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Cinética enzimática: inversión de la sacarosa.
Enzyme kinetics sucrose inversion.
Daniel Andrés Galvis Ortiz, Oscar Iván Sepulveda L.
Escuela de química, Universidad Tecnológica de Pereira, Pereira, Colombia
Resumen— Este artículo contiene los resultados de la práctica
sobre la Determinacion de la cinética de la inversión de la
sacarosa, además de comprobar mediante gráficas las hipótesis
planteadas por algunos autores en cuanto al orden de reacción
de la catálisis enzimática, comparar la cinética entre una
reacción catalizada enzimáticamente y otra catalizada por
ácido y finalmente hallar la energía de activación para cada
tipo de catálisis.
Palabras clave— Enzima, catálisis enzimática, Cinética,
Hidrólisis, invertasa, sacarosa.
Abstract— his article contains the results of the practice on the
Determination of the kinetic one of the investment of the
saccharose, beside verifying by means of graphs the hypotheses
raised by some authors as for the order of reaction of the
enzymatical catalysis, compares the kinetic one between a
catalyzed reaction enzimáticamente and other one catalyzed by
acid and finally to find the energy of activation for every type
of catalysis.
Key Word — Enzyme, enzymatic catalysis, kinetics, hydrolysis,
invertase, sucrose.
I. INTRODUCCIÓN
La sacarosa es un disacárido de glucosa y fructosa. Se
sintetiza en plantas pero no en animales superiores. No
contiene ningún átomo de carbono anomérico libre, puesto
que los carbonos anoméricos de sus dos unidades
monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí
covalentemente mediante un enlace O-glucosídico. Por esta
razón, la sacarosa no es un azúcar reductor y tampoco posee
un extremo reductor.
El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de
enzimas puede ser utilizado en:
1. La determinación de los sustratos de la reacción
enzimática, siendo posible determinar específicamente cada
una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de
separar. Para la cuantificación de sustratos se pueden utilizar
dos métodos generales:
a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final.
En este tipo de métodos (los más utilizados en la práctica) se
permite que la reacción enzimática se complete o llegue al
equilibrio y se mide la variación producida en la
concentración de un producto de reacción o de un reactivo
presente inicialmente en exceso.
b. Métodos cinéticos, en los que se utilizan medidas de la
velocidad inicial de la reacción enzimática para deducir la
concentración inicial de sustrato. Los procedimientos de
medida son idénticos a los utilizados para reacciones
catalíticas en general.
Hoy en día no se dispone de una teoría que explique la
actividad y especificidad de la catálisis enzimática. No
obstante, existen numerosas ideas soportadas por los hechos
experimentales que indican la existencia del complejo
enzima-sustrato formado por unión del sustrato al centro
activo de la enzima. Mientras está enlazado a la enzima, el
sustrato se transforma en producto, momento en el cual se
libera de la enzima. Existen cuatro características
diferenciadoras de las reacciones enzimáticas con respecto a
las reacciones químicas catalizadas:
1. La enzima es altamente específica y cataliza solo una o
pocas reacciones químicas. Los catalizadores sólidos no
suelen ser específicos y pueden intervenir en reacciones
diferentes que tengan el mismo grupo funcional. Dada la
gran variedad de enzimas descubiertas actualmente (unas
3300), se pueden llevar a cabo un gran número de
reacciones químicas empleando enzimas específicas como
catalizadores.
2. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima
es mucho mayor que la velocidad de una reacción catalizada
por productos no biológicos. Solo es necesaria la presencia
de una pequeña cantidad de enzima para acelerar la
reacción.
