EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

ENZIMÁTICA

Kelly Benitez1, Amaury Salazar1, Luis Garcia1, Juan Espinosa1, Juan Rodriguez1
1
Sucre (Colombia). Universidad de Sucre. Facultad de Ingeniería, Programa de ingeniería
Agroindustrial. Asignatura Bioingeniería II.

PALABRAS CLAVES RESUMEN

Almidón, alfa-amilasa,
Se evaluó el efecto de la temperatura en un rango entre 40
azucares, actividad,
y 60°C sobre la velocidad de reacción enzimática de una
DNS, catalizador.
reacción empleando como reactivo una solución de
almidón en presencia de un catalizador (alfa- amilasa);
para cuantificar la concentración de producto (azucares
reductores) se empleó la técnica del DNS y las
velocidades se determinaron según el método de las
velocidades iniciales. Los resultados obtenidos fueron de
0,0201 g/L.min a 40°C, 0,0211 g/L.min a 45 °C; -0,0031
g/L.min a 50°C; 0,0345 g/L.min a 55°C y -0,0280 g/L.min
a 60°C.

KEYWORDS: Starch, ABSTRACT

alpha-amylase, sugars,
The effect of temperature in a range between 40 and 60 °
activity, DNS, catalyst.
C on the enzymatic reaction rate of a reaction was
evaluated using as a reagent a starch solution in the
presence of a catalyst (alpha-amylase); The DNS
technique was used to quantify the product concentration
(reducing sugars) and the speeds were determined
according to the initial speed method. The results obtained
were -0.0201 g/Lmin at 40 ° C, 0.0211 g/Lmin at 45 ° C; -
0.0031 min-1 at 50 ° C; 0.0345 min-1 at 55 ° C and -
0.0280 min-1 at 60 ° C.
 INTRODUCCIÓN Las amilasas son enzimas empleadas en
el procesamiento de almidón, para
En una reacción enzimática, los reactivos
hidrolizar los enlaces y obtener productos
se denominan sustratos, es decir la
de bajo peso molecular como glucosa,
sustancia sobre la que actúa la enzima,
maltosa y unidades de maltotriosa. La alfa
que es modificado químicamente y se
amilasa es la más popular e importante
convierte en uno o más productos. Como
forma de amilasa industrial (Arguero &
esta reacción es reversible, la enzima libre
Espín, 2014). Se pueden obtener de
se encuentra en la misma forma química
plantas, animales y microorganismos, sin
al comienzo y al final de la reacción. La
embargo las procedentes de fuentes
velocidad de una reacción está
fúngicas y bacterianas son las que han
relacionada con las concentraciones de las
dominado aplicaciones en sectores
especies reaccionantes (Zapata &
industriales (Clavijo, 2017).
Saavedra, 2016).
El objetivo de la experimentación
Las enzimas sufren cambios en la
consistió en evaluar el efecto de la
conformación estructural que suelen ir
temperatura en la velocidad de reacción
asociados con cambios en la actividad
enzimática de una solución de almidón
catalítica, donde el pH y la temperatura
soluble en presencia de α-amilasa en
son los factores que influyen de manera
condiciones de pH 5 a temperaturas de
más directa sobre la actividad de una
40, 45, 50, 55 y 60°C.
enzima (Llenque & Mercado, 2011).

Las enzimas en general exhiben una MATERIALES Y METODOS

excelente especificidad y regio-
Se preparó una solución de almidón
selectividad de sustrato por lo que ha
soluble al 30 %w/v, a partir de dicha
incrementado su demanda especialmente
solución se tomó un volumen de 50 mL
de compuestos ópticamente puros,
para cada temperatura de trabajo en un
además estos procesos de
biorreactor. Se estabilizó el pH de la
biotransformación se llevan a cabo bajo
solución a 5.0 con HCl. Las temperaturas
condiciones suaves de reacción
de Biorreacción fueron de 40, 45, 50, 55 y
reduciendo costos de producción (Peña,
60ºC con velocidad de agitación de 300
Molina, & Torres, 2009).
rpm. Se adicionó la solución enzimática
de α-amilasa, en una relación de 100 µL
por cada gramo de almidón y 100 µg de
CaCl2 por cada gramo de almidón.
Una vez preparada las muestras a las
respectivas temperaturas se tomaron, 500
μL de muestra en los tiempos: 0, 15, 30,
y 45 minutos de reacción. Las muestras
tomadas se sumergieron en agua
hirviendo (~100ºC) durante 5 minutos
para inactivar la enzima, y posteriormente
se realizó choque térmico en baño de
hielo (~4ºC). La determinación de
azucares reductores se determinó a través
de la técnica del DNS. Las velocidades
iniciales de reacción para las
temperaturas se calcularon utilizando el
método de las velocidades iniciales.
RESULTADOS Y ANALISIS
Curva de calibración
En la tabla 1 se ilustran los datos de
concentración de azúcar y absorbancia de
las muestras con las cuales se realiza la
curva de calibración del grafico 1. Las
curvas de calibración funcionan como un
marco de referencia que se construye de
cantidades conocidas de una sustancia, en
este caso azucares, que se utiliza para
determinar la cantidad de azúcar presente
en una muestra de almidón soluble en
presencia de alfa-amilasa a temperatura
de reacción establecida, a partir de la
absorbancia de las muestras se interpola
de la ecuación de dicha curva de
calibración y se cuantifican los azucares.
Tabla 1: datos de concentración de
azucares y absorbancia de la curva de
calibración.
Concentración de
Absorbancia
azucares
1 0,068
2 0,170
3 0,423
4 0,669
5 1,839
6 2,606
7 2,972
8 3,012
9 3,300
Grafico 1: Curva de calibración.
Absorbancia vs Concentración
azucares
10
Concentración azucares
8
6
Series1
4
2
Lineal
0 (Series1)
0 2 4
y = 1,9741x + 1,6968
R² = 0,9374 Absorbancia
Velocidades de reacción

