Caracterización fenotípica de tres cepas

de bacterias ácido lácticas aisladas de un

consorcio presente en una leche
fermentada natural
Phenotypic characterization of three lactic acid bacteria strains isolated from a microbial
consortium found in a naturally fermented milk

Alumna:Paula Fernández Bayón

Tutor: Baltasar Mayo Pérez y Bernardo Prieto Gutiérrez
TRABAJO FIN DE GRADO, GRADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS, FACULTAD
DE VETERINARIA, UNIVERSIDAD DE LEÓN.
FECHA:
CURSO: 2018/2019
El presente TRABAJO FIN DE GRADO, perteneciente al GRADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE
LOS ALIMENTOS de la Universidad de Léon, ha sido realizado por Paula Fernández Bayón bajo la
dirección del Dr. Baltasar Mayo Pérez, del Departamento de Microbiología y Bioquímica de
Productos Lácteos, Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA), Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC), y la tutoría y supervisión del profesor Bernardo Prieto
Gutiérrez, del Departamento de Higiene y Tecnología de Los Alimentos.

Tipo de trabajo:

 experimental X
 revisión bibliográfica □
 profesional □
 otro □

En León, a …………… de Julio de 2019

Fdo.:Paula Fernández Bayón VºBº : Baltasar Mayo Pérez VºBº :Bernardo Prieto Gutierrez

2
 ÍNDICE
1 Introducción/antecedentes.................................................................................................................. 3
1.1 Fermentación de los alimentos..................................................................................................... 3
1.2 La Leche......................................................................................................................................... 3
1.3 Bacterias ácido lácticas ................................................................................................................. 4
1.4 Cultivos iniciadores o fermentos .................................................................................................. 5
1.5 Leches fermentada naturales ....................................................................................................... 7
1.5.1 Microbiología de una leche fermentada natural .................................................................. 7
2 Objetivos del trabajo ............................................................................................................................ 8
3 Materiales y métodos .......................................................................................................................... 9
3.1 Recuperación de las bacterias ...................................................................................................... 9
3.2 Extracción de adn total ................................................................................................................. 9
3.3 Purificación, cuantificación de adn y secuenciación ..................................................................... 9
3.4 Sistema Api 50............................................................................................................................... 9
3.5 Sistema Api zym .......................................................................................................................... 10
3.6 Resistencia/susceptibilidad a antibióticos .................................................................................. 10
3.7 Detección y cuantificación de azúcares y ácidos orgánicos ........................................................ 11
3.8 Análisis de componentes volátiles .............................................................................................. 11
3.9 Producción de aminas biógenas ................................................................................................. 11
4 Resultados y discusión ....................................................................................................................... 12
4.1 Identificación de las 3 cepas ....................................................................................................... 12
4.2 Utilización de carbohidratos ....................................................................................................... 12
4.3 Actividad enzimática de los aislados ........................................................................................... 14
4.4 Susceptibilidad/ resistencia a antibióticos.................................................................................. 15
4.5 Detección y cuantificación de azúcares y ácidos orgánicos ........................................................ 16
4.6 Análisis de componentes volátiles .............................................................................................. 19
4.7 Producción de aminas biógenas ................................................................................................. 20
5 Discusión general ............................................................................................................................... 20
6 Conclusiones....................................................................................................................................... 21
7 Agradecimientos ................................................................................................................................ 22
8 Bibliografía ......................................................................................................................................... 23

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Resumen
En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterización fenotípica de tres cepas de bacterias
ácido lácticas aisladas de un consorcio presente en una leche fermentada natural. Las tres
cepas estudiadas fueron Lactococcus lactis subsp. lactis 3LA1, Lactococcus lactis subsp. cremoris
3LA10 y Lactobacillus plantarum 3LA30. Para ello en primer lugar, se procedió a revisar su
identificación mediante la secuenciación del gen que codifica el ARNr 16S. La caracterización
fenotípica incluyó el estudio de las actividades enzimáticas, la capacidad de utilización de
carbohidratos y la susceptibilidad y resistencia a una serie de antibióticos mediante kits
comerciales. Además se cuantificó por técnicas cromatográficas la producción y el consumo de
azúcares y ácidos orgánicos, la producción de componentes volátiles y de aminas biógenas.
Todas estas propiedades determinan las características tecnológicas, organolépticas y
seguridad de las cepas para su utilización en la fermentación de la leche para la elaboración de
productos fermentados. Los resultados obtenidos mostraron que las cepas son aptas para
poder ser utilizadas en el sector productivo ya que mostraron aptitudes tecnológicas positivas
para su empleo como fermentos de forma individual y conjunta. Por su parte, no presentaban
resistencias adquiridas a antibióticos ni producían sustancias tóxicas.

Abstract
In this work, the phenotypic characterization of three strains of lactic acid bacteria isolated
from a consortium found in a natural fermented milk has been carried out. The three strains
studied were Lactococcus lactis subsp. lactis 3LA1, Lactococcus lactis subsp. cremoris 3LA10 and
Lactobacillus plantarum 3LA30. To do this, we first proceeded to review their previous
identification by sequencing the gene encoding the 16S rRNA. The phenotypic characterization
was undertaken with some commercial kits and included the study of their enzymatic activities,
the carbohydrate-utilization ability, and the determination of the susceptibility and resistance
profiles to a series of antibiotics. In addition, the production and consumption of sugars and
organic acids, the production of volatile components and biogenic amines were assessed by
chromatographic techniques. All these properties determine the technological, organoleptic
and safety characteristics of the strains for use in the fermentation of milk to derive dairy
fermented products. The results obtained showed that the strains are appropriate to be used as
starters in dairy since they showed positive technological traits both individually and jointly. On
the other hand, they did not present acquired resistances to antibiotics and did not produce
toxic substances.

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1 INTRODUCCIÓN/ANTECEDENTES

1.1 FERMENTACIÓN DE LOS ALIMENTOS

La fermentación de los alimentos es una práctica muy antigua que está presente en todas las
civilizaciones humanas. Hay diferentes formas de definir los alimentos fermentados; una de las
más aceptadas los define como ``aquellos alimentos cuyo procesamiento involucra el
crecimiento y la actividad de microorganismos que modificarán las propiedades organolépticas
y nutritivas de los mismos´´ (Mayo et al., 2010).
Los alimentos fermentados no alcohólicos se clasifican en 8 grupos fundamentales: verduras
fermentadas, leguminosas fermentadas, leguminosas de soja fermentadas, cereales
fermentados, carnes fermentadas, pescados fermentados, productos de raíz/tubérculos
fermentados y leches fermentadas (Tamang, 2010). El trabajo de este TFG se centra en el grupo
de las leches fermentadas.

1.2 LA LECHE
La leche se puede definir desde dos puntos de vista diferentes: uno biológico y otro físico-
químico. Desde el punto de vista biológico podemos concretarla como ``el fluido secretado por
las glándulas mamarias de las hembras de los mamíferos cuya finalidad natural es la
alimentación de las crías durante los primeros estadíos de la vida´´ (Early, 2000; Ordóñez
Pereda et al., 2010). Si se analiza desde un punto de vista físico-químico, la leche se puede
definir como ``una mezcla homogénea de un gran número de sustancias de las cuales unas se
encuentran en emulsión (grasa y sustancias asociadas), otras en suspensión (caseínas ligadas a
sales minerales) y algunas otras en disolución verdadera (lactosa, vitaminas hidrosolubles,
proteínas de suero y sales minerales)´´ (Ordóñez Pereda et al., 2010).
La leche puede consumirse de varias formas diferentes; una de estas múltiples formas es
como leche fermentada (Alegría et al., 2010). Tras la leche líquida, las leches fermentadas son
las de mayor presencia en los hogares españoles, con un consumo medio de 14,47 kg/L/ por
persona y año en 2017 (España, 2018). Actualmente nos encontramos una amplia variedad de
leches fermentadas en el mercado, de las que las que la más popular en todo el mundo es el
yogur. Existen además otros tipos de leches fermentadas como el Kéfir, el Filmjölk, Langfil o Vilii,
la mazada fermentada o Buttermilk, y muchas otras (Tamang, 2010; Alegría, 2013).
La fermentación modifica el valor nutritivo de la leche, mejora las propiedades sensoriales
(aspecto, sabor, textura) propias de la materia prima e incrementa su vida útil (Ordóñez Pereda
et al., 1998).
El origen de las leches fermentadas se pierde en los orígenes de las comunidades humanas.
Con seguridad se sabe que las primeras leches fermentadas se produjeron de forma accidental,
mediante una acidificación espontánea de la leche causada por componentes de la microbiota
típica y otros microorganismos procedentes del ambiente (Mayo et al., 2010). Actualmente, la
fermentación espontánea se está sustituyendo por la inoculación de microorganismos
seleccionados (fermentos) y la fermentación se realiza en condiciones controladas.

