Procesos Genéticos de Conservación y

Transferencia de la Información Genética

Dogma Central
de la Biología
Replicación del DNA, preparación para la división
celular

La necesidad de copiar precisamente el DNA durante la replicación

 Replicación del ADN

Referencias complementarias

Principles and concepts of DNA replication in Bacteria, Archaea and Eukarya.

O ´Donnell et al. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2013. Review
Plasmid Rolling circle replication
Ruiz Masó et al. Microbiol Spectrum 2015 ASM Press
Experimentos de Meselson y Stahl
Experimento
 El ADN se replica mediante un mecanismo semiconservativo
(Meselson y Stahl, 1958)

Crecimiento de células de E. coli en medio con 15NH4 (pesado, H).Se transfieren a medio con 14NH4 (liviano,
L). Se tomaron muestras y se analizó el ADN por centrifugación en gradiente de densidad (separa en bandas
diferentes los duplex HH, LL y HL). El ADN se visualizó bajo luz UV. El número de generaciones se calcula por
conteo de las células en cada muestra.
Copia de una hebra molde de ADN en una
complementaria es, por lo tanto, una
característica común de la replicación del
ADN
Síntesis de ADN
semiconservativa
Síntesis de ADN: ADN polimerasas
Replicón
Fragmento de ADN capaz de replicarse en forma independiente

Posee elementos de control: origen (ori) y terminador (en bacterias)

Ejemplos :

- Cromosoma bacteriano (generalmente un único ori)

- Plásmidos (ADN extracromosomal)

- Virus , bacteriófagos

- Cromosomas eucariotas (varios replicones)

Ambas hebras hijas se sintetizan coordinadamente y en forma simultánea
creciendo en sentido 5´- 3´

Una de las hebras se sintetiza en forma continua (hebra conductora) en igual

dirección que la horquilla de replicación
La otra en forma discontinua en sentido opuesto a la horquilla de replicación (hebra
rezagada) en fragmentos pequeños.
Los fragmentos de Okazaki pueden tener diferente longitud (~1000-2000 nt en
bacterias y ~ 200 nt en eucariotas)

«Horquilla» de replicación
Mecanismo bidireccional de replicación del ADN

Las horquillas de replicación son asimétricas

 ADN polimerasas
ü Enzimas que catalizan la polimerización del ADN
ü Requieren de una hebra de ADN molde y un cebador (simple cadena
complementaria asociada a la hebra molde con OH 3´ libre)

ü Participan en la replicación y/o reparación del ADN

ü Replicasas están involucradas en la replicación
ü Poseen actividad de síntesis en sentido 5’- 3’ y actividad exonucleasa
(remoción de nt) en sentido 3’-5’ (corrección o proofreading).

dNMP= dnt monoP

dNTP= dnt triP
The self-correcting properties of the DNA
polymerase = perfectly base-paired primer
terminus
not posible to start synthesis de novo,
without an existing primer.

the RNA polymerase enzymes involved in

gene transcription do not
need such an efficient exonucleolytic
proofreading mechanism: errors in making
RNA are not passed on to the next
generation, and the occasional defective
RNA
molecule that is produced has no long-term
significance.
RNA polymerases are
thus able to start new polynucleotide chains
without a primer.
 La actividad exonucleasa 3’- 5’ de la ADN
polimerasa elimina nucleótidos
incorrectos durante la polimerización del
ADN (proofreading)

Mejora >100 veces la fidelidad de la ADN

polimerasa
Tasa de error de la ADN polimerasa en bacterias
~10 -9 por cada par de bases que se replican

Cambios conformacionales en la ADN pol. III

conducen al extremo 3´de la cadena con nt
incorrecto hacia el dominio exonucleasa y
vice -versa
a. Sitio activo de la ADN pol.
Apareamientos AT y GC encajan
adecuadamente, permiten la catálisis.
Apareamientos incorrectos no
encajan adecuadamente, no ocurre la
catálisis.

b. Estructura tridimensional de la
ADN pol + ADN
DNA primasa: síntesis de primer de
RNA

Remueven los primers

Se sintetiza DNA

Se liga
DNA helicasas
DNA topoisomerasa
Single-strand DNA-binding proteins (SSB)
Sliding clamp that holds DNA polymerase on
the DNA
 Replisoma

Proteínas de la replicación del ADN. Son comunes en todos los tipos

celulares

Helicasa: desnaturaliza la doble cadena del ADN

Topoisomerasa (girasa): libera la tensión por delante de las horquillas
SSB (proteínas de unión a la cadena simple): estabilizan las cadenas simples
Primasa: sintetiza los cebadores (ARN)
ADN polimerasas (replicasas): polimerización/corrección del ADN
Abrazaderas (sliding clamps): aumentan procesividad de la ADN polimerasa
Cargador de la abrazadera (clamp loader): carga la abrazadera para la síntesis de
cada fragmento de Okazaki

Proteínas accesorias: exonucleasas (remoción de los cebadores), ADN

ligasas
La replicación se inicia en regiones llamadas origen de replicación (ORI)

A partir de un ori, la replicación puede

ser:

Unidireccional (una horquilla)

Bidireccional (dos horquillas

opuestas)
 Inicio de la replicación
La replicación se inicia en los ori y es generalmente bidireccional

A. Procariotas
Cromosoma circular con un origen
Replicación bidireccional

B. Eucariotas
Cromosomas lineales largos (varios)
Replicación bidireccional en
múltiples ori en cada cromosoma
ARS (autonomous replicating
sequences) en levaduras
 Cada cromosoma eucarionte varios replicones

