DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS EN

PROCESOS DE BIOCATÁLISIS ENZIMÁTICA

DETERMINATION OF KINETIC PARAMETERS IN ENZYMATIC

BIOCATALYSIS PROCESSES

Milagros Arrieta a, Kevin Castillo b, Juan Ledezma c, Natalia Ruiz d, Rafael Viloria e

a
Facultad de Ingeniería, Universidad de Sucre, Sincelejo, Colombia. miat0315@gmail.com

b
Facultad de Ingeniería, Universidad de Sucre, Sincelejo, Colombia. kstevencastillog@gmail.com

c
Facultad de Ingeniería, Universidad de Sucre, Sincelejo, Colombia. juanledesma556@gmail.com

d
Facultad de Ingeniería, Universidad de Sucre, Sincelejo, Colombia. nataliapacheco527@gmail.com

e
Facultad de Ingeniería, Universidad de Sucre, Sincelejo, Colombia. avvio3207@gmail.com

RESUMEN

Las enzimas son un tipo de biocatalizador, es decir, proteínas que aceleran determinadas reacciones químicas. La primera prá ctica de
laboratorio se basó en la determinació n de los pará metros cinéticos de Michaelis-Menten. Estos estudios proporcionan informació n
directa sobre los mecanismos de reacció n catalítica y la especificidad de la enzima para evaluar estos pará metros. Para realizar la
prá ctica descrita se prepara una solució n tampó n de citrato de sodio. (50ml) y se utilizaron diferentes concentraciones de sustrato
(almidó n de yuca de 0.5 a 2.0%) para analizar su efecto sobre la cinética de la α-Amilasa, todo esto se hizo bajo condiciones
controladas de pH, temperatura y velocidad de agitació n (pH= 5.0, 60°c) respectivamente. Para determinar el contenido de azú car
reductor en cada muestra después de 15 minutos mediante el método DNS, se analizaron en un espectrofotó metro los valores de
absorbancia obtenidos en cada una de las 3 repeticiones, luego se determinaron los pará metros cinéticos mediante el método de doble
linealizació n. Recíprocos, Eadie Hofstee y Hanes Woolf para obtener valores de Vmax y Km.

palabras claves: Linealización, Ph, Temperatura, Doble Recíproco, α-Amilasa.

1. INTRODUCCIÓN

Este trabajo contiene elementos importantes del proceso realizado en los respectivos laboratorios del grupo.

Es oportuno citar a (E. Coto, 2015) quien dice: “Sin la presencia de enzimas, las reacciones químicas que ocurren en los
organismos vivos no pueden tener lugar”, entendiendo que las proteínas generalmente catalizan reacciones bioquímicas,
lo que convierte a las enzimas en catalizadores extremadamente eficientes. , destacando que, al igual que los
catalizadores metá licos, requieren só lo pequeñ as cantidades para un uso ilimitado, lo que no altera el equilibrio ni
cambia su direcció n, sino que, por el contrario, acelera su realizació n. Es importante resaltar el papel fundamental de las
enzimas como proteínas al proporcionar aminoá cidos que contribuyen a la formació n del sitio de reconocimiento y
reacció n del sustrato como tal.
El almidó n es un polisacá rido de reserva alimenticia predominante en las plantas y proporciona entre el 70% y el 80%
de las calorías consumidas por los seres humanos en todo el mundo. Tanto el almidó n como los productos de la hidró lisis
del almidó n constituyen la mayoría de los carbohidratos digeribles en la dieta habitual. El almidó n de yuca nativa es una
excelente fuente de á cido fó lico (derivado del á cido fó lico), componentes necesarios para el proceso de divisió n celular,
ademá s de hierro y manganeso, de los cuales aporta el 8% y el 13% de la ingesta diaria recomendada, respectivamente.
(Rivier. M, 2001)

La hidró lisis del almidó n se puede realizar de dos formas: mediante el método á cido o mediante el método enzimá tico.
En los ú ltimos 30 añ os, la hidró lisis enzimá tica ha reemplazado a la hidró lisis á cida debido a la disponibilidad de nuevas
enzimas. Hoy en día, la hidró lisis del almidó n se lleva a cabo en gran medida mediante enzimas, ya que esta tecnología
ofrece las ventajas de una formació n controlada de productos indeseables y una mayor flexibilidad del producto.

Las α-Amilasas catalizan aleatoriamente la hidró lisis de los enlaces α-1,4-glucosídicos de polisacá ridos como el almidó n
y el glucó geno, formando maltosa, oligosacá ridos de diferentes tamañ os y cadenas má s o menos ramificadas, las
llamadas dextrinas límite 1. Son de gran importancia. en alimentació n y textiles. , papelera y farmacéutica, y aunque las
fuentes de producció n de α-amilasa son plantas, animales y microorganismos, las enzimas microbianas son las
aplicaciones má s demandadas industrialmente. Tradicionalmente, la producció n de α-amilasas se ha llevado a cabo
mediante procesos de fermentació n líquida sumergida (FLS) debido a un mejor control de factores ambientales como la
temperatura y el pH. Sin embargo, la fermentació n en fase só lida (FFS) representa una alternativa interesante porque los
metabolitos se concentran y los procesos de purificació n son má s rentables.