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1.3 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son los microorganismos responsables de la acidificación
espontánea de la leche y los más ampliamente utilizados como fermentos, en esta y en otras
fermentaciones alimentarias. La propiedad más importante de las BAL en este sentido es su
capacidad para convertir los azúcares en ácido láctico (fermentación láctica) (Alegría, 2013). Las
BAL son un grupo de bacterias Gram-positivas con morfologías heterogéneas (cocos, bacilos,
cocobacilos), generalmente inmóviles, anaerobias estrictas o aerotolerantes, no esporuladas ni
pigmentadas, catalasa negativas y que no reducen los nitratos (Felis et al., 2016). Se
caracterizan además por ser muy exigentes desde el punto de vista nutricional, por lo que se
encuentran de forma natural en hábitats ricos (leche, carne, mucosas del hombre y de los
animales) y, de igual forma, requieren medios ricos para su multiplicación (Canteri, 1997; Felis
et al., 2016). Muestran una gran variedad fenotípica y presentan variadas propiedades
tecnológicas.
Las BAL tienen una gran importancia en la elaboración de alimentos fermentados a los que
aportan características sensoriales deseables y una buena capacidad de conservación, debido a
la bajada del pH en el alimento (Stiles, 1996). Su consumo ha tenido lugar desde tiempo
inmemorial sin que hayan aparecido efectos adversos, por lo que se consideran seguras desde
el punto de vista de higiénico-sanitario. Esta seguridad está avalada por el sello GRAS (Generally
Regarded as Safe) de la FDA americana (FDA, 2016) y por el estatus QPS (Qualified Presumption
of Safety) de la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2007).
Las BAL más características y más utilizadas en la industria de fermentación de la leche
pertenecen a los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus y a la especie
Streptococcus thermophilus.
Género Lactococcus:
Son BAL con morfología cocoide, mesófilas, homofermentadoras que producen ácido láctico
de tipo L (+). Dentro de este género están incluidas las especies Lactococcus lactis subsp. lactis y
Lactococcus lactis subsp. cremoris, además de Lc. garvieae, Lc. piscium y Lc. raffinolactis.
Ninguna de estas especies es patógena, excepto diversas razas de Lc. garvieae capaces de
causar infecciones en peces. Un tipo particular de Lc. lactis subsp. lactis lo constituye la
biovariedad diacetylactis con capacidad de metabolizar el citrato produciendo diacetilo,
compuesto aromático característico de la mantequilla y algunos quesos.
La especie más utilizada en la industria como fermento es Lc. lactis, y en concreto las cepas
de las subespecies lactis y cremoris (Mills et al., 2010). La especie Lc. lactis presenta una
estructura poco usual con dos fenotipos (lactis y cremoris) y dos genotipos diferentes (lactis y
cremoris) entre los que no hay una clara correspondencia (Fernández et al., 2011). La distinción
entre subespecies es, por tanto difícil, ya que se diferencian en unos pocos caracteres
fenotípicos que presentan gran variabilidad entre cepas, incluso de la misma subespecie.
Género Lactobacillus:
Las bacterias de este género son bacilos Gram-positivos, no esporulados, capaces de
colonizar hábitats tan diversos como los productos lácteos, la materia vegetal, la piel y las
mucosas del hombre y los animales.

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 Según el tipo de fermentación que producen, las especies de este género pueden clasificarse
en: homofermentadoras estrictas, heterofermentadoras facultativas y heterofermentadoras
obligadas. Dentro del primer grupo se encuentran las especies Lb. acidophilus, Lb. helveticus y
Lb. delbrueckii. Las especies más utilizadas en los productos lácteos son Lb. delbrueckii subsp.
bulgaricus y Lb. helveticus. Como heterofementadores facultativos se incluyen Lb. plantarum y
Lb. casei. Las especies de este grupo no se suelen incluir como componentes de los fermentos,
aunque forman parte de la microbiota secundaria de la gran mayoría de los productos
fermentados lácteos junto con especies de heterofermentadores estrictos como Lb. brevis y Lb.
fermentum (Alegría, 2013).
Género Leuconostoc:
Los Leuconostocs son BAL heterofermentadoras obligadas las cuales producen ácido láctico
de tipo D(-) y cantidades equimoleculares de CO2, etanol y ácido acético (Kowalczyk et al., 2016).
Se agrupan en cadenas como los lactococos, aunque se diferencian de estos por la producción
de gas y la incapacidad de hidrolizar la arginina. Este género comprende actualmente 16
especies, siendo las usadas como componentes de los fermentos mesófilos comerciales
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris y Leuconostoc lactis.
El interés tecnológico para la industria láctea de los leuconostocs es debido a su capacidad
para producir diacetilo y otros compuestos aromatizantes a través de la metabolización del
citrato de la leche (Alegría, 2013; Alegría et al., 2013).
Género Streptococcus:
Dentro de este género nos encontramos más de 80 especies descritas, de las cuales muchas
son patógenas. Solo la especie S. thermophilus es utilizada como cultivo iniciador en la industria
láctea. S. thermophilus es una bacteria homofermentadora y anaerobia facultativa (Hols et al.,
2005). La adaptación de esta cepa a los productos lácteos se ha producido mediante una
reducción genómica en la que los genes de patogenicidad y virulencia se han perdido y se han
ganado otros que codifican propiedades críticas para desarrollarse en leche (síntesis de
metionina, transportador de lactosa) (Bolotin et al., 2004). Además de en yogur, S.
thermophilus se emplea como cultivo iniciador habitual junto a varias especies de lactobacilos
en los quesos italianos y suizos. En los últimos años, S. thermophilus se emplea también junto a
Lc. lactis en otros tipos de quesos elaborados con fermentos mesófilos como Gouda o
Manchego (Alegría, 2013).

1.4 CULTIVOS INICIADORES O FERMENTOS

Los procedimientos fermentativos que se realizaban de una manera empírica hasta hace
relativamente poco tiempo, se ha ido sustituyendo por procedimientos controlados, basados
en el conocimiento científico de las propiedades de los productos lácteos y las de los
microorganismos utilizados en su elaboración. Este cambio ha sido debido a que la acidificación
espontánea origina ocasionalmente productos finales con características poco uniformes, con
graves defectos o alteraciones no deseadas. Para evitar este problema, microorganismos bien
caracterizados se añaden en la actualidad de forma deliberada como cultivos iniciadores tras la
pasterización de la materia prima (Mills et al., 2010).

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 Los cultivos iniciadores se definen como ``una cepa o un conjunto de cepas de una o más
especies microbianas que se utilizan en una materia prima para iniciar o controlar la
fermentación´´ (Parente and Cogan, 2004). Los componentes de los fermentos son los
responsables de los cambios que se producen durante la elaboración y maduración,
modificando el aroma, la textura y el sabor de los productos finales.
En concreto, las funciones específicas de los fermentos lácticos son:
 Producción de ácido, láctico esencialmente, a partir de la lactosa presente en la leche; lo
que reduce el pH e influye sobre el sabor y el aroma de los productos fermentados.
 Producción de compuestos aromáticos volátiles como el acetaldehído, el diacetilo y los
ácidos grasos de cadena corta.
 Producción de lipasas y proteasas que degradan los lípidos y las grasas de la leche,
generando componentes de sabor y aroma o precursores que se transformarán en estos
a través de diferentes reacciones catabólicas posteriores.
 Inhibición de bacterias alterantes y/o patógenas por diferentes procesos de
antagonismo microbiano, entre los que cabe destacar la producción de ácidos orgánicos
(láctico, acético), la producción de bacteriocinas, la formación de H2O2 y la competencia
por espacio y nutrientes.
 Mantenimiento del equilibrio bacteriano intestinal necesario para la salud. A fin de
mantener o recuperar el equilibrio intestinal o fortalecer las defensas se han
incorporado diversos microorganismos; siendo los lactobacilos y las bifidobacterias las
más utilizadas en este sentido (Alegría, 2013).
Los fermentos pueden clasificarse atendiendo a diferentes parámetros:
 Según su función principal se distinguen entre: acidificantes, aromatizantes y de
maduración.
 Según el modo de obtención: fermentos naturales, los microorganismos que se
recuperan de una elaboración anterior, o de diseño que incluye el aislamiento y la
caracterización de las cepas antes de su mezcla.
 De acuerdo con su composición: fermentos de cepa única y fermentos mixtos; estos
últimos a su vez pueden estar constituidos por mezclas definidas o por mezclas no
definidas.
 Atendiendo a la temperatura óptima de crecimiento de sus componentes se diferencian
entre fermentos mesófilos (Lc. lactis, Leuconostoc spp.) y termófilos (S. thermophilus, Lb.
delbrueckii, Lb. helveticus).
 En función de la forma de presentación: liofilizados y congelados.
 Existe una categoría especial que son los fermentos específicos; estos son creados para
un producto en particular, cuando se elaboran a partir de microorganismos aislados de
dicho producto se denominan fermentos autóctonos.
Los cultivos iniciadores habituales en la industria alimentaria son aquellos constituidos por
cepas del género Lactococcus, algunas cepas del género Lactobacillus y Leuconostoc junto con
cepas de la especie S. thermophilus. En la práctica industrial también se denominan fermentos a
otros tipos microbianos que no participan directamente en la acidificación pero que se añaden
a la fermentación con algún propósito tecnológico, participando en el desarrollo de las
características organolépticas típicas de los productos. Entre estos tipos microbianos podemos
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citar especies de propionibacterias y brevibacterias, mohos como Penicillium roqueforti o
Penicillium camemberti, y otros microorganismos (Tamang, 2010; Alegría, 2013).
El “backslopping” es una técnica tradicional de utilización de cultivo iniciador que consiste en
añadir como inóculo a una elaboración una porción de un producto de una fermentación
exitosa anterior. La aplicación de esta tecnología implica la transferencia continua de
poblaciones microbianas en condiciones ambientales específicas, que imprimen una gran
presión selectiva y consiguen consorcios estables que ayudan a la estandarización de los
productos fermentados (Alegría et al., 2010; FAO, 2010).

