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Instituto Politcnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa

Unidad de Aprendizaje:
LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES
GRUPO:
5BV2
Equipo 3
Amaro Valencia Santos Martin
Cadena Taffoya Deyerid
Chvez Guerrero Yedhani Alejandra
Muoz Barruqun scar Ariel
Sosa Ortega Luis Enrique

PRCTICA 2. Determinacin de actividad enzimtica


y efecto de la concentracin de enzima.
Profesores:
Hernn Corts Arroyo
Dr. Enrique Durn Pramo
Jocelyn Berenice Snchez Arellano

Fecha de entrega:
14 de Marzo del 2017
INTRODUCCIN

Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energa muy rpidamente debido a la presencia
de catalizadores biolgicos llamados enzimas. Las enzimas modifican la velocidad de una
reaccin qumica sin afectar el equilibrio final; y solo se requieren pequeas cantidades para
efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas de sustrato. Sin embargo, a
diferencia de la mayora de los catalizadores inorgnicos, las enzimas son bastante especficas,
ya que catalizan un numero comparativamente pequeo de reacciones y en algunos casos tan
solo una reaccin.

La clasificacin de las enzimas se designa y se clasifica de acuerdo con el tipo de reaccin que
catalizan. Los seis grupos principales de enzimas son:

1. Oxidoreductasas
2. Transferansas
3. Hidrolasas
4. Liasas
5. Isomerasas
6. Ligasas(sintentasas)

La velocidad de una reaccin enzimtica se puede expresar como funcin de la concentracin


de sustrato transformado o producto obtenido con respecto al tiempo. La ilustracin 1 se muestra
una curva tpica de la transformacin del sustrato con respecto al tiempo, se observa que al
comienzo es lineal pero pronto comienza a disminuir. Inicialmente no hay productos presentes
en la mezcla de incubacin, pero a medida que progresa la reaccin, la reaccin inversa se hace
ms y ms importante hasta alcanzar el equilibrio. La concentracin de sustrato tambin
disminuye con el tiempo de manera que la actividad se hace menor por que la enzima estar
menos saturada de sustrato. Finalmente la enzima puede ser inhibida por los productos formados
o puede inactivarse lentamente bajo las condiciones experimentales. Todos estos efectos juntos
hacen que sea casi imposible derivar una ecuacin estndar que se ajuste a la curva estndar.
Por tanto la actividad enzimtica que se define como la capacidad cataltica de una preparacin
de enzimas. La comisin de enzimas (EC) de la IUPAQ, se define la Unidad Internacional de
Actividad enzimtica (UI) como la cantidad de enzima necesaria para transformar 1 micromol de
sustrato en un minuto se determina considerado nicamente la velocidad inicial de reaccin
(v=a/b) ya que en tales condiciones los efectos son ms pequeos.
Ilustracin 1. Curva tpica de formacin de un producto (P) en funcin del tiempo para una reaccin catalizada
enzimticamente.

Otra medida importante, es la actividad especfica de una preparacin, que es el resultado de


dividir las unidades de actividad enzimtica del sistema entre la cantidad de protena (en mg) en
el sistema.

En esta prctica determinaremos la actividad enzimtica y especifica de la enzima -amilasa


mediante el mtodo de DNS y mtodo de Bradford.

La -amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la


degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn est formado por
dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa
se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces - C1-C4, mientras que la
amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas
ramificadas. La -amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina,
dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacridos) como productos.

Mtodo de DNS

El mtodo DNS (tcnica de miller) es una tcnica colorimtrica que emplea cido 3,5
dinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra. Determina las
absorbancias por medio de un espectrofotmetro a 540nm. Esta tcnica sirve para cuantificar los
azucares reductores producidos durante una fermentacin o para cuantificar los productos de
una reaccin enzimtica.

La curva de calibracin en este caso sera la de maltosa es la representacin grfica en un eje


de coordenadas, de la Absorbancia (eje de ordenadas: Y) frente a la Concentracin (eje de
abscisas: X). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus
absorbancias, construyndose la curva de calibrado, que es una recta. La concentracin de una
solucin problema (desconocida), se averigua por interpolacin de la Abs de la solucin en la
curva de calibracin, o a travs de la ecuacin de la recta (y = mx + b) donde: Absorbancia (y) =
constante (m) x concentracin + absorbancia del blanco.
El DNS reacciona nicamente con los azcares reductores. La sacarosa es un disacrido no
reductor, pero tras su hidrlisis en medio cido se liberan glucosa, fructosa y maltosa que s son
reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado.

