Tecnológico Nacional de México

Instituto Tecnológico Superior de Acayucan

Ingeniería bioquímica
701-B
Taller de investigación II
ACA – 0910

Actividad por equipo

“Protocolo de investigación”
Proyecto: “Caracterización cinética y microbiológica de fermentado
láctico en fase líquida (Yogur).”

Integrantes
Manuel Erias María Guadalupe
Pascual Lozano Luis Antonio
Pacheco Osorio Hannia Yamila
Sánchez Cortes Roberto Carlos
Sánchez Hernández Axel Jared
Salomón López María Guadalupe
Tadeo Fernández Cristina Isabel
Utrera Mora Angel Eduardo

Docente: Bióloga Yolanda Retama Ortiz

Acayucan, ver. 26 de agosto del 2022
 CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y
MICROBIOLÓGICA DE FERMENTADO
LÁCTICO EN FASE LÍQUIDA.

YOGUR

pág. 2
 Índice
1.1 Introducción .......................................................................................................................... 4
1.2 Planteamiento del problema ............................................................................................. 5
1.3 Justificación .......................................................................................................................... 5
1.4 Objetivo general ................................................................................................................... 5
1.5 Objetivos específicos ......................................................................................................... 6
1.6 Hipótesis nula ....................................................................................................................... 6
1.7 Hipótesis alternativa ........................................................................................................... 6
1.8 Antecedentes ........................................................................................................................ 6
1.8.1 Caracterización cinética y bioquímica de L. plantarum y L. fermentum de una
bebida fermentada. .................................................................................................................... 6
1.8.1.1Resumen....................................................................................................................... 7
1.8.2 Identificación molecular y caracterización cinética de bacterias ácido
lácticas aisladas de una bebida fermentada....................................................................... 7
1.8.2.1 Resumen...................................................................................................................... 7
1.9. Marco teórico ....................................................................................................................... 7
1.9.1 Historia ............................................................................................................................ 8
1.9.2 Clasificación .................................................................................................................. 8
1.9.3 Funciones ....................................................................................................................... 8
1.9.4 Metabolismo .................................................................................................................. 9
1.9.5 Microrganismo utilizado en el proceso de elaboración del yogur .................. 9
1.10. Metodología ..................................................................................................................... 13
1.10.1 Diagrama general del proceso de elaboración del yogur. ................................ 13
1.11 Referencias ....................................................................................................................... 14
1.12 Cronograma de actividades.......................................................................................... 16

pág. 3
1.1 Introducción
La presente investigación se refiere al tema de caracterización cinética y
microbiológica de fermentado láctico en fase liquida “yogur”. El yogur es un alimento
lácteo fermentado que se produce al añadir bacterias a la leche, también conocidos
como fermentos lácticos. Estos fermentos lácticos, invisibles a simple vista, son
microorganismos vivos capaces de transformar la leche en yogur mediante un
proceso llamado fermentación. (Condony, R., Mariné, A., & Rafecas, M. 1988)

La fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta, totalmente

anaeróbico, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos productos finales
son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones. (Quito, D. 2009)

Las características cinética y microbiológica; la cinética microbiana se define como

el conocimiento y el entendimiento de los procesos y reacciones de la vida
microbiana: reproducción, desarrollo, muerte, adaptación, ciclos celulares e
interacciones ambientales. (Santis L. C.Y. 2014)

Para empezar, se realiza la elaboración de medio cultivo que se utilizaran en

proceso de elaboración del yogur, para la identificación de los microorganismos:
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus johnsonii, Stretococcus thermophilus. Se
llevaron a cabo una serie de observaciones de su morfología colonial y su
morfología celular identificando la ausencia o presencia de crecimiento en
determinados medios de cultivos, reconociendo que la presencia de crecimiento en
algunos medios de cultivo puede indicar una mala seguridad de higiene en la
elaboración del yogur, por ejemplo, en el medio de (Agar bilis) se utiliza para la
identificación de coliformes lo que conllevaría a una contaminación en la producción
del yogur (Franco, F. M. J. 2000).