3. Las condiciones de reacción (temperatura, presión, pH,
etc.) de las reacciones enzimáticas son suaves. A bajas
temperaturas la actividad de las enzimas es más elevada que
la de los catalizadores sólidos. A temperaturas altas los
catalizadores ordinarios suelen aumentar su actividad,
mientras que las enzimas disminuyen pudiendo perderla
totalmente a partir de cierta temperatura.
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4. Las enzimas son moléculas sensibles e inestables que
requieren cuidado en su uso. Las enzimas pierden
fácilmente su actividad catalítica al cambiar su
conformación estructural (desnaturalización) en el
transcurso de algunas reacciones.
La importancia del estudio de la cinética enzimática no
solamente radica en el hecho de que las enzimas actúan en
el proceso metabólico de los microorganismos sino que
gracias a su posible inmovilización, pueden emplearse cada
vez más en reacciones específicas de aplicación industrial.
En bioquímica, el diagrama de Lineweaver-Burk se emplea
como herramienta gráfica para calcular los
parámetros cinéticos de una enzima.
Su utilidad consiste en que el recíproco de la cinética de
Michaelis-Menten es fácilmente representable y que de él
emanan mucha información de interés.
FIG. 1. DIAGRAMA DE LINEWEAVER-BURK
Cuyo recíproco es:
II. METODOLOGIA
PROCEDIMIENTO
Para la reacción de la inversión de la sacarosa se usó la
Enzima invertaza, como lo muestra la reacción.
Se aplicó el método cinemática de Michaelis-Mentel
asumiendo la formación de un complejo intermedio
conformado por sacarosa-invertaza. Luego, este complejo
reacciona con agua para obtener el producto deseado P1
(fructosa y glucosa) y P2 (la invertaza libre) como se
muestra en la anterior reacción.
La velocidad de desaparición es:
Como la concentración del agua no cambia
significativamente en la reacción, ya que la mezcla de
reacción está muy diluida, entonces podemos asumir que:
Para seguir el avance de la reacción se usó el anión del
ácido 3,5- dinitrosalicílico que posee la capacidad de
reducir varios azucares. Así, que al medir la capacidad
reducción en la reacción de la mezcla (fructosa y glucosa)
se estará midiendo el alcance de la conversión de la
sacarosa a glucosa y a fructosa en la mezcla de reacción.
En el procedimiento usado, se preparó en primer lugar una
mezcla con una cantidad apropiada de sacarosa, enzima y
solución buffer. Esta mezcla se hidroliza en diferentes
tiempos especificados y luego la reacción es inhibida por la
adición de NaOH (contenido en el reactivo adicionado 3,5-
dinitrosilicato); A partir de la forma oxidada y reducida del
anión del 3,5- dinitrosalicílico que posee una diferencia
significativa en el espectro visible y, midiendo las
absorbancia a una longitud de onda 540nm se puede medir
dicho alcance.
Posteriormente las soluciones fueron calentadas en un baño
maría realizado en una estufa para revelar el color producido
por el reactivo en presencia de la actividad reductora en la
solución y la intensidad de color es evaluado en el
espectrofotómetro. Las lecturas en el espectrofotómetro nos
permiten saber directamente los moles presentes de glucosa
y fructosa en la solución. Entonces, conociendo el tiempo
de duración para que ocurra la reacción, podremos
establecer la velocidad media en la cual la sacarosa fue
convertida en glucosa y fructosa.
 Corrida del blanco
Se prepararon las mezclas como indica la tabla 1, para la
determinación de la absorbancia del reactivo de
dinitrosalicilato en ausencia de azúcares reductores. Luego
de adicionar la sacarosa, la mezcla se dejó reaccionar 5
minutos, se adicionó el reactivo y se colocó en un baño
María por cinco minutos, se enfrió, se agregaron 15 mL de
agua destilada y se midió la absorbancia a 540 nm.
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(Procedimiento llevado a cabo para todos los ensayos). Para