1.5 LECHES FERMENTADA NATURALES

Las leches fermentadas naturales (Naturally Fermented milk o NFM) constituyen productos
lácteos fermentados en los que se produce el crecimiento de BAL que provocan la acidificación
de la leche, causando su coagulación. Estas BAL son responsables también de la producción de
los componentes sensoriales más característicos de aroma y sabor de estos productos. Se
distinguen dos tipos de NFMs: inoculadas y no inoculadas. Las no inoculadas se producen
dejando a temperatura ambiente leche cruda, en condiciones suficientes para que se produzca
el desarrollo de las BAL presentes, lo que se traduce en una acidificación del medio y la
formación del coágulo. Las NFMs inoculadas se elaboran habitualmente por la técnica
“backslopping”, añadiendo una porción de un lote de NFM anterior a un nuevo sustrato de
leche. Cuando la elaboración se realiza a temperatura ambiente, la microbiota dominante está
constituida por BAL mesófilas y fundamentalmente cepas de Lc. lactis subsp. lactis y Lc. lactis
subsp. cremoris. Cuando la incubación se lleva a cabo en ambientes más cálidos o tras un
calentamiento, los microorganismos dominantes son Lb. delbrueckii y S. thermophilus. En todas
ellas es común encontrar también otras especies de Lactobacillus (Lb. plantarum y Lb. casei), así
como especies de Leuconostoc, Enterococcus y Pediococcus.
Las leches fermentadas pueden clasificarse según el tipo de microorganismos que realizan la
fermentación en:
-Leches de fermentación láctica: en las cuales son exclusivamente BAL las encargadas de
realizar la fermentación. Este tipo de leches fermentadas se subdividen a su vez en varias
subclases según el tipo de tratamiento de la leche y las condiciones de incubación (Mayo et al.,
2010):
 Mesófilas: como las leches acidificantes y Filmjök.
 Termófilas: donde encontramos el yogur.
 Probiótica: como leches con bifidobacterias, cuya finalidad es contribuir a mantener
el equilibrio microbiano intestinal.
-Leches de fermentación ácido-fúngica: la fermentación tiene lugar por una cooperación
entre BAL y levaduras, dentro de estas también se distingue entre:
 Leches alcohólicas como el Kéfir o el Kumis.
 Leches enmohecidas como el Viili.

1.5.1 Microbiología de una leche fermentada natural

El grupo de investigación en el que se llevado a cabo este TFG había estudiado la microbiota
de una leche NFM de origen armenio, que se mantuvo en el laboratorio mediante la técnica de

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backslopping durante algo más de un año y medio como resultado de una inoculación de leche
UHT esterilizada cada 3-5 días, seguido de una incubación a temperatura ambiente (20-25ºC)
durante 18-24 horas. Una vez coagulada la leche, se almacenaba en cámara fría (5-7ºC) para su
consumo hasta la fabricación de un nuevo lote.
La NFM se mantuvo durante todo este tiempo sin perder su actividad original o las
propiedades sensoriales (Alegría et al., 2010). En el laboratorio se continuó con la producción
utilizando los mismos métodos artesanales y las muestras se analizaron a los 0, 3, 6, 12 y 15
meses. Las propiedades sensoriales del producto se mantuvieron estables, de manera que el
estudio de los microorganismos que llevaban a cabo la fermentación parecía muy interesante
por la posibilidad de poder utilizarlos como un cultivo iniciador o como componentes de
fermentos industriales.
Los resultados de la caracterización microbiológica mostraron que la microbiota de este
producto estaba constituida únicamente por tres cepas: una de Lc. lactis subsp. lactis, una de Lc.
lactis subsp. cremoris y una de Lb.plantarum. En la leche fermentadas las cepas de lactococos
se encontraban a unos niveles aproximados de 1x108 ufc/ml y de 1x106 ufc/ml la cepa de Lb.
plantarum (Alegría et al., 2010). Estas tres cepas deben de presentar algún tipo de
protocolaboración para que se mantengan de manera estable y en los mismos niveles a lo largo
del tiempo tras las repetidas inoculaciones que se realizaron.

2 OBJETIVOS DEL TRABAJO

Con estos antecedentes, en este trabajo nos planteamos caracterizar fenotípicamente las
tres cepas que detectamos en esta leche fermentada. Esta caracterización contemplaba,
además de estudiar la diversidad fenotípica, diversos aspectos tecnológicos y de seguridad
alimentaria de las mismas. De esta manera podríamos conocer la posible utilidad de las cepas
de forma conjunta o de manera aislada como fermentos o componentes de fermentos para la
industria láctea. Además, el estudio de las propiedades de los tres microorganismos pudiera
aportar indicios de los mecanismos que subyacen a la cooperación entre las cepas durante los
procesos de elaboración y almacenamiento de la leche fermentada.
Este objetivo final se pretendía alcanzar mediante la determinación de las siguientes
propiedades y características:
1.- Estudio de la utilización de carbohidratos.
2.- Estudio de los perfiles enzimáticos de los aislados.
3.- Determinación de los perfiles de susceptibilidad/resistencia a antibióticos.
4.- Determinación del crecimiento en leche de manera aislada y en co-cultivo.
5.- Producción de ácidos orgánicos en leche.
6.- Estudio de la producción de compuestos volátiles.
7.- Determinación de la posible producción de aminas biógenas.

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3 MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 RECUPERACIÓN DE LAS BACTERIAS

Se partió de las 3 cepas de BAL: Lactococcus lactis subsp. lactis 3LA1, Lactococcus lactis
subsp. cremoris 3LA10 y Lactobacillus plantarum 3LA30. Estas cepas habían sido asiladas de la
leche fermentada natural por Alegría et al. (2010) y se conservaban congeladas a -80ºC. Las
cepas de Lc. lactis subsp. lactis y Lc. lactis subsp. cremoris se recuperaron en medio GM17
(medio M17 con un 0,5% de glucosa) (Oxoid) y la cepa de Lb. plantarum en MRS (Oxoid). La
incubación procedió en ambos casos a 32ºC durante 48 horas.

3.2 EXTRACCIÓN DE ADN TOTAL

Una colonia aislada de cada microorganismo se inoculó en 5 mL de GM17 con 40 mM de D-L-
treonina y se incubó a 32ºC durante 24 horas. Se recogieron 1,5 mL del cultivo que se
centrifugó 1 minuto a máxima velocidad. El pellet celular se resuspendió en 500 µL de agua
mili-Q estéril y se procedió a centrifugar en las mismas condiciones. Las células se recogieron y
se procedió a la extracción de su ADN total siguiendo las recomendaciones del fabricante del kit
Gen Elute Bacterial Genomic DNA (Sigma-Aldrich). El ADN purificado se sometió a una
electroforesis en un gel de agarosa al 1% en tampón 1X TAE (40 mM Tris, 20 mM ácido acético y
1 mM EDTA) a 75 V durante aproximadamente 60 minutos. El ADN se visualizó tras teñirlo con
bromuro de etidio (0,5 mg/mL). La imagen se capturó bajo luz UV empleando el equipo G-Box
(Syngene).

3.3 PURIFICACIÓN, CUANTIFICACIÓN DE ADN Y SECUENCIACIÓN

Empleando como molde el ADN purificado en el apartado anterior, se llevó a cabo una
reacción de PCR utilizando oligonucleótidos universales para amplificar la mayor parte del gen
que codifica el ARNr 16S. Tras la amplificación, el producto de PCR se purificó mediante el kit
GenElute PCR Clean-Up (Sigma-Aldrich), siguiendo las recomendaciones del fabricante.
La concentración de ADN y la relación de absorbancia a 260 y 280 nm (que se utiliza como
índice de calidad) se midieron con el espectrofotómetro Epoch (BioTek). Los amplicones se
conservaron después a -20ºC hasta su secuenciación.

3.4 SISTEMA API 50

La utilización de azúcares por los aislados se ensayó mediante el sistema API 50 (bioMérieux).
Para ello, se prepararon suspensiones celulares de cada una de las cepas por separado en una
solución salina (0,95%) estéril, con una turbidez igual al patrón 2 de la escala McFarland. Con
esta suspensión celular se inocularon 10 mL de medio CHL y se llenaron las cápsulas de las
galerías API 50. Las cúpulas de las cápsulas se rellenaron con aceite de parafina estéril. Las
galerías se incubaron después a 32 ºC durante 48 horas, momento en el que se llevó a cabo su
lectura. Se consideraran positivas las reacciones en las que se produce un viraje desde el color
morado del medio sin inocular al amarillo. Este cambio de color se produce debido al cambio de
color de un indicador de pH (púrpura de bromocresol) como consecuencia de la acidificación
del medio derivado del metabolismo bacteriano.

