Departamento de Bioingeniería- Campus Guadalajara

Laboratorio de Enzimología y Biocatálisis (BT2006.1)

Escuela de Ingeniería y Ciencias  Primavera 2020 

Práctica 2. Cinética enzimática de la fosfatasa ácida del hígado de pollo 

Sonia Batiz A01229545, Salma Valeria Del Toro Quintanar A01633673, Paulina Campos León A01351128,Sergio Díaz
Castro A01632296
Resumen  

La presente práctica tiene como propósito la determinación de los parámetros cinéticos ​K​m​, dependiente de la
afinidad de la enzima por el sustrato, y V​max​, velocidad máxima dependiente de la concentración de la
enzima, de la fosfatasa ácida de hígado de pollo; así como evaluar los efectos del tiempo en la
formación de producto, de la concentración de la enzima y del sustrato sobre la actividad enzimática,
por separado. El cálculo de la concentración de producto (p-nitrofenol) se realizó en base a la Ley de
Lambert-Beer con la absorbancia y el coeficiente de extinción 17.5 mM​.1 cm​-1​. Resulta sencillo obtener
la velocidad de reacción al dividirlo entre el tiempo, al representarla frente a la concentración de
sustrato se obtiene una hipérbola rectangular cuya expresión es la ecuación de Michaelis-Menten. En
la representación de Lineweaver-Burk se presentan los inversos de las velocidades enzimáticas frente
a los inversos de las respectivas concentraciones de sustrato y es así como se obtuvieron los
parámetros K​m (1.301 mM) y V​max (0.016 mM/min). Al momento de evaluar la presencia del inhibidor se
obtuvieron: V​max de 0.003 mM/min y de K​m de 1.095 mM con 50 uL de inhibidor. En vista de la
disminución de los valores, el inhibidor se determinó medianamente competitivo. Se concluyó para esta
enzima que una concentración 1:1 de enzima-sustrato es lo ideal para maximizar el rendimiento; una
vez alcanzada una velocidad máxima de reacción en los primeros minutos es improbable que se vea
alterada significativamente por otra variable.

Introducción   próstata, estómago, hígado, músculo, bazo, eritrocitos

La cinética enzimática mide la velocidad de
reacción de las enzimas, lo cual permite distinguir entre
enzimas, conocer la afinidad de los sustratos, distinguir
entre isoenzimas, entre otros. Esta se mide con la
ecuación de Michaelis- Menten, las reacciones
enzimáticas se caracterizan por no tener un
comportamiento lineal ya que la velocidad depende de
la cantidad de enzima con sustrato suficiente (​Cinética
enzimática—EcuRed​, s. f.).
Las enzimas fosfatasa presentan una actividad
hidrolasa con la capacidad de eliminar un grupo fosfato
inorgánico a un sustrato (​Fosfatasa | La guía de
Biología​, s. f.). Las fosfatasas ácidas se encuentran en
casi todos los tejidos, tienen una mayor presencia en
y plaquetas
(​Fosfatasa_acida_total_y_prostatica_cinetica_sp.pdf​, s.
f.). Estas enzimas en particular son enzimas
hidrolíticas de localización lisosómica actúan en los
ésteres del ácido fosfórico (Santana et al., 2001). Suele
trabajar en pH de 5, libera alcohol y fosfato inorgánico,
las fosfatasas ácidas de hígado tienen una alta afinidad
por el sustrato p-nitrofenil fosfato, mientras que el fenol
actúa como un inhibidor de tipo no competitivo y el
fosfato inorgánico tiene una inhibición competitiva
(Guija et al., 2007).
El objetivo de la práctica es determinar los
parámetros cinéticos, K​m y V​max de la fosfatasa ácida de
hígado de pollo, determinar el efecto del fosfato en la
actividad de la fosfatasa ácida, además de aprender a

