UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

MATERIA:

GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

TRABAJO FINAL PCR Y SECUENCIACION

MAESTRO:

Dr. Rodolfo Bernal Reynaga

ALUMNO:

TIRADO ZAZUETA GUADALUPE

GRUPO.

3-03
Introducción

Las pruebas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) son una forma rápida y muy
precisa de diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas y cambios genéticos. Las pruebas
detectan el ADN o el ARN de un patógeno (el organismo que causa una enfermedad) o
células anormales en una muestra.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

PCR, o la reacción en cadena de la polimerasa, es una reacción química que los biólogos
moleculares utilizan para amplificar (crear copias) fragmentos de ADN. Esta reacción
permite que unos pocos fragmentos de ADN se repliquen en millones o miles de millones
de copias. La amplificación del ADN nos permite estudiar la molécula del ADN en detalle en
el laboratorio.

Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc), la

enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs:
adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora o
buffer y H2 O. Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se
compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos en donde se
realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están diseñados para
establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo
necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para
corroborar si se amplificó la secuencia blanco de interés, los productos de la PCR o
también llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la
reacción fue exitosa.
¿Cómo funciona una PCR?

Cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres

etapas principales: desnaturalización, hibridación
y extensión. A continuación explicare qué sucede
en cada una.

Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas

de ADN son calentadas y separadas a una
temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el
tiempo depende de la secuencia del templado, es
decir, si la cantidad de G-C es alta, será
necesario más tiempo para romper sus uniones
debido a que el apareamiento de estas bases
está formado por tres enlaces, uno más que las
bases de A-T.

Hibridación. En esta etapa, los primers se

alinean al extremo 3’ del templado previamente
separado e hibridan con su secuencia
complementaria. Para que se forme el complejo
templado-primers, es importante que la
temperatura de hibridación o temperatura melting
(Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila
entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el
correcto y la temperatura es la adecuada, la
estabilidad y especificidad del complejo será
eficiente.

Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa

actúa sobre el complejo templado-primers y
empieza su función catalítica a una velocidad
muy rápida; agrega dNTP’s complementarios
para crear las cadenas completas de ADN. La
extensión de las cadenas es en dirección de la
síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La
temperatura óptima para la reacción es de 72
°C, ya que a esa temperatura la enzima es
funcional. Al fi nal del ciclo, se habrán formado
los amplicones con un tamaño dictado por el
número total de pares de bases (pb) que
deberá ser conocido por el investigador
Tipos de reacción en cadena de la polimerasa:

Hoy en día existen numerosas variaciones de la reacción en cadena de la

polimerasa, según el objetivo y los requisitos que se tenga. Las más habituales
son:

PCR anidada: Variante de la PCR convencional que comprende dos rondas de

amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, con el fin de
incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Primero se realiza
una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más
extensa, que contiene el segmento diana. Después, este producto de amplificación
se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para
amplificar la región específica.
PCR in situ: Se marca una hebra sencilla de ARN o ADN denominada sonda y se
permite que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN o el ADN
presente en una muestra de tejido o de cromosomas. La sonda está marcada con
una sustancia trazadora química o radiactiva por lo que su unión puede ser
visualizada.
PCR múltiple: lo que se persigue es amplificar simultáneamente en un único tubo
distintas secuencias específicas, lo cual necesariamente implica que los reactivos
mezclados y el programa utilizado sean suficientes y adecuados para permitir la
detección de cada diana y no inhibir la de las demás. Es necesario tener en
cuenta:
RT-PCR: Dos procesos: transcripción inversa a partir de ácido ribonucleico (ARN)
sintetiza ADN complementario (ADNc), con el cual se realiza posteriormente la(s)
PCR(s) correspondiente(s). De esta forma se pueden amplificar genes que
estaban expresados en el momento del estudio.
PCR en tiempo real o cuantitativa: El principio de la técnica se basa en la PCR
punto final, sólo que la forma en cómo se detectan y analizan los productos de la
amplificación es diferente. El término en tiempo real se refiere a que la detección
de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el
término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de
ADN en la muestra. El producto de amplificación es monitoreado conforme
transcurre la reacción. El sistema garantiza de PCR en tiempo real garantiza una
alta sensibilidad, especificidad y eficiencia. Los ingredientes químicos en la PCR
en tiempo real, son los mismos utilizados en la PCR punto final, sólo que
generalmente la enzima, dNTP’s, Mg +, el buffer y el sistema reportero de
fluorescencia para detectar los productos amplificados se venden juntos en una
solución conocida como «Master mix», el agua es proporcionada por separado y
también es libre de nucleasas. Los primers deben ser diseñados especialmente
para garantizar una alta especificidad y para que generen amplicones de un
tamaño que oscile entre 100-150 pb; si éstos son más grandes, la eficiencia de la
reacción disminuye considerablemente.
PRC de células viables: Como paso previo a la amplificación del fragmento de
ADN diana, la muestra se somete a una neutralización del material genético “libre”
en la suspensión, o el procedente de células dañadas o muertas. Con este paso
inicial, los resultados de la PRC evidenciaron solamente la presencia de células
vivas presentes en nuestra muestra