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3.5 SISTEMA API ZYM
Al igual que en el caso del API 50 CHL, se realizaron suspensiones independientes de cada
una de las cepas en estudio en 2 mL del API Suspension Medium (bioMérieux) con una densidad
óptica aproximada a la escala 5-6 de McFarland. A continuación, se adicionaron 65 µL de las
suspensiones a cada una de las cápsulas de la placa de API ZYM y se incubaron durante 4 horas
a 32ºC. Tras la incubación, se adicionó en la cúpula de cada cápsula una gota de los reactivos
ZYM A y ZYM B para facilitar la solubilización de las membranas celulares y ver más fácilmente
las reacciones. Tras una espera de 5 minutos durante los que se desarrolla el color, se lleva a
cabo la lectura de los resultados. Se consideran actividades positivas las reacciones cuya
concentración de producto sea igual o superior a 20 nmol.

3.6 RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS

Para llevar a cabo esta prueba se utilizó el kit comercial VetMICTM con las placas Lact-1 y
Lact-2 (National Veterinary Institute of Sweden). Mediante este kit, se analiza la concentración
inhibitoria mínima (CIM) de 16 antibióticos distintos mediante un método de dilución en pocillo.
Los antibióticos utilizados por este sistema y el rango de concentración de los mismos aparecen
detallados en la Tabla 1.
Tabla 1. Rangos de las concentraciones de los antibióticos

Agente Rango de concentraciones Rango de concentraciones

Agente antimicrobiano
antimicrobiano (µg/ml) (µg/ml)

Gentamicina 0,5-256 Ampicilina 0,03-16

Kanamicina 2-1024 Penicilina 0,03-16

Estreptomicina 0,5-256 Vancomicina 0,25-128

Neomicina 0,5-256 Dalfopristina/Quinupristina 0,016-8

Tetraciclina 0,12-64 Linezolid 0,03-16

Eritromicina 0,016-8 Trimetoprima 0,12-64

Clindamicina 0,03-16 Ciprofloxacina 0,25-128

Cloranfenicol 0,12-64 Rifampicina 0,12-64

Se prepararon los medios de cultivo IsoSensitest (IST) (Oxoid) y LMS (90% IsoSensitest, 10%
MRS), específicos para Lactococcus y Lactobacillus, respectivamente. Se siembran las placas con
las cepas a ensayar y se incuban a 32ºC durante 48 horas.
Una vez crecidas, colonias aisladas de cada una de las cepas por separado se resuspenden en
NaCl al 0,9% hasta conseguir una turbidez aproximada de 1 en la escala de McFarland. A partir
de esta suspensión celular, se efectúa una dilución 1:1000 en los caldos IST y LMS para las cepas
de lactococos y el lactobacilo, respectivamente. Alícuotas de 100 µL de las suspensiones se
inoculan en a cada pocillo de las placas microtituladoras con antibióticos y se incubaron a 32ºC
10
en condiciones de aerobiosis. Los resultados se leen a las 24 y a las 48 horas, observando si
existe crecimiento en cada uno de los pocillos de la placa (turbidez o pequeño precipitado). La
CIM se establece como la concentración más baja de antibiótico en la que visualmente no se
observa crecimiento.

3.7 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES Y ÁCIDOS ORGÁNICOS

La detección e identificación de los ácidos orgánicos y azúcares producidos tras el
crecimiento de las cepas bajo ensayo en leche se llevó a cabo mediante cromatografía líquida
de alta presión (HPLC). Para ello, las cepas se inocularon en 5 mL de leche UHT semidesnatada
esterilizada y se incubaron a 32ºC durante 30 horas. A continuación, 5 mL de los cultivos se
diluyeron en 25 mL de H2SO4 5,4 mM, y la mezcla de leche y ácido sulfúrico se agitó durante 1
hora a 37ºC. Después se centrifugó a 45000x g 10 minutos y el sobrenadante se filtró a través
de una membrana de 0,45 µm. Las muestras se analizaron por HPLC a través de una columna de
intercambio iónico ICSep ICE-ION-300 con dos detectores conectados en serie: un detector de
matriz de fotodiodo para la determinación de los ácidos orgánicos y un refractómetro
diferencial para la determinación de azúcares. La cuantificación de los azúcares y los ácidos
orgánicos identificados se realizó mediante curvas de calibración.

3.8 ANÁLISIS DE COMPONENTES VOLÁTILES

El análisis de los compuestos volátiles producidos por las cepas tras su cultivo en leche se
llevó a cabo mediante cromatografía de gases (CG) seguida de espectrometría de masas (MS).
Primeramente las colonias se inocularon (por triplicado, solas y en diferentes combinaciones)
en 1 mL de leche UHT y se incubaron a 32ºC durante 48 horas. Estos cultivos se utilizaron para
inocular al 1% los viales de espacio de cabeza con 10 mL de leche esterilizada adicionada con
100 µL del estándar interno (ciclohexanona). La leche se incubó durante 48 horas a 32ºC. Los
componentes volátiles se identificaron y cuantificaron mediante un equipo Agilent con los
componentes G188 HS, 6890 GC y 5975B (Agilent Technologies).

3.9 PRODUCCIÓN DE AMINAS BIÓGENAS

La producción de aminas biógenas por los tres aislados se evaluó tras la incubación de las
cepas en presencia de los aminoácidos precursores. Para ellos, se inocularon las 3 cepas en
GM17 y MRS para los lactococos y el lactobacilo, respectivamente, suplementando los medios
con 2 mM de los aminoácidos tirosina, histidina, arginina y lisina (precursores de tiramina,
histamina, putrescina y cadaverina), y se incubaron 48 horas a 32ºC. Tras este tiempo, los
cultivos se centrifugaron 10 minutos a 8000 x g y se tomaron 100 µL de los sobrenadantes a los
que se adicionaron los siguientes reactivos: 175 µL de borato 1 M pH 9, 0, 75 µL de metanol
100%, 3 µL de DEEMM (dietil-etoximetileno-malonato) y 2 µL del estándar interno (2-
aminoadipídico 2 mg/mL). Las mezclas se incubaron en un baño de ultrasonidos a 30ºC durante
45 minutos, para la derivatización de los aminoácidos y sus derivados, y 2 horas más en un baño
a 70ºC, para eliminar el exceso de DEEMM. Finalmente, las muestras se filtraron y se analizaron
por UHPLC.

11
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 IDENTIFICACIÓN DE LAS 3 CEPAS

En primer lugar, procedimos a la identificación molecular de las cepas para asegurarnos de
que estábamos trabajando con los aislados originales que ya habían sido identificados con
anterioridad (Alegría et al., 2010). La comparación de las secuencias de ADN obtenidas del
amplicón del gen que codifica para la mayor parte del ARNr 16S en la base de datos National
Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando el programa BLAST mostró que la
secuencia de cepa identificada como 3LA1 presentaba una identidad del 99,41% con otras
cepas de la base de datos identificadas como Lactococcus lactis subsp. lactis; la secuencia de la
cepa 3LA10 mostró un 99,51% de identidad con cepas de Lactococcus lactis subsp. cremoris y,
finalmente, la secuencia de la cepa 3LA30 mostraba un 99,71% de identidad con otras de la
base de datos identificadas como Lactobacillus plantarum. Quedaba claro, por tanto, que la
identidad de los aislados se correspondía con lo que esperábamos. De esta forma, procedimos a
continuación a la caracterización fenotípica exhaustiva de los mismos a través de las pruebas
que se describen a continuación.

Ilustración 1. Muestra parcial del cromatograma de la secuenciación del ADN de Lactococcus lactis subsp. lactis
3LA1, una de las tres cepas estudiadas

4.2 UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS

La capacidad de utilización de azúcares y carbohidratos de las cepas se evaluó mediante el
sistema API 50. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2.

12
 a
Tabla 2.Utilización de carbohidratos por las cepas Lc. lactis subsp. lactis 3LA1, Lc. lactis subsp. cremoris 3LA10 y Lb.
plantarum 3LA30

N-Acetil-
Gluconato Galactosa Glucosa Fructosa Manosa Ribosa Amigdalina Arbutina Esculina
Glucosamina
3LA1 - + + + + + + - + +
3LA10 - - + + + - + - - +
3LA30 + + + + + - + + + +
Salicina Celobiosa Maltosa Lactosa Melobiosa Manitol Sacarosa Trehalosa Melecitosa Gentiobiosa

3LA1 + + - + - - - + - +
3LA10 - - - + - - - - - -
3LA30 + + + + + + + - + +
a
Los carbohidratos ausentes en la tabla: glicerol, eritritol, D y L-arabinosa, D y L- xilosa, ribitol,β-metil-D-xilosa, sorbosa,
ramnosa, dulcitol, inositol, sorbitol, α-metil-D-glucosa, α-metil-D-manosa, manosa, inulina, rafinosa, almidón, glucógeno, xilitol,
turanosa,D-xilosa, tagatosa, D-L-fucosa, L-arabitol y 2/5-cetogluconato, no fueron utilizados por ninguna de las cepas.