Tabla 2: Concentración de azúcares reductores de la reacción de almidón soluble y alfa-

amilasa a las temperaturas de trabajo.

Concentración de azucares reductores (g/L)

TIEMPO
40°C 45°C 50°C 55°C 60°C
0 3,9670 4,6224 4,7330 3,8407 6,3863
15 6,4159 6,3833 4,8248 4,0401 4,6876
30 4,5987 5,6904 4,0894 7,5224 4,5898
45 3,5702 5,9076 4,8228 4,4053 5,0212

En la tabla 2 se observa la cuantificación de velocidad a la cual ocurre la reacción

de los azucares presentes en la reacción a según el método de las velocidades
las diferentes temperaturas de trabajo iniciales tal como se observa en la tabla 3.
durante 0, 15, 30 y 45 minutos, a partir de
Zapata (2016), manifiesta que es
estos valores se realiza el grafico 2 en el
preferible medir las velocidades iniciales
cual se observa el comportamiento de
en los primeros minutos de reacción
dicha concentración de azucares en el
porque a medida que la reacción procede
tiempo y los cambios que sufre a las
la concentración de los reactivos
temperaturas de biorreacción. De forma
disminuye y por tanto la velocidad
general puede mencionarse que las curvas
disminuye. El método facilita la
presentan comportamientos muy
interpretación de los resultados,
similares entre sí, puesto que es posible
experimentales, sin embargo el modelo
identificar una zona de aumento seguida
cinético obtenido solo es válido para los
de una caída de la concentración cercanas
momentos iniciales de la reacción,
o por debajo al valor inicial, sin embargo
pudiendo no serlo a tiempos de reacción
obtenemos pendientes positivas para las
superiores. Otra desventaja del método es
temperaturas de 45 y 55°C y negativas
que se la reacción se considera de primer
para las temperaturas de 40, 50 y 60°C.
orden y se requiere validar si el modelo
Estos valores corresponden a la constante
cinético asumido es válido (Martínez, 55°C es casi dos veces la velocidad de
Rodríguez, Requena, & Jurado, 2005). reacción a los 45°C, esto coincide con lo
reportado por Llenque & Mercado
Los resultados difieren de los esperados
(2011), quienes mencionan lo expresado
puesto que autores como Arguero &
por Montgomery & col (1998), acerca de
Espín (2014), aseguran que el rango de
que por cada 10ºC de incremento, la
temperatura óptimo de la alfa-amilasa se
velocidad de reacción se duplica.
encuentra entre los 20 y 90°C para
Quintero, Montoya & Gutiérrez (2009)
aquellas de origen bacteriano y entre 20 y
afirman que entre 45°C y 72 °C la alfa-
55°C para las de origen fúngico sin
amilasa trabaja con una eficiencia
perder su actividad enzimática.
superior al 80% y su actividad decrece
Considerando que las velocidades rápidamente por encima de 80ºC.
negativas son producto de errores Someter la enzima a la temperatura
cometidos al momento de preparar las óptima de reacción, se debe a que tanto la
muestras, se procede a realizar el análisis velocidad de reacción de la enzima como
para las temperaturas de 45 y 55°C. De la velocidad de inactivación térmica de la
acuerdo a los resultados de la tabla 3 se misma se ven incrementadas con la
observa que la velocidad de reacción a los temperatura (Terebiznik, 1998).

Grafico 2: Tiempo de biorreación versus concentración de azucares reductores.

Tiempo vs Concentración azucares

8,0000 y = 0,0345x + 4,1757 [] azu red 40°C
y = 0,0211x + 5,1765
R² = 0,1493
Concentración azucares (g/L)

7,0000 R² = 0,301 [] azu red 45°C

6,0000
[] azu red 50°C
5,0000
4,0000 [] azu red 55°C

3,0000 y = -0,028x + 5,8002

y = -0,0201x + 5,0891 [] azu red 60°C
R² = 0,4245
2,0000 R² = 0,0952
y = -0,0031x + 4,6874 Lineal ([] azu
1,0000 R² = 0,0288 red 40°C)
Lineal ([] azu
0,0000
red 45°C)
0 10 20 30 40 50
Tiempo (min)
Tabla 3: Velocidades de reacción a las temperaturas de biorreación.