Ilustracin 2. Reaccin de oxidacin de azucares reductores por el mtodo de DNS

Mtodo Bradford

Se basa en utilizar un colorante hidrofbico (comassie blue G-250) cuyas disoluciones acuosas
en presencia de cido fosfrico tienen un color pardo que adentrar en contacto con la parte
hidrofbico del interior de una protena se fija. Las protenas se unen a la forma azul para formar
un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. La
determinacin del contenido proteico de una muestra requiere la comparacin del valor de
absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de protenas, con
los que se construye una curva de calibracin: a mayor cantidad de protenas, mayor color
desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia. Es un mtodo que depende de la interaccin
relativamente inespecfica entre un colorante hidrofbico y las protenas, por lo que es sensible
a la presencia de contaminantes tales como los restos de detergentes y lquidos orgnicos, ya
que las protenas pueden perder su estabilidad y perder su forma nativa, lo que provocara la
perdida de la unin entre el cromforo y la zona hidrofbica de las protenas.

OBJETIVO GENERAL

Determinar la actividad enzimtica de la -amilasa variando la concentracin de enzima.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar la actividad enzimtica de la -amilasa cuantificando la formacin de producto


mediante el mtodo de azcares reductores.
Conocer la forma de calcular las unidades de actividad enzimtica mediante la
determinacin de la actividad enzimtica de la -amilasa.
Determinar el efecto de la concentracin de enzima en la actividad enzimtica de la -
amilasa usando dos concentraciones diferentes de la solucin enzimtica.
DESARROLLO EXPERIMENTAL

Materiales y Reactivos:

Reactivos:

Regulador de fosfatos pH 6.0, 0.016 M.


Almidn 1.0 % (p/v) en regulador de fosfatos.
Reactivo de DNS.
Sol. de -amilasa a 5 mg/mL en regulador de fosfatos, pH 6.0, 0.016 M.
Sol. de -amilasa a 2.5 mg/mL en regulador de fosfatos, pH 6.0, 0.016 M.
Reactivo de Bradford.
Agua destilada.

Materiales:

Juego de Micropipetas.
Puntas de 200 y 1000 L para micropipetas.
Vaso de precipitados de 20 mL.
Agitador magntico.
Microtubos de 1.5 mL.
Bao mara.
Espectrofotmetro.
Celdas para espectrofotmetro.

Medicin de la actividad cataltica de enzimas (-amilasa) y efecto de la concentracin de enzima.


Preparacin de blanco Preparacin de testigo
Preparar testigo con otro microtubo
Preparar blanco en un microtubo de de 1.5 mL,, con 0.1 mL del reactivo de
1.5 mL con 0.1 mL del reactivo DNS DNS

Adicionar 0.1 mL del regulador de Adicionar 0.1 mL de la solucin de


fosfatos en que se prepar la enzima. almidn al 1% (p/v)

Tratar el microtubo con la tcnica de Tratar el microtubo con la tcnica de


determinacin de azcares determinacin de azcares
reductores reductores
Reaccin enzimtica

En un vaso de precipitados de Introducir un agitador


Preparar 6 microtubos de 1.5
20 mL adicionar 9.5 mL de la magntico en el vaso y
mL adicionando a cada uno
solucin de almidn al 1% encender la agitacin de la
0.1 mL (100 mL) del reactivo
(p/v) y colocarlo en una parrilla. La velocidad de
DNS.
parrilla de agitacin. agitacin debe de ser baja.

Tomar una muestra de 0.1 mL Adicionar 0.5 mL de la


Transferir muestra a uno de
de la mezcla de reaccion solucin de -amilasa a 5
los microtubos que contiene
inmediatamente despues de mg/mL al vaso de
0.1mL del reactivo DNS.
adicionar la solucion de - precipitados que contiene los
Tomar como tiempo 0
amilasa 9.5 mL de almidn 1% (p.V)

Seguir tomando muestras de Terminada la cintica


0.1 mL de la mezcla de enzimtica tratar los Utilizando la ecuacin de la
reaccin a los tiempos de 1, 2, microtubos de las muestras curva patrn de maltosa,
3, 5 y 10 minutos junto con el blanco y el interpolar las absorbancias
transferiendo cada muestra a testigo con la tcnica de para calcular las
un microtubo que contiene determinacin de azcares concentraciones de maltosa.
0.1 mL del reactivo de DNS reductores