Analizando los resultados obtenidos en la prueba, se distinguen diferencias y similitudes en

los patrones de fermentación de carbohidratos entre las cepas. Las tres cepas tienen capacidad
para fermentar glucosa, fructosa, manosa, N-acetil-glucosamina, esculina y lactosa. Por el
contrario, ninguna de las cepas analizadas tenía capacidad fermentar los siguientes sustratos:
glicerol, eritritol, D-arabinosa, L-arabinosa, D-xilosa, L-xilosa, ribitol, β-metil-D-xilósido, sorbosa,
ramnosa, dulcitol, inositol, sorbitol, α-metil-D-manosa, α-metil-D- glucósido, inulina, Rafinosa,
almidón glucógeno, xilitol, D-turanosa, D-lixosa, D-tagatosa, D-fucosa, L-fucosa, D- Arabitol, 2-
ceto-gluconato y 5- ceto-gluconato.
Estudiando las cepas individualmente, vemos que Lc. lactis subsp. lactis 3LA1 fermenta
ribosa, galactosa, arbutina, salicina, celobiosa, trehalosa y gentiobiosa. Lc. lactis subsp. cremoris
3LA30 tiene un perfil de utilización más reducido que la cepa 3LA1 y no utiliza ningún
carbohidrato más que los mencionados en la similitud entre las tres cepas. En cambio
Lb.plantarum 3LA30 es la cepa que más carbohidratos utiliza. Además de los comunes a las tres
cepas, utiliza también galactosa, manitol, amigdalina, arbutina, salicina, celobiosa, maltosa,
melobiosa, sacarosa, melecitosa, gentiobiosa y gluconato. Ha resultado sorprendente también
comprobar que la cepa de la subsp. lactis (3LA1) presenta un perfil de fermentación mucho más
extendido que el de la cepa de la subsp. cremoris (3LA10), puesto que, en general, las cepas de
las subsp. cremoris tienen mayor capacidad de utilización de carbohidratos que las de la subsp.
lactis, lo que concuerda a su vez con un mayor tamaño genómico (Kelly et al., 2010).
En este ensayo se comprueba una de las propiedades principales de las BAL: la
extraordinaria diversidad fenotípica respecto de la utilización de fuentes de carbono. Esta
utilización no tiene nada que ver con su afiliación taxonómica(Kandler y Weiss, 1986; Karl Heinz
Schleifer, 1986) de manera que, tal y como se ha repetido abundantemente(Carr et al., 2002;
Leroy y De Vuyst, 2004), la utilización de estos perfiles con criterios de identificación es muy
poco fiable.

13
 4.3 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LOS AISLADOS
Las actividades enzimáticas de las 3 cepas estudiadas en este trabajo, analizadas con el kit
comercial API ZYM, se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3.Actividad enzimática de las 3 cepas estudiadas medidas con API ZYM

Cepa Enzima (nmol)

α-
Fosfatasa Leucina Valina Cistina
Control Esterasa Esterasa lipasa Lipasa Tripsina Quimiotripsi
alcalina arilamidasa arilmidasa arilmidasa
na
3LA1 0 0 5 5 5 0 0 0 0 0
3LA10 0 0 5 5 0 5 0 0 0 0
3LA30 0 0 0 0 0 ≥40 ≥40 0 0 0
Cepa Enzima
Naftol-A-S-
α- β- α-
Fosfatasa BI- β- α- β- N-acetil-β-
Galactosi Glucuronidas Manosidas α-Fucosidasa
ácida fosfohidrola Galactosidasa Glucosidasa Glucosidasa glucosaminidasa
dasa a a
sa
3LA1 ≥40 ≥40 0 5 0 0 0 0 0 0
3LA10 ≥40 ≥40 0 5 0 0 0 0 0 0
3LA30 5 20 0 ≥40 0 0 20 20 0 0

Se puede observar que las cepas 3LA1 y 3LA10, correspondientes a Lc. lactis subsp. lactis y Lc.
lactis subsp. cremoris, respectivamente, presentan unas actividades enzimáticas muy parecidas.
Ambas cepas muestran actividades elevadas de fosfatasa ácida y de Naftol-A-S-BI-
fosfohidrolasa (por encima de 40 nmol). Estas dos cepas coinciden también en presentar una
ligera actividad de esterasa (C4), esterasa lipasa (C8) y β-galactosidasa. En cambio, la cepa
3LA30, identificada como Lb. plantatum, muestra una elevada actividad leucina arilamidasa,
valina arilmidasa y β-galactosidasa (superior a 40 nmol); además, presenta también actividades
menores de Naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa, β-glucosidasa y N-acetil-β-glucosaminidasa. A
diferencia de las dos cepas de lactococos, la cepa de Lb. plantarum presenta una pequeña
actividad fosfatasa ácida (5 nmol).

14
4.4 SUSCEPTIBILIDAD/ RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS
Tras la inoculación e incubación de las placas del kit VetMICTM Lact-1 y Lact-2 y su incubación,
se obtuvieron los resultados que se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Concentración inhibitoria mínima (µg/mL) de los antibióticos ensayados para Lc. lactis subsp. lactis 3LA1,
Lc. lactis subsp. cremoris 3LA10 y Lb. plantarum 3LA30

CONCENTRACIÓN INHIBITORIA
Especie
Gm Km Sm Nm Tc Em Cl Cm Am Pc Va Qda Lz Tm Ci Ri
Lc. lactis
<0,5 8 16 1 1 0,12 0,06 4 0,25 0,25 0,5 2 2 >64 2 >64
lactis

Lc. lactis
<0,5 <2 4 <0,5 0,5 0,03 <0,06 2 <0,03 <0,03 <0,25 2 0,5 >64 1 8
cremoris

Lb. plantarum <0,5 8 2 <0,5 32 0,12 2 8 1 4 >128 2 4 0,25 16 4

La resistencia a antibióticos es un problema de salud pública a escala mundial y compromete

y encarece el tratamiento de las enfermedades infecciosas causadas por bacterias resistentes
(Watkins y Bonomo, 2016). En esta prueba analizamos la posibilidad de que las cepas ensayadas
puedan presentar resistencias a antibióticos transmisibles. Cepas portando estas resistencias no
deben ser utilizadas en la cadena alimentaria, con el fin de no extender estas resistencias y
transmitirlas, finalmente, a las bacterias patógenas. La resistencia a los antibióticos puede ser
intrínseca o adquirida. La resistencia intrínseca es la que tienen los microorganismos
productores de antibióticos como autodefensa frente a su efecto inhibidor. También es aquella
en la que los microorganismos no presentan la diana molecular que ataca el antibiótico, como
es el caso de la Lb.plantarum que es resistente a vancomicina como resultado de la ausencia del
dipéptido D-alanina-D-alanina y su reemplazamiento de forma natural por D-Alanina-D-Lactato
(Florez, 2007) La resistencia adquirida se consigue en algún momento del ciclo vital del
organismo, siendo esta heredada por la descendencia. La resistencia puede tener lugar por
mutación o estar medida por genes adquiridos de otros microorganismos mediante
transferencia horizontal por procesos como conjugación, transformación o transducción (Florez,
2007).
Las dos cepas de lactococos son resistentes a la trimetoprima. La resistencia de Lc. lactis a la
trimetoprima se deriva de la ausencia de la ruta de síntesis de ácido fólico en estas bacterias
(Katla et al., 2001). La cepa 3LA1 mostró resistencia también a la rifampicina (CIM >64 μg/mL).
La rifampicina es un antibiótico de amplio espectro que inhibe la ARN polimerasa bacteriana.
Diversas mutaciones en el gen que codifica esta proteína (rpoB) se han relacionado con la
resistencia a este antibiótico en diversas BAL (Alifano et al., 2015). La secuenciación de este gen
o el análisis genómico de la cepa podría demostrar si este es el caso en 3LA1.
De acuerdo con la opinión científica de la EFSA, donde se muestra una tabla con los valores
de corte para las resistencias a antibióticos, para Lb. plantarum la concentración de corte para
la resistencia en tetraciclina es de 32 μg/mL que comparándola con los resultados obtenidos
está en el límite, por lo que no se consideraría resistencia. Analizando el resto de los
antibióticos estudiados en la opinión científica de la EFSA, vemos que no hay ninguna

15
concentración a la que podamos considerar que las cepas muestran resistencias adquiridas
(Rychen et al., 2018).