Aplicaciones de la PCR:

Permite detectar un fragmento del material genético de un patógeno. Se basa en

las características de estabilidad al calor de una enzima polimerasa, que replica
material genético. Como por ejemplo unas de ellas podrían ser:

 Detección de mutaciones raras.

 Análisis de variación en el número de copias.
 Análisis de expresión genética.
 Análisis de expresión de miARN.
 Detección de microrganismos patógenos microbianos.
 Cuantificación de carga vírica.
 Biopsia líquida.
 Detección de GMO.

Secuenciación del ADN.

La secuenciación del ADN significa determinar el orden de los cuatro

componentes básicos químicos, llamados "bases", que forman la molécula de
ADN. La secuencia les informa a los científicos la clase de información genética
que se transporta en un segmento específico de ADN. Por ejemplo, los científicos
pueden usar la información de las secuencias para determinar qué tramos de ADN
contienen genes y qué tramos transportan instrucciones regulatorias, que activan
o desactivan genes. Además, y de manera muy importante, los datos de las
secuencias pueden resaltar los cambios en un gen que pueden causar
enfermedades.

En la doble hélice de ADN, las cuatro bases químicas se unen siempre con la
misma pareja para formar "pares de bases". Adenina (A) siempre forma pareja con
timina (T); citosina (C) siempre forma pareja con guanina (G). Este
emparejamiento es la base para el mecanismo mediante el que las moléculas de
ADN se copian cuando las células se dividen, y también es la base para los
métodos usados en la mayoría de los experimentos de secuenciación de ADN. El
genoma humano contiene alrededor de tres mil millones de pares de bases que
detallan las instrucciones para crear y mantener a un ser humano.
Métodos de Secuenciación:

Los métodos clásicos de secuenciación (método quimico y enzimático) comparten

etapas comunes.

Marcado: Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o

fluorescentemente
Separación: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN
marcadas cuyos tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas de
distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles
desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una
escalera de bandas cuya longitud varía en un único nucleótido.

Método químico de Maxam y Gilbert

Descrito originalmente por A. Maxam y W. Gilbert en 1977.

Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas

radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro
bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por electroforésis,
en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede
leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas.

La secuenciación Maxam-Gilbert fue el primer método ampliamente adoptado para

la secuenciación del ADN y, junto con el método dideoxi de Sanger, representa la
primera generación de métodos de secuenciación del ADN. La secuenciación
Maxam-Gilbert ya no se utiliza de forma generalizada, ya que ha sido sustituida
por los métodos de secuenciación de nueva generación
Método enzimático de Sanger
Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y
Coulson también en 1977 y se conoce como método de los terminadores de
cadena o dideoxi.

Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde)
y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde
anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato
de la enzima ADN polimerasa y que va a extender la cadena copiando de forma
complementaria el molde de ADN.
El método de secuenciación ideado por Sanger se basa en el empleo de
dideoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que
cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en
crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose.

Metagenomica

La secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS) es un enfoque

de secuenciación tipo escopeta en el que todo el ácido nucleico (ADN y ARN) de
una muestra clínica se secuencia a una profundidad muy alta, de 10 a 20 millones
de secuencias por muestra.

Ser capaz de determinar rápidamente la causa de las infecciones de los pacientes

puede informar a los médicos y orientar el tipo de tratamiento además de guiar la
selección de antibióticos. La identificación rápida y exacta de patógenos no
siempre es posible en la clínica, ya que los cultivos
tardan en crecer y las pruebas de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) requieren una idea de qué
microbio podría ser la fuente de la infección.

Secuenciar un genoma completo (todo el ADN de un

organismo) sigue siendo una tarea compleja. El
proceso requiere romper el ADN del genoma en
muchos pedazos más pequeños, secuenciar dichos
pedazos y ensamblar las secuencias en una única y
larga "secuencia consenso". Sin embargo, gracias a
nuevos métodos que se han desarrollado en las
últimas dos décadas, ahora secuenciar un genoma es
mucho más rápido y menos costoso de lo que resultó
en el Proyecto Genoma Humano.