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calcular los parámetros cinéticos y el tratamiento de la
enzima.
Materiales y Métodos   cada tubo en el espectrofotómetro UV-VIS a 410 nm
Para efectuar el experimento se requieren las
siguientes soluciones: 25 mM de p-nitrofenil-fosfato,
amortiguador (pH 5) 0.1 M de ácido acético-acetato de
sodio, 0.1 M de NaOH, 11 mM de Cloruro de calcio
como activador y 15 mM de Fosfato monopotásico
como inhibidor. Las siguientes fórmulas se utilizaron
para calcular las cantidades de los reactivos.
moles
mM = ml de solución
​Ec. 1 
[A−]
pH = pka + log [HA] ​Ec. 2  finalmente los ml de solución de NaOH 0.1 M. Cabe
[A​-​] + [HA] = 0.1 M ​Ec. 3  la enzima se añadió después del álcali.
La preparación de dichas soluciones se realizó
haciendo uso de los materiales: vasos de precipitado,
matraces aforados, tubo Falcon, microespátula y
charola; y de los equipos: balanza analítica, placa con
agitación magnética y, para el caso del amortiguador,
potenciómetro. La enzima se obtiene del
homogeneizado de hígado de pollo a una
concentración final de 1 mg/ml. Para ello, se colocaron
0.25 g de hígado de pollo, molido previamente en un
mortero, en 15 ml de agua destilada en un tubo Falcon
y se dejó en baño de hielo durante 10 minutos.
Posteriormente, se llevó la suspensión a 30 ml con el
amortiguador (pH 5) y se realizarón diluciones..
En la presente práctica se evaluaron los efectos del
tiempo en la formación de producto, de la
concentración de la enzima y de sustrato sobre la
actividad enzimática, por separado. El método general
consistió en colocar, por triplicado, en cada tubo
Eppendorf (1.5 ml) todos los componentes estipulados
para cada determinación a excepción de la enzima e
incubarlos en un Thermomixer a 37°C. Al añadir la
enzima, se mezcló rápidamente en el Vórtex y continuó
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la incubación durante 10 minutos. La reacción se
detiene por el agregado de 0.5 ml de la solución 0.1 M
de NaOH posterior a ese tiempo. Por último, se lee
para calcular con la absorbancia la actividad de la
enzima en μmoles de PO​4​ formado/minuto.
En el ensayo para la determinación del efecto del
tiempo en la formación de producto, se colocaron en
cuatro tubos Eppendorf 200 μl de sustrato, 100 μl de la
solución de CaCl​2​, 100 μl de amortiguador y 100 μl de
la enzima. Los tiempos de reacción se tuvieron a 5, 10,
15 y 20 minutos, durante los cuales se incubó a la
temperatura anteriormente mencionada y se agregaron
mencionar que para el tubo correspondiente al blanco,
Respecto al ensayo para la determinación del efecto de
la concentración de la enzima sobre la actividad
enzimática, se prepararon igualmente cuatro tubos: el
primero con 40 μl de enzima, el segundo con 60 μl, el
tercero con 80 μl y el cuarto con 100 μl. Se
consideraron las mismas condiciones anteriores de
volumen para el sustrato y el CaCl​2​, se ajustó el
volumen a 500 μl con el amortiguador, se incubó y
agregó la solución de NaOH de la misma forma.
Por otro lado, para la determinación del efecto de la
concentración del sustrato sobre la actividad
enzimática, se prepararon los tubos como se muestra
en la tabla 1. Igualmente, se les dio el mismo
tratamiento de incubación y adición de solución de
NaOH que los ensayos anteriores.
Tabla 1​. Ensayo para la determinación del efecto de la
concentración del sustrato sobre la actividad
enzimática.
Tubo  Sustrato  CaCl​2​ (μl)   Amortigu Enzima 
(μl)  ador (μl)  (μl)  
1 50 100 250 100
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2 100 100 200 100 producto (p-nitrofenol) se basa en la ley de

Lambert-Beer:
3 150 100 150 100
A = ε.C.l ​Ec. 4 
4 200 100 100 100 en este caso ​l ​es 1 cm y ε (coeficiente de extinción
milimolar) es 17.5 mM​.1 cm​-1​. Esta ecuación es
5 250 100 50 100
despejada para calcular la concentración del producto
Blanco 100 100 200 100 a una absorbancia de 405 nm.