4.5 DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES Y ÁCIDOS ORGÁNICOS

La Tabla 5 muestra la producción y/o el consumo de los ácidos orgánicos tras la incubación
de leche con las diferentes cepas y todas sus posibles combinaciones. También muestra el
contenido de lactosa, glucosa y galactosa tras la fermentación.
Tras la inoculación de las cepas en leche UHT y su incubación pudimos observar cuáles eran
las muestras que habían coagulado y cuáles no. La muestra 3LA10 y todas las muestras que
incluían la combinación de esta cepa habían coagulado la leche tras las 48 horas de incubación.
La muestra 3LA1 y su combinación con la cepa 3LA30 de forma aislada también formaban
coágulo aunque les llevaba más tiempo que a la cepa 3LA10. Mientras que la cepa 3LA30 en
solitario no consiguió coagular la leche en ese periodo de 48 h.
Si analizamos los resultados obtenidos, podemos ver que el consumo de la lactosa, azúcar
presente en la leche de forma natural (Thierry et al., 2016), es más acentuado para las muestras
3LA1 y 3LA10, siendo más destacable en Lc. lactis subsp. lactis. En el resto de combinaciones el
consumo de este azúcar es menor, siendo la combinación de 3LA10 y 3LA30 y la combinación
de las 3 cepas las siguientes que mayor consumo presentan.
Vemos como la cepa que mayor producción de ácido láctico presenta es la cepa 3LA10,
todas las combinaciones que incluyen esta cepa y ella por solitario presentan valores altos de
ácido láctico, principal producto del metabolismo de las BAL. Esta cepa, junto con 3LA1, son
capaces de coagular la leche en los cultivos individuales, lo que sugiere que la otra no es capaz
de desarrollarse de forma adecuada en este medio. Dado que todas las cepas presentaban
actividades β-galactosidasa, esto nos sugiere que 3LA30 no tienen capacidad de utilización de
las caseínas; lo que requiere la actividad de una proteinasa extracelular con actividad
caseinolítica que no presentan todas las BAL (Liu et al., 2010). Todas las combinaciones
prácticamente han consumido el ácido orótico, fórmico, pirúvico, succínico, úrico e hipúrico.
Sobre el ácido cítrico podemos decir que únicamente la cepa Lc. lactis subsp. lactis 3LA1 lo
consume, lo que significa que esta cepa pertenece a la biovariedad diacetylactis. Las cepas de
Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis portan un plásmido en el que se codifica la
maquinaria de incorporación de citrato, mientras que el resto de los componentes de
utilización de este ácido orgánico y su conversión en diacetilo y acetoína está codificado en el
cromosoma bacteriano (Drider et al., 2004). Las cepas de esta variedad parecen estar muy
adaptadas al ambiente lácteo y son indistinguibles de otras de Lc. lactis subsp. lactis incapaces
de utilizar el citrato (Kelly et al., 2010).
El citrato es un compuesto que puede ser metabolizado por algunas especies de BAL,
produciendo compuestos volátiles como son el diacetilo, la acetoína y el butanodiol,
responsables de los aromas típicos de muchos productos fermentados (Smit et al., 2005). En el
metabolismo del citrato pueden darse diferentes productos intermediarios y finales, por eso
durante la realización de esta prueba nos encontramos con diferentes derivados del citrato. El
citrato una vez que entra en la célula es transformado en acetato y oxalato, siendo este último
a su vez transformado en piruvato (Mayo et al., 2010). El metabolismo del piruvato en las BAL
puede producir diferentes producto finales, como el lactato (ácido láctico en su forma ionizada),
16
formiato, acetato y etanol, tanto como, los componentes importantes del aroma diacetilo,
acetoína y butanodiol. La presencia de succínico puede justificarse debido a que algunas
especies de BAL no pueden convertir el citrato en piruvato y en su lugar se genera succinato a
través de malato y fumarato (Alegría et al., 2016; Kowalczyk et al., 2016).

Ilustración 2.Recorte del cromatograma de una de las cepas obtenido durante la cromatografía HPLC en la cuantificación de
ácidos orgánicos

17
Tabla 5.Ácidos orgánico y azúcares expresados en mg/100 mL detectados por HPLC tras en crecimiento de las cepas y sus combinaciones a 32ºC durante 48
horas en leche UHT

Orótico Cítrico Pirúvico Succínico Láctico Fórmico Acético Úrico Hipúrico Lactosa Glucosa Galactosa

Control 1,34±0,04 25,57±0,82 0,02±0 - 0,21±0,03 - - 0,41±0,02 0,36±0 812,44±27,78 1,68±0,04 2,43±0,09

3LA1 0,86±0,32 1,9±0,63 0,79±0,27 - 25,78±7,69 - 6,71±1,92 0,27±0,1 0,24±0,08 380,51±33,77 0,1±0,04 2,01±0,67

3LA10 0,88±0,02 21,7±5,94 0,12±0,01 0,61±0,02 104,84±2 0,12±0,01 0,8±0,08 0,33±0,01 - 577,27±17,69 0,09±0,01 8,98±0,13

3LA30 1,05±0,34 20,58±6,2 0,05±0,02 - 5,56±1,91 - 0,32±0,13 0,31±0,1 0,24±0,08 777,27±14,71 0,11±0,01 2,25±0,75

1//10 1,15±0,02 - 0,47±0,01 0,33±0,02 134,41±2 0,15±0,01 10,57±0,08 0,45±0,01 - 725,01±17,69 0,08±0,01 6,46±0,13

1//30 1,32±0,02 3,38±0,38 1,31±0,07 - 38,68±0,53 - 9,84±0,55 0,44±0,01 0,35±0,03 798,68 ±1,57 0,1±0,01 3,06±0,03

10//30 1,08±0,02 26,28±0,23 0,42±0,07 0,77±0,08 129,19±2,41 - 1,33±0,08 0,41±0 - 710,19±8,62 0,09±0,01 12,24±0,12

1//10//30 1,15±0,06 - 0,72±0,03 0,52±0,11 137,27±5,38 0,13±0,01 10,49±0,52 0,45±0,02 - 712,8±40,8 0,12±0,02 6,63±0,3
-, No se detecta

18
4.6 ANÁLISIS DE COMPONENTES VOLÁTILES
Los compuestos volátiles son los responsables del olor y por lo tanto contribuyen al flavor de
los productos lácteos fermentados. Los componentes del aroma pertenecen a muchas clases de
sustancias químicas como ácidos, ésteres, aldehídos o cetonas, entre otros. Además de estos
compuestos volátiles, en la percepción de los aromas también influye la composición del
producto y el pH, ya que afectan a la volatilidad de los ácidos orgánicos. Todos estos elementos
son los que pueden influir positiva o negativamente sobre el flavor de los productos
fermentados. Algunos de los compuestos volátiles habituales en los productos lácteos
fermentados producidos por las cepas estudiadas son: el acetaldehído, importante aroma en
yogures y quesos; el diacetilo es otro de los compuestos que contribuyen positivamente al
flavor de las leches fermentadas y está asociado con el aroma de mantequilla, este compuesto
es transformado rápidamente en acetoína. Otros compuestos relacionados con los aromas,
producidos por los lactococos y los lactobacilos pueden ser la propanona asociado con aromas
a pulpa de madera o heno o el etanol asociado con olores a seco (Thierry et al., 2016).
La Tabla 6 muestra la abundancia relativa de los diferentes compuestos volátiles detectados
después del crecimiento en la leche a 32ºC durante 48 horas.
b
Tabla 6. Abundancia relativa de compuesto volátiles medidos por cromatografía de gases seguida de
espectrometría de masas

2-
Acetaldehído Etanol Diacetilo Acetoína Ciclohexanona Ác. Acético
Propanona
Control - - - - - 1±0,0 -

3LA1 0,67±0,19 0,04±0,05 0,19±0,05 0,05±0,07 0,62±0,10 1±0,0 -

3LA10 0,71±0,04 0,27±0,04 1,22±0,06 - 0,07±0,05 1±0,0 -

3LA30 0,50±0,32 0,16±0,12 0,33±0,35 - 0,04±0,06 1±0,0 -

1//10 1,52±0,43 0,11±0,02 0,23±0,05 0,30±0,07 1,23±0,37 1±0,0 0,51±0,20

1//30 0,63±0,29 0,14±0,05 0,11±0,02 0,13±0,06 0,66±0,25 1±0,0 0,25±0,19

10//30 0,88±0,19 0,22±0,09 0,97±0,25 - 0,09±0,07 1±0,0 -

1//10//30 6,02±3,70 0,11±0,08 0,23±0,41 0,31±0,17 1,43±0,74 1±0,0 0,51±0,20

-, no se detecta.
b
Concentración referida al estándar interno (ciclohexanona 0,36 mg/mL), a la que se dio un valor de 1.