𝑻 (°𝐂) 𝝂 (g/L.min) 𝝂 (mol/L.S) 𝟏/𝑻 (K-1) 𝐥𝐧 𝝂

40
-0,0201 -0,007438 0,00319 -
45
0,0211 0,007808 0,00314 -8,946946
50
-0,0031 -0,001147 0,00310 -
55
0,0345 0,012767 0,00305 -8,455260
60
-0,0280 -0,010361 0,00300 -

Parámetros de Arrhenius Grafico 3: Parámetros de Arrehnius.

La ecuación de Arrehnius relaciona la

-4,300000
velocidad y la temperatura de la siguiente 0,003000 0,003100 0,003200
-4,400000
manera: y = -5128,5x + 11,275
-4,500000
R² = 1
Ln V

𝐸𝐴 -4,600000
𝜈=𝐴 𝑒 (−𝑅 𝑇) -4,700000 Series1

-4,800000
Lineal
Para determinar los parámetros de la -4,900000 (Series1)
1/V
reacción se emplea el método grafico en
su forma logarítmica de la siguiente La 𝐸𝑎 de la reacción fue de 42638,35
forma: J/mol, es decir, la energía cinética mínima
𝐸𝑎 1 de la colisión necesaria para que la
ln 𝜈 = ln 𝐴 −
R 𝑇
reacción ocurriera y el valor de A fue de
78826,14 mol/L.S, siendo la frecuencia
Donde la pendiente de la recta
con la que se producen las colisiones (con
corresponde a (– 𝐸𝑎 ⁄𝑅) y el intercepto
orientación adecuada) en la mezcla
con el eje de las ordenadas es ln 𝐴 en el
reactiva por unidad de concentración
grafico 3.
(UniversitatdeValencia, S.F).
 CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

La temperatura afectó la velocidad de Arguero, A., & Espín, N. (2014). Estudio

reacción de manera que a mayor de la producción de enzima amilasa
temperatura mayor velocidad, lo cual mediante Aspergillus Niger por
indica que la velocidad no se mantiene fermentación sólida, con el uso de
fija durante el tiempo en que transcurre la residuos agroindustriales. Escuela
reacción. Politécnica Nacional. Facultad de
Ingeniería Química y Agroindustrial.
La velocidad de reacción de las muestras
depende de la temperatura pero también Clavijo, M. (2017). Ingeniería de Alfa-
de la concentración de los reactivos y las Amilasas; Enzimas para la producción de
presencia o ausencia de catalizadores. biocombustibles. XXI Encuentro de
Jóvenes Investigadores de la Universidad
La velocidad máxima se alcanzó bajo
Nacional del Litoral.
condiciones de temperatura de 55°C y pH
acido de 5. Llenque, L., & Mercado, P. (2011).
Efecto de la temperatura, pH y
Los resultados obtenidos difieran a los
concentración de sustrato sobre la
reportados por la bibliografía por lo que
velocidad de hidrólisis del almidón de
se considera que hubo errores en los
papa por Bacillus subtilis nativo en un
procedimientos de preparación de las
bioreactor cilindrico agitado. Universidad
muestras, técnica de DNS y lectura de
Nacional de Trujillo.
absorbancias.
Martínez, J., Rodríguez, V., Requena, A.,
Las pruebas deben realizarse por
& Jurado, E. (2005). Utilización de a-
triplicado para cada muestra tal como lo
amilasas en la formulación de detergentes
sugiere la guía de trabajo para tener
especiales . Universidad de Granada.
resultados más seguros.
Facultad de Ciencias.
Los procesos experimentales difieren de
Peña, A., Molina, D., & Torres, R.
la realidad por lo cual puede decirse que
(2009). Hidrólisis de almidón de yuca
la eficiencia del proceso no es del 100%
mediante la utilización de preparaciones
solubles e insolubilizadas de alfa -
amilasa ( Aspergillus niger). Memorias
del IV Simposio de Química Aplicada –
SIQUIA 2009 .

Quintero, M., Montoya, O., & Gutiérrez,

P. (2010). Purificación y carcterización de
a-Amilasa producida por la cepa nativa
Bacillus sp. BBM1. Dyna.

Terebiznik, M. (1998). Alfa-amilasa de

Aspergillus oryzae: estudios de
producción por fermentación en sustrato
sólido, purificación y estabilización.
Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales. Universidad de Buenos Aires.

UniversitatdeValencia. (S.F). Tema 5. La

velocidad de las Reacciones Químicas II.
Obtenido de
https://www.uv.es/tunon/pdf_doc/TEMA
5_07_08.pdf

Zapata, J., & Saavedra, S. (2016). Efecto

de la temperatura sobre la velocidad de
reacción den benzaldehído y n-butanol en
la síntesis del di-n-butil acetal del
benzaldehído. Universidad Nacional de
Trujillo. Facultad Nacional de Trujillo.