Registrar resultados
RESULTADOS

Tabla 1.Datos para la curva tipo de Maltosa

[Maltosa] Absorbancia Absorbancia


mg/mL serie 1 serie 2
(=540 nm) (=540 nm)
0.0 0.000 0.000
0.3 0.054 0.061
0.6 0.162 0.132
0.9 0.267 0.285
1.2 0.425 0.402
1.5 0.516 0.482
1.8 0.529 0.567
2.1 0.555 0.575
2.4 0.611 0.625
2.7 0.722 0.712

0.800

0.700
y = 0.2701x + 0.0195
R = 0.9626
Absorbancia (=540 nm)

0.600

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.000
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
[Maltosa] (mg/ml)
Grfico 1. Curva tipo de Maltosa
Tabla 2. Resultados de la cintica de hidrlisis de almidn

Tiempo -amilasa serie 1 (5 mg/mL) -amilasa serie 2 (5 mg/mL)


(min) Absorbancia [Maltosa] Absorbancia [Maltosa]
(=540 nm) (mg/mL) (=540 nm) (mg/mL)
0 0.405 0.144 0.553 0.692
1 1.163 2.951 1.196 3.073
2 1.245 3.254 1.272 3.354
3 1.481 4.128 1.481 4.128
5 1.736 5.072 1.726 5.035
10 2.141 6.571 2.141 7.827
Testigo 0.366 1.283 0.366 1.283

8 y = 0.5953x + 1.7064
R = 0.8604
7
[Maltosa] (mg/ml)

0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (min)
Grfica 2. Cintica de hidrlisis de amidn por -amilasa
5
4.5 y = 1.1422x + 1.0022
R = 0.8375
4
3.5
[Maltosa] (mg/ml)

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (min)
Grfica 3. Cintica de hidrlisis de amidn por -amilasa, tiempos 0-2

Tabla 3. Resultados de concentracin de protena.

Absorbancia (595nm) [Protena] (mg/mL)


0.910 72.547
0.615 47.756

Tabla 4. Resultados de Actividad Enzimtica y Actividad especfica de la -amilasa


Actividad enzimtica Actividad especfica
(U/mL) ((U/mL)/mg protena/mL))
333.784 5.547

ANALISIS DE RESULTADOS
Al realizar las grficas de las tablas mostradas en el apartado de resultados,
se muestran todos los datos por lo que el valor de R entra dentro de los
parmetros aceptables.

CONCLUSIONES

Al realizar el mtodo de Bradford y ver la absorbancia se observ que la


concentracin de la protena es alta, ya que la concentracin de la enzima

que se us en la prctica fue alta (5 ).

El tiempo que se tom en cuenta para graficar fue hasta 3 minutos siendo
que en la prctica se realiz hasta de 10 minutos (en la grfica 3) ya que la
concentracin de nuestra enzima fue alta.

MEMORIA DE CLCULO

Dado que para medir la absorbancia tomamos 0.1mL del reactor que contena 10mL el factor de
dilucin lo obtenemos por:
[ Maltosa ] 1 . 1422 (min) 1 . 0022

d [ Maltosa ] mg
1 . 1422 maltosa
d (min) mL * s
mg 1 1000 mol
A . Enzimtica 1 . 1422 maltosa
* * * FD
mL * s PM maltosa
mmol

mg mmol maltosa 1000 mol maltosa


A . Enzimtica 1 . 1422 maltosa
* * * 100
mL * min 342 . 3 mg maltosa mmol maltosa
U
A . Enzimtica 333 . 784
mL
U mL
A . Especfica 333 . 784 *
mL 60 . 151 mg protena

U
A . Especfica 5 . 547 mL
mg protena

mL
REFERENCIAS

Agustn Garrido, Actividad enzimtica de la amilasa, consultado el 12/03/17


disponible en: http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimatica-
amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf
Rodrguez Salinas, Cuantificacin de protenas, consultado el 12/03/17
disponible en: https://es.scribd.com/doc/131445158/Reactivo-de-Bradford
Bello Gil, Daniel; Carrera Bocourt, Emilia; Daz Maqueira, Yuset (2006),
Determinacin de azcares reductores totales en jugos mezclados de caa de
azcar utilizando el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico, consultado de 12/03/17
disponible en: http://www.redalyc.org/pdf/2231/223120664006.pdf
Sin Autor, Enzimas , consultado el 13/03/17 disponible en :
http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp09.pdf