el ensayo A0 como para los demás ensayos marcados con *
se adicionó primero el reactivo de dinitrosalicilato y luego
la sacarosa.

Tabla 4. Soluciones realizadas para los ensayos del ítem

Tabla 1. Corrida del blanco E
 Hidrolisis no enzimática de la sacarosa.
 Ensayo de estandarización
Un bloque de concentraciones sugeridas con las cuales este
Se prepararon las soluciones enlistadas de la tabla 2. Con el experimento puede llevarse a cabo está dado en la tabla 5. El
fin de realizar una curva de calibración que permita conocer ensayo F0 es un blanco, el cual permitirá ver cuanta
la concentración de glucosa y fructosa a un dato de hidrólisis se da en ausencia de cualquier catálisis.
absorbancia obtenido.
Ensayo Sacarosa 0.3M, mL Agua, mL HCl 1M, mL
F0 2.0 2.0 0.0
F1 1.0 2.0 1.0
F2 1.0 1.0 2.0
F3 2.0 1.0 1.0
F4 2.0 0.0 2.0
Tabla 5. Ensayos hidrolisis no enzimática

Tabla 2. Ensayo de estandarización  Dependencia de la Velocidad con la

Temperatura.
 Progreso de la reacción con el tiempo
Elegir desde los ensayos E un paquete de concentraciones
Para el segundo de los siguientes dos bloques de ensayos,
iníciales que den una absorbancia cerca de 0.5 a temperatura
prepare algo de solución de sacarosa 0.03 M por dilución de
ambiente después del procedimiento estándar. Las
1 mL de la solución stock 0.3 M con 9 mL de agua
temperaturas convenientes para estos ensayos, nombrados
destilada. Corra la serie C usando la solución de sacarosa
como ensayos G son 0ºC (baño de hielo), 12, 25, 35 y 45 ºC.
concentrada y en la serie D use la solución diluida.
RESULTADOS

 Verificación de la Actividad Enzimática

La mezcla realizada en la actividad enzimática fue:

1ml Enzima + 0,5 ml H2O + 0,5 ml de s/n Buffer + 1 ml
Sacarosa. (Para la primera muestra), posterior a esto se
procedió con las indicaciones que aparecen en la tabla 1
hasta obtener todas las soluciones.
Se determinó la absorbancia de la solución a 540 nm de A0,
A1, A2 y A3, siguiendo con las condiciones de las guías de
trabajo ninguno de los blancos corridos deberá revelar una
mayor absorbancia que 0,05 a 540 nm, con las absorbancias
Tabla 3. Ensayos de progreso de la reacción en el tiempo. obtenidas se verifico que la solución estaba en buen estado
para ser trabajada.
 Dependencia de la velocidad inicial con la
concentración de sustrato Ensayo Absorbancia
A0 0,014
Se preparó una solución 0,03 M en sacarosa a partir de la A1 0,019
solución stock. Se prepararon las mezclas resumidas en la A2 0,024
tabla 3. El ensayo E0 era un blanco a tiempo cero por lo
A3 0,017
que el reactivo de dinitrosalicilato se adicionó antes de la
sacarosa. Tabla 6. Corridas del blanco.
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 Ensayo de estandarización d3 0,013 120

d5 0,036 180
Ensayo Absorbancia (540nm)
B1 0,108 d10 0,057 240
d20 0,107 300
B2 0,204
B3 0,318 TABLA 8. RESULTADOS ENSAYOS C y D
B4 0,330 Con estos datos realizamos la siguiente gráfica:
B5 0,452
Tabla 6. Ensayo de estandarización
A partir de los datos tabulados en la tabla anterior se C
determinó los moles de fructosa y glucosa producidas. D
Posteriormente se realizó una curva de calibración para
hallar el valor de α (coeficiente de calibración).