La metagenómica persigue obtener secuencias del

genoma de los diferentes microorganismos, bacterias
en este caso, que componen una comunidad,
extrayendo y analizando su ADN de forma global. Este ADN del metagenoma
representa a todos los genomas de las bacterias que conforman la población.

Proyecto del genoma humano.

El Proyecto del genoma humano (PGH) fue un programa de investigación

colaborativo e internacional cuya meta era la del mapeo (cartografía) y
entendimiento completo de todos los genes de los seres humanos. Todos nuestros
genes juntos se conocen como nuestro "genoma".

Conocer la secuencia completa del genoma humano puede tener mucha

relevancia cuanto a los estudios de biomedicina y genética clínica, desarrollando
el conocimiento de enfermedades poco estudiadas, nuevas medicinas y
diagnósticos más fiables y rápidos. Sin embargo descubrir toda la secuencia
génica de un organismo no nos permite conocer su fenotipo. Como consecuencia,
la ciencia de la genómica no podría hacerse cargo en la actualidad de todos los
problemas éticos y sociales que ya están empezando a ser debatidos. Por eso el
PGH necesita una regulación legislativa basada en la ética.

El Proyecto Genoma Humano reveló que existen probablemente 25.000 genes

humanos. La secuencia humana completa ahora puede identificar sus
ubicaciones. El resultado del Proyecto Genoma Humano ha brindado al mundo un
recurso de información detallada acerca de la estructura, la organización y la
función del conjunto completo de genes humanos. Esta información se puede
considerar como el conjunto básico de “instrucciones” hereditarias para el
desarrollo y funcionamiento del ser humano.
Aplicaciones de la Secuenciación del ADN

1. Diagnóstico
En un futuro, la secuenciación del genoma humano permitirá realizar diagnósticos
más concretos, a largo plazo. No se trata de predecir sentencias de muerte,
asegurando con una prueba de ADN que se va a sufrir un infarto, sino de contar
con datos para ponderar el porcentaje de riesgo que se tiene de desarrollar una
enfermedad determinada.

2. Terapia génica
Con el genoma humano descifrado, cabe suponer que la terapia génica está ahora
más cerca de convertirse en una realidad científica. Por terapia génica se entiende
la sustitución o la modificación de los genes que, al estar alterados, producen
algún tipo de enfermedad.
La introducción de los genes se realiza por medio de un ‘vector’, un medio de
inocular el gen en el organismo. Un vector puede ser un virus al que se le ha
eliminado su patogenicidad, su capacidad para producir enfermedades.

3. Farmacogenética y farmacogenómica
Los fármacos que empleamos se producen en “talla” única. Sin embargo, no todos
reaccionamos de forma similar a los mismos medicamentos. Por ejemplo, en la
enfermedad de Alzheimer, los pacientes que presentan una variante genética
llamada ApoE-4 tiene menos posibilidades de beneficiarse de determinados
fármacos, que los enfermos que no presentan esta variante.

4. Comparaciones con otros genomas

Las comparaciones entre los genomas de otras especies es otra de las
aplicaciones que facilitarán el trabajo científico. Hay organismos, como la mosca
de la fruta o el ratón, que se emplean con mucha frecuencia en la
experimentación, por eso resultaría muy útil determinar las similitudes genéticas
entre estos seres y el hombre.
 Bibliografías

Default - Stanford Medicine Children’s health. (s. f.).

https://www.stanfordchildrens.org/es/topic/default?id=proyecto-genoma-humano-90-

P05231

Secuenciación del ADN (artículo) | Khan Academy. (s. f.). Khan Academy.

https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-

regulation/biotechnology/a/dna-

sequencing#:~:text=Secuenciar%20un%20genoma%20completo%20(todo,y%20larga%20

%22secuencia%20consenso%22.

Ramirez, A. (s. f.). El test PCR como herramienta de diagnóstico (1/2): principios básicos.

https://www.3tres3.com/es-mx/articulos/test-pcr-como-herramienta-de-diagnostico-1-2-

principios-basicos_14022/#img-1

Aplicaciones de la PCR Digital: QIAGEN. (s. f.). https://www.qiagen.com/es-

es/applications/digital-pcr/beginners/dpcr-vs-qpcr/dpcr-applications

Tipos de PCR usados en investigación genética: Aplicaciones donde los diferentes tipos de

PCR juegan un rol vital | GoldBio. (s. f.). https://goldbio.com/articles/article/PCR-

usados-Investigacion-Genetica

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) | NHGRI. (s. f.). Genome.gov.

https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Reaccion-en-cadena-de-la-

polimerasa#:~:text=PCR%2C%20o%20la%20reacci%C3%B3n%20en,miles%20de

%20millones%20de%20copias.