Cada aplicació n industrial de las α-amilasas requiere propiedades ú nicas en términos de especificidad, estabilidad,
temperatura y dependencia del pH , y todavía existe interés de investigació n en encontrar enzimas con propiedades
diferentes a las conocidas.

Cinética enzimá tica Su finalidad es estudiar la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores
que las afectan y los mecanismos de su aparició n. (Gonzá lez y Andrés, 2013). Para muchas enzimas, la velocidad de
catá lisis o reacció n (V) varía segú n la concentració n. Sin embargo, cuando [S] es baja, la tasa es linealmente proporcional
a la concentració n. Pero cuando [S] es alta, V es independiente de [S]. (Rebolledo, 2006).

A finales del siglo XIX se iniciaron estudios sistemá ticos de la influencia de la concentració n inicial del sustrato sobre la
actividad enzimá tica. El concepto de complejo enzima-sustrato como intermediario en el proceso de catá lisis enzimá tica
se introdujo ya en 1882. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuació n
de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas.

Para explicar la relació n observada entre la velocidad inicial (Vo) y la concentració n inicial de sustrato [So], Michaelis y
Menten propusieron que la reacció n catalizada enzimá ticamente ocurre en dos etapas: en la primera etapa, se forma el
complejo enzima-sustrato y en la segunda etapa. , se forma el complejo enzima-sustrato, el sustrato da como resultado la
formació n del producto, liberá ndose la enzima libre:
 2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 MATERIALES Y REACTIVOS

2.1.1 Materiales
 Biorreactor de 100 mL (Erlenmeyer)
 Agitador magnético
 pH-metro
 Balanza analítica
 Balones aforados
 Estufa
 Pipetas
 Termó metros
 Hielo

2.1.2 Reactivos
 Almidó n nativo de yuca.
 Biocatalizador: α -amilasa de Bacillus licheniformis [300 KNU/g, Liquozyme, Novozyme]
 Buffer citrato y fosfato pH=5.0
 Reactivo de DNS

2,2 MÉTODOS

2.2.1 PREPARACIÓ N DE LA MUESTRA

 Se prepararon 50 ml de una solució n tampó n de citrato de sodio con pH 5,0 con suspensiones de almidó n nativo
de yuca para cada una de las concentraciones consideradas (0,5, 1,0, 1,5, 2%).
 Posteriormente, la muestra se colocó en un recipiente Erlenmeyer (biorreactor) de 100 mL y también se
introdujo un imá n para facilitar el proceso de agitació n.
 Luego se calentó con un bañ o termostá tico, manteniendo la temperatura de reacció n a 60 °C. Es importante
mencionar que la temperatura se midió mediante un termopar.
 Se agregaron 50 µl de la enzima α-amilasa, agitamos a una velocidad de 4500 rpm en un plato agitador y lo
calentamos en un horno, manteniendo siempre la temperatura a 60°C por un periodo de 15 minutos iniciado
desde el momento en que la muestra alcanzó una temperatura de 60 ° C.
 Finalmente, pasado este tiempo, se suspendió la reacció n que contenía 1 ml de etanol y así se sometió a un
proceso de centrifugació n utilizando una placa agitadora durante aproximadamente 7 minutos.

2.2.2 DETERMINACIÓ N DE AZÚ CARES REDUCTORES CON LA TÉ CNICA DNS

Para determinar los azú cares reductores se utiliza un espectrofotó metro mediante colorimetría DNS (á cido 2,5-dinitrilo-
salicílico). Para ello, se tomaron muestras y se inactivaron enzimá ticamente en un bañ o de agua a aproximadamente
100°C durante 10 minutos, seguido de un choque térmico en un bañ o de hielo a 4°C durante 5 minutos.

Luego se retiró el tubo de muestra, se agregaron 5 ml de agua y se inició la agitació n durante 10 segundos. Finalmente, se
midió la absorbancia a 540 nm utilizando un espectrofotó metro.

3. RESULTADOS
TABLA 1 datos de absorció n a diferentes concentraciones
Concentración Absorbancia(α- Absorbancia
[Sustrato] amilasa) (Amiloglucosidasa)
 1 0,272 0,23
1 0,273 0,225
1 0,258 0,276
1,5 0,364 0,311
1,5 0,397 0,329
1,5 0,401 0,35
2 0,563 0,465
2 0,527 0,442
2 0,516 0,401
2,5 0,591 0,468
2,5 0,613 0,449
2,5 0,604 0,459
3 0,613 0,462
3 0,619 0,447
3 0,633 0,474
Fuente: Elaboración propia

CURVA DE CALIBRACION: 𝑌 =0,3439 𝑋 − 0,05141Ec 1

Y es el valor de absorbancia
X es la concentració n de glucosa expresada en g/L .