Una vez obtenida la concentración se puede

Asimismo se efectuó un ensayo adicional en el que se
calcular la velocidad de reacción con la siguiente
varía la concentración de sustrato y se fija la
ecuación:
concentración de fosfato monopotásico como se Cnitrof enol
v= tiempo de reacción
​Ec. 5 
observa en la tabla 2; con el mismo tratamiento
posterior que los demás. ​Tabla 3.​ Efecto del tiempo de reacción en la formación
Tabla  2.  ​Efecto del inhibidor sobre la actividad de producto.
enzimática.
Tiempo    Promedio  [Product
de  Cambio de absorbancia  absorban o] (mM) 
Tubo  Sustrato  CaCl​2​ (μl)   Amortigu Enzima 
reacció (405 nm)  cia 
(μl)  ador (μl)  (μl)  
n (min) 
1 50 100 200 100
5 0.746 0.752 0.744 0.747 0.043
2 100 100 150 100
10 1.239 1.208 1.238 1.228 0.070
3 150 100 100 100
15 1.577 1.482 1.453 1.504 0.086
4 200 100 50 100
20 1.978 1.782 1.818 1.859 0.106
5 250 100 0 100

Blanco 100 100 150 100

Con la herramienta de software Minitab 19, se

calcularon los intervalos de confianza de los
resultados, así como las regresiones que permitieron
obtener la V​max​ y el K​m​.

Resultados y Discusión 

La velocidad de reacción se define como la
cantidad de sustrato consumido o de producto formado
por unidad de tiempo. En nuestro caso
representaremos la aparición de producto frente al
tiempo (Figura 1). El cálculo de la concentración de
Figura 1.​ Representación del efecto del tiempo de
reacción en la aparición de producto.
Tabla 4.​ Efecto de la concentración de enzima en la
formación de producto.
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Enzima    Prome [Prod Veloci 2 0.150 0.015 0.075 0.075

(uL)  Cambio de  dio  ucto]  dad 
absorbancia  absor (mM)  (mM/m 3 0.138 0.014 0.068 0.068
(405 nm)  bancia  in) 
4 0.137 0.014 0.068 0.068
40 0.165 0.650 0.773 0.529 0.030 0.003
5 0.141 0.014 0.070 0.070
60 0.610 0.626 0.640 0.625 0.035 0.003

80 0.413 0.657 0.680 0.583 0.033 0.003 Si se representa la velocidad de reacción

frente a la concentración de sustrato se obtiene una
100 0.557 0.458 0.503 0.506 0.028 0.002
hipérbola rectangular cuya expresión matemática se
conoce como Ecuación de Michaelis-Menten. En la
Tabla 5. ​Efecto de la concentración de sustrato sobre
representación de Lineweaver-Burk se presentan los
la actividad enzimática.
inversos de las velocidades enzimáticas obtenidas
Tub Sustr   Prom [Prod Veloci frente a los inversos de las respectivas
o  ato  Cambio de  edio  ucto]  dad 
(uL)  absorbancia  abso (mM)  de 
concentraciones de sustrato y se obtiene así km y Vm.
(405 nm)  rban catáli Esto se hizo en Excel 2010 aplicando regresión lineal y
  cia  sis  aritmética básica.
1 50 1.251 1.710 2.448 1.803 0.103 0.010
Tabla 7. ​Valores de 1/V frente a 1/[S]
2 100 1.318 3.186 3.370 2.625 0.150 0.015
Tubo  Sustrato  Promedio  1/[S]  1/V 
3 150 1.600 1.669 3.950 2.406 0.138 0.014 (uL)  absorbanci
a 
4 200 2.358 3.052 1.792 2.401 0.137 0.014
1 50 1.803 0.4 97.1
5 250 1.706 1.850 3.871 2.476 0.141 0.014
2 100 2.625 0.2 66.7

Para calcular los moles de NP se usa la 3 150 2.406 0.13 72.7

siguiente ecuación:
4 200 2.401 0.1 72.9

micromoles de N P = CN P * V ensayo ​Ec.6  5 250 2.476 0.08 70.7

A partir de los valores obtenidos se puede

calcular la actividad de la preparación enzimática:

Actividad enzimática = micromoles de N P

t*V enzima
​ Ec.7 

Tabla 6. ​Efecto de la concentración de sustrato sobre

la actividad enzimática.
Tubo  [Producto]  Velocidad  micromol Actividad 
(mM)  de catálisis  es de NP  enzimática 
(U/mL) 

1 0.103 0.010 0.051 0.051

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Figura  2. Representación de Lineweaver-Burk: Se obtuvieron valores de Vm de 0.003 mM/min

Inversos de las velocidades enzimáticas frente a los y de 1 km de 1.095 mM para la fosfatasa ácida del
inversos de las concentraciones de sustrato. hígado de pollo con 50 uL de inhibidor.