Se determinó en su morfología celular la presencia de Bacilos pequeños gram

positivos y bacilos largos gram positivo en cultivo (MRS) para Lactobacillus. En
cultivo (TSA) para S. thermophilus se distinguieron cocos pequeños y de manera
lineal gram positivo, en cultivo (MRS) para L. fermentum se distinguieron Bacilos
largos Gram positivo (Guzman L. A.C. 2016).

pág. 4
La investigación de este tema se realizó teniendo en cuenta que una mala
manipulación puede provocar un menor tiempo de vida del producto o un producto
muy agrio, además, detener la fermentación demasiado pronto puede causar que el
suero líquido se separe de los sólidos del yogur, creando un producto sin
consistencia, afectando la calidad del mismo.

1.2 Planteamiento del problema

El yogur es un ingrediente esencial en una dieta saludable, vivimos en un mundo
con personas las cuales padecen problemas intestinales, por eso nos dimos a la
tarea de crear un yogur con probióticos para tener sus beneficios en un producto
fermentado comestible. Dado que, así se busca combatir y prevenir enfermedades
intestinales, ayudando de esta forma a personas a las que la asimilación de la leche
provoca problemas digestivos o de alergias, pues el yogur se digiere fácilmente sin
forzar el intestino.

1.3 Justificación
El consumo de productos lácteos es vasto, en particular la ingesta del yogur, como
es pertinente el empleo de las bacterias acido lácticas permite la obtención de un
amplio número de productos lácteos fermentados de gran relevancia.

El propósito de este proyecto es desarrollar un producto de fermentación láctica con

los microorganismos Streptococus thermophilus y Lactobacillus fermentum para la
elaboración de un producto probiótico. El producto se desarrolla con un especial
énfasis en un yogur de café, tomando en cuenta la metodología pertinente,
realizando una gran variedad de técnicas microbiológicas con el objetivo de poder
obtener un producto de calidad, así como poder conocer sus características
nutricionales, cinéticas y microbiológicas. Adquiriendo los conocimientos adecuados
para poder manejar correctamente los parámetros de operación utilizados en la
elaboración, desarrollando conocimientos bioquímicos.

1.4 Objetivo general

Identificar la estructura de un protocolo de investigación para el desarrollo de un
producto en fase liquida a partir de la fermentación láctica agregando

pág. 5
microorganismos probióticos como Lactobacillus fermentum y Streptococcus
thermophilus.

1.5 Objetivos específicos

• Recabar información en diversas fuentes bibliográficas.
• Modificar la formulación del producto existente añadiendo microorganismos
lácticos como Lactobacillus fermentum y Streptococcus thermophilus.
• Analizar aspectos metabólicos como la cinética de crecimiento e
identificación de la morfología celular a partir del aislamiento de los
microorganismos.
• Evaluar la calidad microbiológica de la materia prima y del producto final.

1.6 Hipótesis nula

El ácido láctico producido por las cepas de bacterianas ácido lácticas “Lactobacillus
fermentum y Streptococcus thermophilus” tienen una velocidad baja en cuanto a su
capacidad fermentativa. Sus capacidades metabólicas y adaptación al medio de
cultivo son muy bajas y por tanto no les permite tener un rendimiento mayor. El
proceso de fermentación podrá efectuarse de manera satisfactoria, pero tomará un
periodo de tiempo muy grande.

1.7 Hipótesis alternativa

El ácido láctico producido por las cepas de bacterianas ácido lácticas “Lactobacillus
fermentum y Streptococcus thermophilus” tienen una velocidad favorable en cuanto
a su capacidad fermentativa. Además, poseen una capacidad metabólica y de
adaptación del medio de cultivo lo suficientemente buena, permitiéndoles tener un
buen rendimiento. El proceso de fermentación podrá efectuarse de manera
satisfactoria sin margen de error.

1.8 Antecedentes
1.8.1 Caracterización cinética y bioquímica de L. plantarum y L. fermentum de
una bebida fermentada.
Autor: Santis López Claudia Yesenia

Fecha: Agosto – diciembre 2014 en Tuxtla Gutiérrez, Chiapas.

pág. 6
1.8.1.1Resumen
Mediante pruebas bioquímicas se caracterizaron a las bacterias ácido lácticas L.
plantarum (BAL-05) y L. fermentum (BAL-21) presentes en la bebida obtenida de la
savia de la palma Acrocomia aculeata (taberna).