Absorbancia (N1+N2)/2
0,108 1,998*10-6
0,204 3,497*10-6
0,318 4,995*10-6
0,330 5,995*10-6
0,452 7,493*10-6
Tabla 7 Concentración y absorbancia de las muestras.
Fig. 3 tiempo vs absorbancia ensayos C y D
Simplificamos la expresión (n1 + n2)/2, como n para Cuya ecuación es:
efectos prácticos. Para C
y = -0,0001x + 0,053
R² = 0,9757
Para esto tenesmo que k0=0,0001

Para D
y = 0,0004x - 0,03
R² = 0,916
k0=0,0004

Por lo tanto las concentraciones serán:

Usando (x/0.003) = k0t
Fig. 2. Curva de calibración de la absorbancia vs. n
CONCENTRACIÓ CONCENTRACIÓN TIEMPO
La ecuacion de la recta es: NC D (s)
Abs = 0,0608ne-6 - 0,0094 1,8e-5 mol* l-1 7,2e-5 mol* l-1 60
R² = 0,982 3,6e-5 mol* l-1 1,44e-4 mol* l-1 120
5,4e-5 mol* l-1 2,16e-4 mol* l-1 180
-1
Con la pendiente de la anterior gráfica, obtenemos que la 7,2e-5 mol* l 2,88e-4 mol* l-1 240
constante de calibración es: 60840,18 mol-1. 9e-5 mol* l-1 3,6e-4 mol* l-1 300
Tabla 9. Concentraciones ensayos C y D en el tiempo
 Progreso de la reacción con el tiempo
Con estos datos podemos observar que la concentración
ENSAYO ABSORBANCIA tiempo aumenta con el tiempo.
c1 0,046 60
c3 0,034 120  Dependencia de la velocidad inicial con la
c5 0,026 180 concentración de sustrato.
c10 0,02 240
c20 0,044 300 Ensayo Absorbancia Concentración Velocidad r0
ENSAYO ABSORVANCIA TIEMPO S0 (mol /L) (mol/L*s)

d1 0,006 60 Sacarosa 0.3 M

E0 0,046 2,5203*10-4 8,4009*10-7
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E1 1,695 9,287*10-3 3,0955*10-5 R² = 1

E2 2,658 0,0146 4,8542*10-5 Del intercepto de la gráfica se obtiene el valor de k2
Sacarosa 0.03 M Dónde:
E3 1,228 6,728*10-3 2,2427*10-5 1
E4 0,787 4,312*10-3 1,4373*10-5 =30,91 s∗L/mol
k 2 (E)
E5 0,384 2,116*10-3 7,0129*10-6 0

E6 0,337 1,846*10-3 6,1546*10-6 (E)0 es la concentración inicial de la enzima siendo el valor

Tabla 10. Concentración de sustrato y velocidades nominal del peso molecular de la enzima 100000 g/mol.
halladas en el ensayo E. (E)0= 7*10-4 mol/L
K2= 46,2171 s-1.
[s0] = A/αV (3.4.1)
A partir del valor de K2 y de la pendiente de la gráfica ,
[s0] = (0,046)/ (60840, 18 mol-1) *(0,003L) podemos encontrar el valor de Km:
[s0] = 2, 5*10-4 mol /L
Km
ro = δ[ ]/δt = 299, 96 s
k 2 ( E)0
ro = (2,52*10-4 mol/L)/300 s
K
ro= 8,4*10-7 mol/L*s m= 9, 7043 mol/L (3.4.5)

Ecuación de la recta de lineweaver-burk

Ensayo r0/s0(s-1) r0(mol/l*s)
Km Sacarosa 0.3 M
∗1 E0 3,3333*10-3 8,4009*10-7
1 1 k 2 ( E)0
= + E1 3,3332*10-3 3,0955*10-5
r 0 k 2(E ) 0
(S)0 E3 3,3248*10-3 4,8542*10-5
Sacarosa 0.03 M
1/[S0](L/mol) 1/r0 (L*s/mol) E4 3,3334*10-3 2,2427*10-5
Sacarosa 0.3 M E5 3,3333*10-3 1,4373*10-5
3968,2539 1190348,653 E6 3,3142*10-3 7,0129*10-6
E3 3,3340*10-3 6,1546*10-6
107,6773 32304,9588 Tabla 12. Datos para la gráfica de Eadie-Hofstee
68,4932 20600,7169
  Para la construcción de la gráfica 5 se usó los datos de la
Sacarosa 0.03 M tabla 12, con eliminación previa de los datos de los ensayos
148,6326 44589,1113 E0, E4 y E5. La razón por la cual se eliminó los datos es
para obtener una mejor correlación de los datos (línea recta).
231,9109 69574,8974
472,5898 142594,3618
541,7118 162480,0962
Tabla 11. Datos para graficar la lineweaver-Burk