De acuerdo con los valores de la tabla podemos interpretar que la producción de

compuestos volátiles es relativamente pequeña. Estos valores, sin embargo, son normales para
la mayor parte de las especies de BAL (Smit et al., 2005). Por un lado las cepas 3LA1 y 3LA30 no
son capaces de desarrollarse apropiadamente en leche, como se ha comentado en el apartado

19
anterior. En estas condiciones no esperábamos que produjeran cantidades significativas de
ningún compuesto volátil. Sin embargo, resulta sorprendente la detección de cantidades tan
pequeña de diacetilo y/o acetoína en los cultivos aislados y co-cultivos de la cepa 3LA1, tal
como resume la Tabla 6. Es verdad que es únicamente en los cultivos y cocultivos de esta cepa
donde se detecta la presencia de estos dos odorantes. Todos los cultivos de la cepa 3LA1
muestran también una pequeña concentración de ácido acético, resultados que concuerdan de
nuevo con los del análisis de ácidos orgánicos (Tabla 5); aunque mediante la técnica de GC/MS
la cantidad detectada es sensiblemente menor a la que se detecta por HPLC. La combinación de
las tres cepas estudiadas tiene una producción de acetaldehído elevada a diferencia del resto
de las combinaciones.

4.7 PRODUCCIÓN DE AMINAS BIÓGENAS

En las condiciones de ensayo ninguna cepa produjo aminas biógenas a partir de los
aminoácidos precursores tiroxina, histidina, arginina o lisina, mientras que el control positivo
(Enterococcus fecalis V583) productor de tiramina a partir de tiroxina producía 5,20 mM. Esto
demuestra la incapacidad de las cepas procedentes de la LFN para producir estos compuestos
tóxicos. Esta capacidad, que parece estar relacionada con una mejor supervivencia en
condiciones de acidez (Linares et al., 2012), es específica de determinadas cepas de BAL;
aunque el fenotipo no está muy extendido, en las cepas de Lc. lactis y Lb. plantarum (Ladero
et al., 2015) es preciso analizarlas de manera individual para evitar la formación de aminas
biógenas en los productos lácteos fermentados.

5 DISCUSIÓN GENERAL
Las BAL juegan un papel importante en la elaboración de productos lácteos fermentados ya
que son las encargadas de provocar la fermentación de la lactosa y la concomitante bajada del
pH, debida a la producción de ácido láctico. Este proceso de acidificación aporta, además, las
características sensoriales deseables debido a que reproduce el entorno físico-químico en el
que tiene lugar la maduración de los productos lácteos y asegura la conservación del producto.
Las BAL están consideradas como bacterias seguras desde un punto de vista higiénico-sanitario,
avaladas por los sellos GRAS y QPS, definidos anteriormente (Stiles, 1996; EFSA, 2007; Alegría,
2013; FDA, 2016; Thierry et al., 2016).
El uso de los fermentos durante la producción de productos lácteos fermentados es
importante debido a que contribuyen a la estandarización de los productos e incrementan la
calidad y la seguridad alimentaria. Los fermentos de un producto tradicional concreto deberán
reproducir las características sensoriales típicas de ese producto, para lo cual sus componentes
deben de mantener las proporciones relativas durante las fases de fermentación y maduración.
El papel que juegan en la seguridad está relacionado con una de las funciones de los fermentos,
la producción de ácido láctico y la inhibición de bacterias patógenas y/o alterantes. Sobre la
calidad sensorial influyen de manera directa también gracias a la producción de compuestos

20
volátiles, y la producción de lipasas y proteasas que contribuyen a la modificación de los
constituyentes de la materia prima, influyendo en la textura y las propiedades organolépticas
finales. En este trabajo, se han estudiado tres cepas que pudieran ser consideradas un
fermento de los utilizados con la técnica “backslopping”. De igual forma, podrían utilizarse en el
mismo sentido para la elaboración de otros productos lácteos fermentados (Alegría, 2013).
Tras la caracterización de las tres cepas de lactococos y lactobacilos podemos decir que:
tanto por el papel que juegan las BAL como productoras de productos lácteos fermentados,
como el de los fermentos, compuestos fundamentalmente por BAL, es importante la
caracterización de las cepas que se utilicen de forma deliberada, tanto sea para el desarrollo de
nuevos productos lácteos fermentados como para la mejora de los ya existentes. Conocer qué
sustancias son las que produce cada bacteria y cuál es su metabolismo es interesante para
poder elegir unas cepas u otras, o combinaciones de ellas en función de las características
tecnológicas y organolépticas del producto lácteo fermentado buscadas.
Finalizando esta discusión podemos decir que las cepas estudiadas en su conjunto tienen
una buena aptitud tecnológica para formar parte de fermentos, o para constituir ellas mismas
un fermento, ya que aportan características positivas como aromas deseables y característicos
de los productos fermentados (diacetilo, acetoína), no producen aminas biógenas y no tienen
genes adquiridos de resistencias a antibióticos. Además, en estudios anteriores, se había
comprobado cómo se mantienen estables en el tiempo, de manera que entre ellas hay una
complementación funcional para desarrollarse y pervivir en el ambiente lácteo.
Estudiándolas individualmente hemos visto que la que mejor aptitud tecnológica tiene y por
lo tanto mejor capacidad para formar parte de fermentos por individual es Lc. lactis subsp.
cremoris, siendo la que mayor cantidad de ácido láctico produce, y Lc. lactis subsp. lactis, que
aunque le llevaba mayor tiempo terminaba coagulando la leche y además al pertenecer la
biovariedad de diacetylactis, utiliza el citrato produciendo aroma. Sobre Lb. plantarum
podemos decir que de forma individual no es capaz de coagular la leche, prácticamente no
consume la lactosa ni produce cantidades significativas de ácido láctico, pero probablemente,
se aproveche de las dos cepas de lactococos y por eso pueda crecer y mantenerse estable junto
con ellas. Hay posibilidades también de que algo aporte al consorcio, de manera que es
desplazada por dilución a lo largo de todos los pases que se le han dado. En estos momentos, el
grupo de investigación está abordando la secuenciación genómica de las cepas, el análisis de las
secuencias puede aportar datos en este sentido.

6 CONCLUSIONES
1) En este estudio se han caracterizado fenotípicamente tres cepas de bacterias ácido-lácticas,
aisladas de un consorcio presente en una leche fermentada natural.

21
 2) La caracterización incluyó la utilización de carbohidratos, el perfil de actividades
enzimáticas, la resistencia a antibióticos, la producción de aminas biógenas, la capacidad de
desarrollarse en leche y la producción en este medio de ácidos orgánicos y compuestos
volátiles.

3) La cepa de Lc. lactis subsp. cremoris 3LA10 es capaz de coagular la leche de forma rápida y,
seguramente, es la encargada de suministrar, mediante su actividad proteinásica, péptidos
asimilables a las otras dos cepas.

4) La cepa Lc. lactis subsp. lactis 3LA1 fermenta el citrato y aporta los componentes
aromáticos a la leche fermentada. Se desconoce por el momento el papel de la cepa de Lb.
plantarum 3AC30 en el consorcio.

5) En general, las cepas presentan buenas propiedades tecnológicas y no producen sustancias

perjudiciales ni presentan resistencias transmisibles a los antibióticos estudiados por lo que
podemos considerarlas seguras desde el punto de vista de la salud.

6) Las cepas estarían listas para poder ser transferidas al sector productor bien en su conjunto
o bien de manera individual para su empleo como fermento o como constituyentes de
fermentos.

7 AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, me gustaría agradecer al director de este trabajo el Dr. Baltasar Mayo por
brindarme la oportunidad de realizar este proyecto, así como su asesoramiento, ayuda,
persistencia y dedicación durante el desarrollo del proyecto y la escritura de la memoria.
Agradezco también la colaboración brindada por el resto del Grupo de Cultivos Lácteos
Funcionales, integrado por la Dra. Ana Belén Flórez García por sus consejos e indicaciones, y la
doctoranda Lucía Vázquez por todo su tiempo, amabilidad y hacer tan amenas las horas en el
laboratorio. A Cristóbal Fernández por el continuo intercambio de opiniones y ayuda a la hora
de redactar nuestros respectivos Trabajos de Fin de Grado. Y en general, a todo el personal del
IPLA por la colaboración brindada durante mi estancia en el mismo.

Agradezco también a mi tutor Bernardo Prieto Gutiérrez por ofrecerme la posibilidad de

poder realizar el Trabajo de Fin de Grado bajo su supervisión y su continuo interés por el
desarrollo del mismo.