Se determinaron parámetros cinéticos de ambas cepas bacterianas empleando

diferentes medios de cultivo, para estudiar el efecto de la inulina, Tween-80 y pH
inicial sobre el crecimiento y la resistencia a simulación gastrointestinal de las cepas
mencionadas (Santis 2014).

1.8.2 Identificación molecular y caracterización cinética de bacterias ácido

lácticas aisladas de una bebida fermentada.
Autor: Amayran Concepción Guzmán López

Fecha: Agosto de 2016 en Tuxtla Gutiérrez, Chiapas.

1.8.2.1 Resumen
Se realizó el análisis de la técnica de DGGE de la comunidad microbiana presente
en la bebida autóctona fermentada conocida como taberna. La identificación
molecular indicó la presencia de Lactobacilluspentosus, Lactobacillussucicola,
Lactobacillusnagelii y Lactobacillusplantarum.

La presencia de las BAL probablemente contribuye a la acidificación de la bebida y

el descenso del pH de 6.5 a 4.5 en los primeros días de la fermentación. Se
realizaron cinéticas de fermentación de 5 cepas BAL identificadas utilizando medios
sintéticos (MRS) con la finalidad de caracterizarlas (Amayran 2016).

1.9. Marco teórico

Las bacterias ácido lácticas han sido importantes en los alimentos por siglos por su
considerable contribución al valor de los productos. Debido a varias de sus
propiedades metabólicas, las bacterias ácido lácticas desempeñan un papel
importante en la industria alimentaria, por su aportación al sabor, olor, textura,
características sensoriales, propiedades terapéuticas y valor nutricional de los
productos alimentarios. Este grupo está compuesto de un número de géneros
incluyendo Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc

pág. 7
y Pediococcus. Algunos de los metabolitos producidos por este tipo de bacterias
son ácidos orgánicos, sustancias preservantes, polisacáridos, vitaminas,
endulzantes, olores y sabores entre otros (Tamime 1991).

1.9.1 Historia
El conocimiento de cultivos lácticos se originó en el siglo XVIII, cuando agricultores
de África, Asia y Europa observaron el comportamiento de la leche cruda en los
meses cálidos. La leche coagulaba y bajo estas condiciones presentaba un sabor
diferente, en ocasiones agradable, entonces los campesinos fueron seleccionando
las de mejor sabor para inocular la leche al día siguiente. Las BAL vivas pueden
estar contenidas en un grupo de microorganismos llamados cultivos lácticos o
iniciadores, se emplean en la industria láctea para la elaboración de leches
fermentadas, quesos, mantequilla y otros productos que para su obtención
requieren ser fermentadas (Tamime 1991).

1.9.2 Clasificación
Las BAL pertenecen al phylum Firmicutes que comprende alrededor de 20 géneros:
Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus,
Aerococcus, Carnobacterium, enterococcus, Oenococcus, tetragenooccus,
Vagococcusy Weisella son los principales miembros de las BAL, siendo
Lactobacillus es el más grande de estos géneros (Guzman L. A.C. 2016).

El tipo y característica de los organismos iniciadores que son utilizados en la

producción de leches fermentadas, son los dos más importantes factores que
determinan la calidad del producto final. El criterio esencial para la selección de
iniciadores incluye acidificación, aroma, sabor, estabilidad y textura. Estos se
pueden clasificar de varias maneras, dependiendo de su forma, temperatura de
crecimiento, funciones, etc (Guzman L. A.C. 2016).

1.9.3 Funciones
• Formación de ácidos orgánicos, principalmente ácido láctico a una velocidad
conveniente para asegurar una fermentación consistente y exitosa
fermentadas (Tamime 1991).

pág. 8
 • El ácido láctico obtenido a través de la fermentación de la lactosa, da un
sabor ácido fresco en leches fermentadas, mejora cuerpo y textura en los
quesos e inhibe, en parte, el desarrollo de flora contaminante y patógena
fermentadas (Tamime 1991).
• Asegura la calidad y uniformidad del producto final y en varios casos al valor
nutricional de productos alimenticios fermentadas (Tamime 1991).
• Formación de sabor ácido, inhibición de organismos patógenos, gelificación
de la leche, reducción del contenido de lactosa, formación de aroma,
proteólisis requerida en la maduración de los quesos, también han sido muy
utilizadas como probióticos fermentadas (Tamime 1991).

