REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (polymerase chain reaction),
es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis. Su objetivo es obtener un gran nmero
de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia
de ese fragmento original, o molde.

Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms
fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar
personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la
amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, sobre todo en el mbito de la
investigacin forense, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo dicha tcnica.

Fundamento e Importancia

Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo
cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas
entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder
duplicarlas nuevamente. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente
a la Cetus Corporation en California, en la dcada de 1980. Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas
se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada
ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata
desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos
adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos,
generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas
(Taq) con otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent).

Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite
calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin.
Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los
tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que
favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi
todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin
sobre los tubos de reaccin. Los termocicladores ms antiguos carecan de este sistema y solucionaban el
problema de la condensacin con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin o con un poco
de cera dentro de los tubos. Actualmente existen algunos termocicladores que utilizan o pueden utilizar aceite
mineral en el tubo de PCR como los termocicladores de nueva generacin de flujo de are.

Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica
y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la
secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios,
la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico
de enfermedades infecciosas.
Reactivos

Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que son, cada uno, complementarios
a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos,
normalmente de dieciocho a veintids, que permiten que la polimerasa inicie la reaccin. Deben estar
enfrentados y no a mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los
nucletidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio
(MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para
mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error
durante la sntesis de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN
polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C (la ms
comn es la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que
conforman un ciclo.

Conceptos de la PCR

Sensibilidad: Se refiere a la cantidad mnima de ADN necesaria para que se produzca la amplificacin, es
decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una muestra sea
positiva, pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de
ADN.
Especificidad: Se refiere a la obtencin de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos
y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen ms de un sitio al
que se pueden unir aparecer ms de un producto amplificado. Se relaciona con los falsos positivos, ya
que puede que una muestra sea negativa, pero sea dada como positiva porque se ha amplificado una
regin de ADN no diana o que no se buscaba amplificar.
Eficiencia: se refiere a la amplificacin mxima que se puede obtener en un nmero determinado de
ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete el ADN polimerasa durante la amplificacin. Este concepto
es de especial importancia en la secuenciacin, pero en otros casos no es tan importante. Una buena
fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.

Ciclo de Amplificacin

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados
ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que
tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado
"hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto
final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad
de parmetros. Estos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y de
los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de los cebadores, as como la longitud del ADN que se desea
amplificar.2

Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opcin de realizar la reaccin de PCR con la llamada " tapa
caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicar calor a la parte de arriba del vial que contiene la
mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron
y que no incluan este sistema tenan que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este
procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensacin de la muestra, ya que en el eppendorf
se encuentran dos fases: lquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo,
calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso fsico, conservando casi intacto el
volumen de la muestra.

Inicio: Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est
usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es
necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor.

Desnaturalizacin: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales est
constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la
muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende,
por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del largo de la misma. Otros
mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos
capaces de realizar la desnaturalizacin.

Alineamiento o Unin del Cebador: A continuacin, se producir la hibridacin del cebador, es decir, el
cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la
temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los
puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la
secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la
cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin
de la molcula que va a ser amplificada.

Extensin o Elongacin de la Cadena: Acta la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la
cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo
ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los
dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-
hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso
depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad
est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto del ADN polimerasa usada
como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en
su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto.
 Elongacin Final: Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura
de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella
se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea
totalmente ampliado.

Conservacin: Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante

un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. La PCR
normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en
pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto,
se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de
ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor
medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao:
tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para
fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de
forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente,
la electroforesis capilar.3 El/los tamao/s de los productos de la PCR
vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el
cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre
en el gel junto con los productos de PCR.

Optimizacin de la PCR

Aparte de aspectos como la contaminacin y algn fallo en la hibridacin de primers, puede haber otras
complejidades que afecten a la PCR, como son:

Degradacin del ADN: Esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones subptimas o
cuando se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta en ausencia de amplificacin o resultados parciales.
Un caso particular es el "allele dropout", o bien prdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con
ser homocigtico para dicho alelo.
Inhibicin de la PCR: Puede haber agentes que interfieran en el correcto transcurso de la PCR. Requerir
un procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos compuestos del medio antes de preparar
la mezcla de PCR. Tanto la sangre como el semen contienen este tipo de inhibidores, por lo que es
necesario una purificacin previa.
Modificacin del ADN: Las sustancias como el formol (empleado en conservacin de tejidos) o la luz
ultravioleta modifican el ADN, alterando as los resultados de la amplificacin.
Artefactos: Pueden darse situaciones como las bandas "stutter" o "shadow", que consisten en que la
polimerasa amplifica una repeticin de ms de un microsatlite o repeticin en tndem.
Alelo Fuera de Patrn: Un alelo amplificado puede no coincidir con el patrn de picos de la referencia.
Esto es seal de que algo ha ido mal durante la PCR.
Mezclas: Es posible que dos muestras se mezclen de alguna forma y el resultado sea una combinacin del
patrn de picos que cabe esperar tras la amplificacin de cada una de ellas por separado. Esto y el caso
anterior dificulta la interpretacin de los resultados.