Se obtuvieron valores de 1/Vm de 61.418 por

lo tanto Vm es 0.016 mM/min y de 1/km de 0.769 por lo
tanto km es 1.301 mM para la fosfatasa ácida del
hígado de pollo.

En cuanto a la evaluación de la presencia del

inhibidor, se efectuó un experimento adicional.

Tabla 8. ​Representación de la 1/V frente a 1/[S] con 50

uL de inhibidor Figura 4. Comparación de 1/V frente a 1/[S] con y sin
Tubo  Sustrato  Promedio  1/[S]  1/V  inhibidor.
(uL)  absorbanci
a  Como se muestra en la Fig. 4 los valores de
1 50 0.407 0.4 430.398
Vm y km disminuyen en presencia del inhibidor lo que
nos indica que se trata de un inhibidor no competitivo.
2 100 0.427 0.2 410.156

3 150 0.500 0.13 349.767 Conclusiones  

4 200 0.570 0.1 307.197 Tras analizar los resultados obtenidos en la práctica se
concluyo que el efecto del tiempo en una reacción
5 250 0.508 0.08 344.488
enzimática es crítico ya que el mayor efecto de catálisis
puede ser observado en sus primeros minutos y esta
disminuye de manera drástica por lo que es importante
planear el momento de uso para maximizar
rendimientos, es necesario mencionar que la
concentración de enzima es una variable que tiene
poco efecto por sí sola en rendimiento y velocidad de
reacción ya que se mantiene la misma cantidad de
sustrato y por lo tanto solo una parte de las enzimas se
vuelven activas lo que crea un desperdicio de enzima
al no poder unirse al sustrato. Se concluyó que para
Figura  3. Representación de Lineweaver-Burk:
esta enzima una concentración 1:1 de enzima-sustrato
Inversos de las velocidades enzimáticas frente a los
es lo ideal para maximizar el rendimiento. Se concluye
inversos de las concentraciones de sustrato con
que en la presencia de este inhibidores se ve afectada
inhibidor.
notablemente la reacción catalizada ya que está es
medianamente competitiva y por ende la producción de
producto si se encuentra en cantidades mayores o
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semejantes al sustrato, esto disminuye a mayor

concentración de sustrato y se concluye que esto
sucede porque no representa una competencia, sin
embargo será preferible no contar con inhibidores en la
solución. Se concluye que una vez alcanzada una
velocidad máxima de reacción en los primeros minutos
es poco probable que esta se vea alterada de manera
significativa en las diferentes variables experimentales
realizadas ya que se ha alcanzado la mayor unión
entre el sustrato y la enzima disponible.

​Referencias  

Cinetica enzimática—EcuRed.​ (s. f.). Recuperado 21 de marzo de

2020, de https://www.ecured.cu/Cinetica_enzim%C3%A1tica

Fosfatasa | La guía de Biología​. (s. f.). Recuperado 21 de marzo

de 2020, de https://biologia.laguia2000.com/bioquimica/fosfata

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Recuperado 16 de marzo de 2020, de
https://www.wiener-lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademec
um%20espanol/fosfatasa_acida_total_y_prostatica_cinetica_sp.pd
f

Guija, E., Soberón, M., & Haak-Mares, H. (2007). Mecanismo de

acción de las fosfatasas ácidas de bajo peso molecular. ​Anales de
la Facultad de Medicina​, ​68​(4), 356-362.

Santana, A., Lemes, A., Bolaños, B., Parra, A., Martín, M., &
Molero, T. (2001). Citoquímica de la fosfatasa ácida:
Consideraciones metodológicas. ​Revista de Diagnóstico Biológico,​
50​(2), 89-92.