1.9.4 Metabolismo
Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) se pueden clasificar en dos tipos,
homofermentativas y heterofermentativas. (LY, M; 2008).

Las homofermentativas utilizan una ruta denominada Embden-Meyerhoff-Parnas

(EMP) y se producen más del 85% de ácido láctico a partir de glucosa. (Almanza F
y Barrera E, 1991). Por el contrario, las heterofermentativas solo producirán el 50%
de ácido láctico y utilizarán la vía de la hexosa monofosfato o la pentosa. Estas
fermentan 1 mol de glucosa para formar 1 mol de ácido láctico, 1 mol de etanol y 1
mol de dióxido de carbono. (Devlieghere, F; Vermeiren, L, 2004)

1.9.5 Microrganismo utilizado en el proceso de elaboración del yogur

1.9.5.1 Lactobacillus fermentum
1.9.5.1.1 Morfología
Forma Bacilos
Tinción Gram positiva (+)
Tamaño 2-5 mm
Respiración • Anaeróbica
• Microaerofílicos
• Aerotolerantes
Características • Tienen una rara producción de
• pigmentos, en este caso es
blancas-grisáceas.
• Son bacterias no esporuladas

pág. 9
 Tabla 1 Morfología Lactobacillus fermentum (Bergey’s. 1992, Carr, Chill y
Maida. 2002, Kandler. 1983, Mikelsaar, Zilmer, Kullisaaar y Annuk. 2002 &
Vázquez, Suárez y Zapata. 2009)

1.9.5.1.2 Condiciones de crecimiento

Las condiciones de crecimiento para L. fermentun son generalmente establecidas

por el pH considerado óptimo: 4-6, la temperatura, aumento de sales en la solución
(estrés osmótico) y tiempo a este tipo de condiciones se llaman estrés porque
confieren un medio necesario para el cultivo de L. fermentum para potencialmente
poderlo trasladar a un nivel industrial (Gu,2018).

Este estrés se debe determinar para poder observar donde se ve favorecido el

crecimiento, por ejemplo, en el pH si es alto – bajo puede favorecer L. fermentum a
un mayor crecimiento (Gu,2018).

Son estrictos en cuanto a aminoácidos, péptidos, nucleótidos, vitaminas, minerales,

ácidos grasos y carbohidratos (Gu,2018).

El medio de cultivo también es una condición de crecimiento importante ya que en

ese medio proporcionara los nutrientes necesarios para el buen crecimiento de la
bacteria L. fermentum (Gu,2018).

En el caso del L. fermentum, este pertenece al grupo de las bacterias

heterofermentativas, es decir, las que producen ácido láctico y otras sustancias.
Pero también, se dividen según su metabolismo de carbohidratos en heteroláctica
(Gu,2018).

1.9.5.1.3 Medio de cultivo (Agar MRS)

El agar MRS es un medio selectivo, que se basa en la formulación desarrollada por

de Man, Rogosa y Sharpe. Este medio proporciona los nutrientes para un buen
crecimiento de lactobacilos en general. El medio es apto para el crecimiento de
bacterias del ácido láctico, incluidos Lactobacillus, Pediococcus y Leuconostoc
(Man, 1960).

Los lactobacilos son microaerofílicos que generalmente requieren placas en capas

para el cultivo aeróbico en medios sólidos. Las colonias sumergidas o superficiales

pág. 10
pueden ser compactas o plumosas, de tamaño pequeño, opacas y suelen ser
blancas (Man, 1960).

Fórmula en g/L
Agar bacteriológico 10
Dextrosa 20
Sulfato magnésico 0.2
Extracto de carne 8
Tween 80 1
Citrato amónico 2
Peptona bacteriológica 10
Fosfato dipotásico 2
Sulfato de manganeso 0.05
Acetato de sodio 5
Extracto de levadura 4

Tabla 2 Formulación del Agar MRS (Man, 1960)

1.9.5.1.4 Preparación

• Suspender 62 gramos del medio en un litro de agua destilada.

