente (Polakovič et al.2017).
Por otro lado, cuando se compararon los catalizadores
libres e inmovilizados, no se observaron variaciones
relevantes en el perfil de degradación. La excepción fueron
los inmovilizados.S. phaeochromogenescélulas enteras en la
hidrólisis de clorpirifos en condiciones optimizadas, que
degradaron el 75% de la cantidad inicial del sustrato, siendo
estos resultados similares a los obtenidos recientemente por
nuestro grupo de investigación conesfingomonassp.
(Santillán et al.2020). Esto y el reporte de García-Mancha et
al., respecto al uso de un reactor anaeróbico de lecho de
lodos granulares expandidos (EGSB) que alcanzó mayores
porcentajes de degradación (96%) a 55 -C que en condiciones
mesófilas (35 -C), sugieren que inmovilizóS.
phaeochromogenesSe podrían aplicar células enteras en un
biorreactor de lecho empacado para el tratamiento de aguas
residuales (Garcı́a-Mancha et al. 2017). Además, cuando el
extracto enzimático inmovilizado deS. phaeochromogenesse
utilizó como biocatalizador, hidrolizó el 20 % del clorpirifos
inicial, mientras que el biocatalizador libre solo mostró una
degradación del 4 %, lo que sugiere que el proceso de
inmovilización podría mejorar la estabilidad del extracto
enzimático.
La versatilidad de los biocatalizadores estudiados
ofrece la posibilidad de elegir, según las circunstancias
(condiciones ambientales o tipo de sistema: agua o
suelo), células enteras (evitando la disrupción celular y la
centrifugación) o extractos enzimáticos (que pueden
manipularse fácilmente), libres o inmovilizado.
Conclusiones
En este trabajo, con vistas a la biorremediación de aguas
contaminadas con OPs, hemos estudiado seis
microorganismos de tipo salvaje en la degradación de
diferentes OPs. Debido al amplio uso como insecticidas
de diclorvos y clorpirifos, los resultados logrados usando
células enteras deA. oxydansyS. phaeochromogenes, que
en condiciones optimizadas llegó a 70 y
123
Biodegradación
98% de degradación respectivamente, son dignos de mención.
También hemos estudiado los correspondientes extractos
enzimáticos, así como la forma inmovilizada de todos los
biocatalizadores ensayados. Los resultados obtenidos mostraron
que tanto las células enteras inmovilizadas como los extractos
enzimáticos son biocatalizadores potencialmente útiles para ser
aplicados en la descontaminación de aguas. Además, los
biocatalizadores estudiados mostraron actividades diferenciales a
diferentes pH y temperaturas, lo que también los hace atractivos
para la biorremediación de suelos y para la descontaminación de
alimentos particulares (Yu et al.2006; Akram y Mushtaq 2017).
AgradecimientosEste estudio fue apoyado por una
subvención de OPAQ (L/ICA/ICB/190041/14), UNQ y ANPCyT
(PICT 2011–2007). ESL y AMI son Miembros de la Carrera de
Investigador Científico del CONICET. JYS y AM son Becarios
CONICET.
Cumplimiento de normas éticas
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún
conflicto de intereses.
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Nota del editorSpringer Nature se mantiene neutral con respecto
a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones
institucionales.
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