Los cromosomas eucariontes

poseen varios ori cada 3-300 kpb

Se activan en tiempos
determinados durante la fase S del
ciclo de división celular

Replicación es bidireccional

En Saccharomyces cereviciae
(levadura) se han identificado
orígenes de replicación llamados
ARS (autonomous replication
sequences), ricos en AT con una
región mínima de 11 pb

Proteínas ORC (origin recognition

complex) reconocen el ori. Se asocian
con proteínas que acoplan la helicasa
 Inicio de la replicación en el cromosoma bacteriano
El origen del cromosoma de E. coli (ori C
(cromosoma)) tiene 245 pb y es rico en secuencias
con AT

Funciones del ori:

Iniciar la replicación, controlar la frecuencia de eventos
de iniciación
Proteínas que participan en la iniciación de la
replicación:
Proteína iniciadora (DnaA): Se une al oriC, inicia el
desenrollamiento de la doble cadena de ADN, recluta
otras proteínas involucradas en síntesis de ADN
 Arquitectura del replisoma en las bacterias

Beattie et al. Front. Microbiol. 2015

ADN polimerasa III: Replicasa principal en las bacterias

Formada por varias subunidades (900 kDa):
- Unidad catalítica (core): subunidad polimerasa 5’-3’ (α) ; subunidad exonucleasa 3’-5’ (ε)
Cada unidad catalítica se une a una hebra de ADN molde
- Unidad de dimerización (t): Mantiene a las unidades catalíticas unidas
- Abrazadera (β2). Unidad de procesividad: mantiene a la unidad catalítica asociada al ADN
molde
- Cargador de la abrazadera (γ) (Clamp loader) acopla las abrazaderas al ADN molde
Las topoisomerasas relajan la tensión (supercoils) delante de la
horquilla de replicación

La desnaturalización del ADN doble

cadena durante la replicación
genera torsión (superenrollamiento)
por delante de la horquilla

El corte transitorio de la
cadena permite la libre
rotación de las hebras de ADN
Bacterias

ADN PoIimerasa I elimina los cebadores de ARN (exonucleasa 5´-3´) y los

reemplaza con ADN (polimerasa 5-3´) en los fragmentos de Okazaki
Inicio de la Replicación
en eukariotas
 Comparación del Replisoma en bacterias y eucariontes

Antigeno T/MCM: proteína iniciadora, helicasa

ADN Pol α/primasa. Síntesis de cebadores mixtos: ~10 nt ARN+ 20-30 nt ADN.
ADN Pol δ /ɛ : Elongación de hebra líder (pol ɛ) y hebra rezagada (pol δ)
PCNA (proliferating cell nuclear antigen): abrazadera
RFC: cargador de abrazadera
Ribonucleasas MF1 y FEN-1; RNsa H: Remoción de cebadores
Nucleosomas en el contexto de la replicación
Cómo termina la replicación en
los cromosomas lineales de
organismos eucariontes??

Cuando se elimina el último cebador

de ARN de la hebra discontínua no
existe un extremo 0H3´ donde la
ADN pol. pueda iniciar la síntesis
para rellenar la hebra faltante.
La hebra hija se acortaría en cada
ciclo de división celular.
 Telomerasa
La Telomerasa agrega secuencias
repetitivas (sec. teloméricas) en los
extremos 3´ (cadena molde de la hebra
retrasada) de los cromosomas eucariontes
(líneas rojas). Esto permite completar la
síntesis del ADN en los extremos (líneas
verdes)
Mecanismo de la telomerasa
Es un complejo proteína + ARN (ARN
sirve de molde para la síntesis de la
sec. telomérica). Tiene actividad de
transcriptasa reversa (síntesis de ADN
sobre molde de ARN)
 Telómeros

ü Extremos de los cromosomas lineales

ü Poseen ~1000 repeticiones en tandem de secuencias cortas de ADN
ricas en G (TTAGGG en vertebrados) en el extremo 3’ terminal de cada
cromosoma. Esta hebra posee una prolongación de cadena simple de
12-16 nt
ü Son sintetizados por la telomerasa (complejo de ARN + proteína)

ü Mayor expresión/actividad de Telomerasa en células germinales y

células cancerígenas (alta tasa de replicación)
ü Inhibidores de la telomerasa posibles agentes terapéuticos
ü Ausencia de telomerasa contribuye a la senescencia de las células
El acortamiento/desgaste de
los telómeros conduce al
envejecimiento celular

Células tumorales del

sistema nervioso
(neuroblastoma) presentan
un aumento en la
expresión/actividad de la
telomerasa
 REPLICACION EXTRACROMOSOMAL
Volvamos a definir plásmidos: Los plásmidos son moléculas
de ADN extracromosómico generalmente circular que se replican de manera
autónoma y se transmiten (esto último por un proceso llamado conjugación)
independientemente del ADN cromosómico.

Vectores plasmídicos de clonado: permiten clonar ADN exógeno

Plásmidos (Ori) Horquilla de replicación. Bidireccional

Plásmidos de transferencia (OriT) Mecanismo es distinto=

Circulo rodante
Virus
 REPLICACION EXTRACROMOSOMAL
Replicación en Círculo Rodante, RCR (unidireccional)
La bacteria dadora F+ transfiere una copia del
plásmido conjugativo F a la receptora F-,
mediante replicación por RCR (izquierda)

Replicación del bacteriófago ʎ

Varias vueltas del mecanismo RCR producen genomas de fago
concatenados.
El concatenado es procesado por endonucleasa del fago