• Mezclar bien y disuelva calentando con agitación frecuente.
• Hervir durante un minuto hasta disolver por completo.
• Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121 ° C
durante 12 minutos.
• Enfriar a 45 o 50 °C, mezclar bien y dispensar en placas.
• Almacenar a una temperatura mínima de 2°C y una temperatura máxima 8°C.

1.9.5.2 Streptococcus thermophilus

1.9.5.2.1 Morfología
Forma Cadenas lineales de Cocos
Tinción Gram positiva (+)
Tamaño 0.7-0.9 µm
Respiración • Anaerobios facultativos
• Anaerobios estrictos
• Aerotolerantes
Características • Son bacterias no esporuladas

pág. 11
 Tabla 3 Morfología Streptococcus thermophilus (Barrientos, 2011 y Pérez,
1991)

1.9.5.2.1. Condiciones de crecimiento

El pH óptimo de crecimiento de S. thermophilus es de 6.8. Sobreviven a

calentamientos de 60°C durante 30 minutos. La temperatura mínima de crecimiento
es de 19° a 21°C y la máxima 52°C. Crece muy bien a 37 °C (Franco, 2000).

El papel de S. thermophilus en la fermentación de la leche se debe a su rápida

conversión de la lactosa en ácido láctico, provocando un rápido descenso en el pH
y la producción de metabolitos importantes por sus propiedades tecnológicas
(Franco, 2000).

1.9.5.2.2 Medio de cultivo (Caldo de soya tripticasa)

1.9.5.2.3.- Uso:

El caldo tripticasa de soja es un medio de uso general que permite el crecimiento

de una amplia variedad de microorganismos, tanto de microorganismos exigentes
como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias (Franco, 2000).

1.9.5.2.4.- Incubación:

24-48 horas a 37°C en atmósfera aeróbica, con CO2 o anaeróbica(Franco, 2000).

1.9.5.2.5.- Siembra:

Sembrar el medio de cultivo conforme al protocolo. Inocular directamente el caldo

con la muestra o con asa bacteriológica el microorganismo en estudio asegurándose
de realizar una suspensión homogénea (Franco, 2000).

pág. 12
 1.10. Metodología

1.10.1 Diagrama general del proceso de elaboración del yogur.

1 2 3 4

Recolección de muestra Aislamiento de Observación de morfoligía Tinción de Gram

inicial microorganimos en placas colonial
de Agar MRS y TSA

8 7 6 5
Inoculación de 100μl del Inoculación de 100μl del Inoculación de una colonia
segunndo caldo con primer caldo con en caldo MRS para L. Observación de morfologia
crecimiento a otro nuevo crecimiento a otro nuevo fermentum y TSA para S. celular en microscopio
con leche para el precultivo con MRS y TSA thermophilus

9 10 11 12

Inoculación de 1% de leche Recepción de materia prima Calentar la leche a 45-50 ºC Aumentar sólidos (leche
de precultivo para 3l de (leche con microorganismos entera)
leche bronca aislados)

16 15 14 13

Inoculación Enfriamiento Trátamiento térmico Agregar azúcar

17 18 19 20

Agitación Incubación Enfriamiento Homogeneización del gel

22 21

Envasado Frutado

pág. 13
1.11 Referencias
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pág. 15
 1.12 Cronograma de actividades
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ACTIVIDADES MARZO ABRIL MAYO JUNIO JULIO

INDICE
RESUMEN

INTRODUCCION

JUSTIFICACION

OBJETIVO GENERAL Y
ESPECIFICOS

PLANTAMIENTO DEL
PROBLEMA
HOPOTESIS NULA Y
ALTERNATIVA

CRONOGRAMA DE
ACTIVIDADES

MARCO TEORICO

METODOLOGIA,

ANALISIS Y DISCUSION DE
LOS RESULTADOS

CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES

COMENTARIOS

ANEXOS

pág. 16