Grafica 4. Representación gráfica de lineweaver-Burk Grafica 5. Representación gráfica de Eadie-Hofstee

para la conversión de la sacarosa 0.3M. para la conversión de la sacarosa 0.3M.
Ecuación de la recta:
1 299,96∗1 Ecuación de la recta:
=30,91+
r0 ( S)0 r0 /s0= - 1706,2 r0 + 0,0861
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R2=1

Con el valor de la pendiente se obtiene Km, sabiendo que

esta es igual a -1/Km:

−1
=−1706,2 L /mol
Km
Km = 5,8610*10-4 mol/L

Ahora, conocida Km se puede hallar K2:

Grafica 7 Representación gráfica de Eadie-Hofstee para la
conversión de la sacarosa 0.03M.
K 2∗E 0
= 0,0861 / s
Km
Ecuación de la recta:
K2 = 0,0721 /s
r0 /s0= - 23,069 r0 + 0,0035
R2=0,7495

Con el valor de la pendiente se obtiene Km, sabiendo que

esta es igual a -1/Km:

−1
=−23,069 L/mol
Km
Km = 0,0433 mol/L

Ahora, conocida Km se puede hallar K2:

K 2∗E 0
Grafica 6. Representación gráfica de lineweaver-Burk para la = 0,0035 / s
Km
conversión de la sacarosa 0.03M.

Ecuacion de la recta K2 = 0,2167 / s

1 299,97∗1 III. CONCLUSIONES

=5,3748+
r0 (S )0
 Se determinó la cinética de la inversión de la
R² = 1 sacarosa, además se comprobó por medio de
graficas las hipótesis planteadas por lineweaver-
1
=5,3748 s∗L /mol Burk en cuanto al orden, el cual para esta práctica
k 2 (E) 0
es de primer orden en la reacción de la catálisis
enzimática; además tiene la ventaja de que permite
1 una determinación más exacta del valor de la
= (5,3748 s∗L/mol )*(7*10-4 mol/L)
k2 velocidad máxima.
K2 = 3, 7624*10-3 / s  En términos más específicos, la energía de
K2 = 3, 7624*10 / s-3 activación para una reacción que está siendo
catalizada por una enzima es mucho menor que la
K2= 46,2171 /s energía de activación para la misma reacción
Km cataliza por un ácido, de allí su importancia a nivel
=299,97s bioquímico, puesto que reacciones que a nivel de
k 2 ( E)0 laboratorio tardan varios días u horas, en la célula
ocurren en fracciones de segundo.
Km = 7, 9002*10-4 mol /L

 La invertaza es una enzima es una enzima que

convierte la sacarosa en glucosa y fructosa, como
se presentó en las reacciones realizadas en la sesión
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de laboratorio se determinó la cinética de la

reacción y la capacidad de la enzima como
catalizador de esta reacción biológica.

 La representación de lineweaver-Burk tiene la

ventaja de que permite una determinación más
exacta del valor de la velocidad máxima, ya que en
la representación sencilla r0 frente a s0 solo se
obtiene su valor aproximado, puesto que es un
valor limite a una concentración de sustrato
infinita

 La representación gráfica de Eadie-Hofstee, no

solamente da los valores de velocidad máxima y de
Km en forma sencilla, sino que también amplia las
desviaciones de carácter lineal que pueden no
parecer en la representación de lineweaver-Burk.

IV. BIBLIOGRAFIA

[1] Fisicoquímica aplicada, fundamentación experimental;

Jorge Eliecer Alba,Melvin Aroldo Dura,Hoover Alberto
valencia

[2] P.W atkins; sexta edición; universidad de Oxford.

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