22
8 BIBLIOGRAFÍA
Alegría, Á. (2013) Caracterización microbiológica de productos lácteos funcionales para el
diseño de cultivos iniciadores. Oviedo.
Alegría, Á., Delgado, S., Flórez, A. B. y Mayo, B. (2013) "Identification, typing, and functional
characterization of Leuconostoc spp. strains from traditional, starter-free cheeses", Dairy
Science & Technology, 93(6), pp. 657-673.
Alegría, Á., Fernández, M. E., Delgado, S. y Mayo, B. (2010) "Microbial characterisation and
stability of a farmhouse natural fermented milk from Spain", International Journal of Dairy
Technology. John Wiley & Sons, Ltd (10.1111), 63(3), pp. 423-430.
Alegría, Á., González, P., Delgado, S., Flórez, A. B., Hernández-Barranco, A. M., Rodríguez, A. y
Mayo, B. (2016) "Characterisation of the technological behaviour of mixtures of mesophilic
lactic acid bacteria isolated from traditional cheeses made of raw milk without added starters",
International Journal of Dairy Technology. John Wiley & Sons, Ltd (10.1111), 69(4), pp. 507-519.
Alifano, P., Palumbo, C., Pasanisi, D. y Talà, A. (2015) "Rifampicin-resistance, rpoB
polymorphism and RNA polymerase genetic engineering", Journal of Biotechnology, 202, pp.
60-77.
Canteri, G. (1997) "Les agents de transformation du lait. Les levains lactiques", en Eck, A. y Gillis,
J.-C. (eds.) Le Fromage. 3.a ed. París, pp. 175-195.
Carr, F. J., Chill, D. y Maida, N. (2002) "The lactic acid aacteria: a literature survey", Critical
Reviews in Microbiology, 28(4), pp. 281-370.
Drider, D., Bekal, S. y Prévost, H. (2004) "Genetic organization and expression of citrate
permease in lactic acid bacteria.", Genetics and molecular research : GMR, 3(2), pp. 273-81.
Early, R. (2000) "Leche y nata", en Ralph Early (ed.) Tecnología de los Productos Lácteos. 2.a ed.
Huesca: Acribia, pp. 1-50.
EFSA (2007) "Introduction of a qualified presumption of safety (QPS) approach for assessment
of selected microorganisms referred to EFSA - Opinion of the Scientific Committee", EFSA
Journal, 5(12), p. 587.
España (2018) Informe consumo alimentario. Disponible en:
https://www.mapa.gob.es/es/alimentacion/temas/consumo-y-comercializacion-y-distribucion-
alimentaria/panel-de-consumo-alimentario/ultimos-datos/ (Accedido: 4 de junio de 2019).
FAO (2010) Agricultural Biotechnologies: Agroindustria. Disponible en:
http://www.fao.org/biotech/sectoral-overviews/agro-industry/es/ (Accedido: 14 de junio de
2019).
FDA (2016) Microorganisms &amp; Microbial-Derived Ingredients Used in Food (Partial List) |
FDA. Disponible en: https://www.fda.gov/food/generally-recognized-safe-
gras/microorganisms-microbial-derived-ingredients-used-food-partial-list (Accedido: 12 de
23
junio de 2019).
Felis, G. E., Salvettu, E. y Torriani, S. (2016) "Systematics of lactic acid bacteria: current status",
en Mozzi, F., Raya, R. R., y Vignolo, G. M. (eds.) Biotechnology of Lactic Acid. 2.a ed. Hoboken:
Wiley Blackwell, pp. 25-31.
Fernández, E., Alegría, A., Delgado, S., Martín, M. C. y Mayo, B. (2011) "Comparative phenotypic
and molecular genetic profiling of wild Lactococcus lactis subsp. lactis strains of the L. lactis
subsp. lactis and L. lactis subsp. cremoris genotypes, isolated from starter-free cheeses made of
raw milk.", Applied and environmental microbiology. American Society for Microbiology, 77(15),
pp. 5324-35.
Florez, A. B. (2007) Perfiles de susceptibilidad/resistencia a antibióticos en bacterias del ácido
láctico. Caracterización molecular de genes de resistencia. Oviedo.
Hols, P., Hancy, F., Fontaine, L., Grossiord, B., Prozzi, D., Leblondbourget, N., Decaris, B., Bolotin,
A., Delorme, C., Duskoehrlich, S., Guédon, E., Monnet, V., Renault, P. y Kleerebezem, M. (2005)
"New insights in the molecular biology and physiology of revealed by comparative genomics",
FEMS Microbiology Reviews, 29(3), pp. 435-463.
Kandler, O. y Weiss, N. (1986) "Regular, nonsporing,Gram-positive rods", en Sneath, P. H. A.,
S.Mair, N., Sharpe, M. E., y Holt, J. G. (eds.) Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology. 1.a ed.
Baltimore: Williams & Wilkins, pp. 1208-1260.
Karl Heinz Schleifer (1986) "Gram-positive cocci", en Sneath, P. H. A., S.Mair, N., Sharpe, M. E., y
Holt, J. G. (eds.) Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology. 1.a ed. Baltimore: Williams &
Wilkins, pp. 999-1103.
Katla, A. K., Kruse, H., Johnsen, G. y Herikstad, H. (2001) "Antimicrobial susceptibility of starter
culture bacteria used in Norwegian dairy products.", International journal of food microbiology,
67(1-2), pp. 147-52.
Kelly, W. J., Ward, L. J. H. y Leahy, S. C. (2010) "Chromosomal diversity in Lactococcus lactis and
the origin of dairy starter cultures", Genome Biology and Evolution, 2, pp. 729-44.
Kowalczyk, M., Mayo, B., Fernández, M. y Aleksandrzk-Piekarczyk, T. (2016) "Updates
metabolism in lactic acid bacteria in light of «“omic”» technologies", en Mozzi, F., Raya, R., y
Vignolo, G. M. (eds.) Biotechnology of Lactic Acid. 2.a ed. Hoboken: Wiley Blackwell, pp. 1-24.
Ladero, V., Martín, M. C., Redruello, B., Mayo, B., Flórez, A. B., Fernández, M. y Alvarez, M. A.
(2015) "Genetic and functional analysis of biogenic amine production capacity among starter
and non-starter lactic acid bacteria isolated from artisanal cheeses", European Food Research
and Technology, 241(3), pp. 377-383.
Leroy, F. y De Vuyst, L. (2004) "Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food
fermentation industry", Trends in Food Science and Technology. Elsevier, 15(2), pp. 67-78.
Linares, D. M., del Río, B., Ladero, V., Martínez, N., Fernández, M., Martín, M. C. y Álvarez, M. A.
(2012) "Factors influencing biogenic amines accumulation in dairy products", Frontiers in
24
Microbiology, 3, p. 180.
Liu, M., Bayjanov, J. R., Renckens, B., Nauta, A. y Siezen, R. J. (2010) "The proteolytic system of
lactic acid bacteria revisited: a genomic comparison", BMC Genomics, 11(1), p. 36.
Mayo, B., Ammor, M. S., Delgado, S. y Alegría, Á. (2010) "Fermented milk products", en Tamang,
J. P. y Kailasapathy, K. (eds.) Fermented Foods and Beverages of the World. 1.a ed. Boca Raton:
CRC Press, pp. 263-288.
Mills, S., O’Sullivan, O., Hill, C., Fitgerald, G. y Ross, R. P. (2010) "The changing face of dairy
starter culture research: From genomics to economics", International Journal of Dairy
Technology, 63(2), pp. 149-170.
Ordóñez Pereda, J. A., Cambero Rodríguez, M. I., Fernández, L., Garcia, M. L., Fernando, G. G.
de, Hoz, L. de la y Selgas, M. . D. (1998) "Leches Fermentadas", en Ordóñez Pereda, J. A. (ed.)
Tecnología de los Alimentos, Volumen II, Alimentos de origen animal. Madrid: Editorial Síntesis,
pp. 90-111.
Ordóñez Pereda, J. A., Rodríguez, M. I. C., Leónides Fernández, Garcia, M. L., Hoz, L. de la y
Selgas, M. D. (2010) "Características generales de la leche y componentes fundamentales", en
Ordóñez, J. A. (ed.) Tecnología de los Alimentos, Volumen II, Alimentos de origen animal. 1.a ed.
Madrid, pp. 15-50.
Rychen, G., Aquilina, G., Azimonti, G., Bampidis, V., Bastos, M. de L., Bories, G., Chesson, A.,
Cocconcelli, P. S., Flachowsky, G., Gropp, J., Kolar, B., Kouba, M., López‐Alonso, M., López
Puente, S., Mantovani, A., Mayo, B., Ramos, F., Saarela, M., Villa, R. E., Wallace, R. J., Wester, P.,
Glandorf, B., Herman, L., Kärenlampi, S., Aguilera, J., Anguita, M., Brozzi, R. y Galobart, J. (2018)
"Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production
organisms", EFSA Journal, 16(3).
Smit, G., Smit, B. y Engels, W. (2005) "Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical
flavour profiling of cheese products", FEMS Microbiology Reviews, 29(3), pp. 591-610.
Stiles, M. E. (1996) "Biopreservation by lactic acid bacteria", Antonie van Leeuwenhoek. Kluwer
Academic Publishers, 70(2-4), pp. 331-345.
Tamang, J. P. (2010) "Diversity of Fermented Food", en Tamang, J. P. y Kailasapathy, K. (eds.)
Fermented Foods and Beverages of the World. 1.a ed. Boca Raton: CRC Press, pp. 41-83.
Thierry, A., Pogačić, T., Weber, M. y Lortal, S. (2016) "Production of flavor compounds by lactic
acid bacteria in fermented food", en Mozzi, F., Raya, R. ., y M.Vignolo, G. (eds.) Biotechnology of
Lactic Acid. 2.a ed. Hoboken: Wiley Blackwell, pp. 314-340.
Watkins, R. R. y Bonomo, R. A. (2016) "Overview: global and local impact of antibiotic
resistance", Infectious Disease Clinics of North America, 30(2), pp. 313-322.

25