Despejamos X de la Ec 1 y calculamos la concentració n de la alfa amilasa y la amiloglucosidasa a partir de los valores de

absorbancia para cada concentració n

𝑌 +0,0541
𝑋= Ec 2
0,3449

TABLA 2 valores de producto de alfa amilasa y amiloglucosidasa

Absorbancia producto
Concentración Absorbancia(α producto alfa
(Amiloglucosida amiloglucosida
[Sustrato] -amilasa) amilasa
sa) sa
1 0,272 0,23 0,940418726 0,818290201
1 0,273 0,225 0,943326548 0,80375109
1 0,258 0,276 0,899709218 0,952050015
1,5 0,364 0,311 1,207938354 1,053823786
1,5 0,397 0,329 1,303896482 1,106164583
1,5 0,401 0,35 1,31552777 1,167228846
2 0,563 0,465 1,78659494 1,50162838
2 0,527 0,442 1,681913347 1,434748473
 2 0,516 0,401 1,649927304 1,31552777
2,5 0,591 0,468 1,868013958 1,510351846
2,5 0,613 0,449 1,931986042 1,455103228
2,5 0,604 0,459 1,905815644 1,484181448
3 0,613 0,462 1,931986042 1,492904914
3 0,619 0,447 1,949432975 1,449287584
3 0,633 0,474 1,990142483 1,527798779
Fuente: Elaboración propia

Con los valores de producto de alfa amilasa y amiloglucosidasa procedemos a calcular las velocidades para cada
concentració n
𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑐𝑢𝑡𝑜
Sabemos que 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑= Ec 3
𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜
Tiempo= 15 minutos

TABLA 3 valores velocidades de alfa amilasa y amiloglucosidasa a diferentes concentraciones

Concentración producto velocidad alfa velocidad
producto alfa amilasa
[Sustrato] amiloglucosidasa amilasa amiloglucosidasa
1 0,940418726 0,818290201 0,062694582 0,05455268
1 0,943326548 0,80375109 0,062888437 0,053583406
1 0,899709218 0,952050015 0,059980615 0,063470001
1,5 1,207938354 1,053823786 0,080529224 0,070254919
1,5 1,303896482 1,106164583 0,086926432 0,073744306
1,5 1,31552777 1,167228846 0,087701851 0,077815256
2 1,78659494 1,50162838 0,119106329 0,100108559
2 1,681913347 1,434748473 0,112127556 0,095649898
2 1,649927304 1,31552777 0,109995154 0,087701851
2,5 1,868013958 1,510351846 0,124534264 0,100690123
2,5 1,931986042 1,455103228 0,128799069 0,097006882
2,5 1,905815644 1,484181448 0,127054376 0,09894543
3 1,931986042 1,492904914 0,128799069 0,099526994
3 1,949432975 1,449287584 0,129962198 0,096619172
3 1,990142483 1,527798779 0,132676166 0,101853252
Fuente: Elaboración propia

Multiplicamos las velocidades por el factor 5 ya que en el procedimiento se realizó una dilució n 1:5

TABLA 4 valores velocidades de alfa amilasa y amiloglucosidasa a diferentes concentraciones con el factor dilución
factor dilución 1:5
Concentración velocidad alfa velocidad velocidad alfa velocidad
[Sustrato] amilasa amiloglucosidasa amilasa amiloglucosidasa
1 0,062694582 0,05455268 0,313472909 0,2727634
1 0,062888437 0,053583406 0,314442183 0,26791703
1 0,059980615 0,063470001 0,299903073 0,317350005
1,5 0,080529224 0,070254919 0,402646118 0,351274595
1,5 0,086926432 0,073744306 0,434632161 0,368721528
 1,5 0,087701851 0,077815256 0,438509257 0,389076282
2 0,119106329 0,100108559 0,595531647 0,500542793
2 0,112127556 0,095649898 0,560637782 0,478249491
2 0,109995154 0,087701851 0,549975768 0,438509257
2,5 0,124534264 0,100690123 0,622671319 0,503450615
2,5 0,128799069 0,097006882 0,643995347 0,485034409
2,5 0,127054376 0,09894543 0,635271881 0,494727149
3 0,128799069 0,099526994 0,643995347 0,497634971
3 0,129962198 0,096619172 0,649810992 0,483095861
3 0,132676166 0,101853252 0,663380828 0,50926626
Fuente: Elaboración propia

Para cada concentración se calcula las velocidades promedias tanto de la alfa amilasa como para la
amiloglucosidasa
TABLA 5 velocidades promedios de alfa amilasa y amiloglucosidasa a diferentes concentraciones
Concentración V.promedio Alf V.promedio
[Sustrato] amilasa amiloglucosidasas
1 0,309272721 0,286010145
1,5 0,425262512 0,369690802
2 0,568715066 0,472433847
2,5 0,633979516 0,494404058
3 0,652395722 0,496665697
Fuente: Elaboración propia

4. CONSULTAS
5. DISCUSIONES
6. CONCLUSIONES
7. BIBLIOGRAFÍA