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1- Objetivos
2- Introducción
Definición e importancia.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada por el grupo de Kary Mullis
de Cetus-Perkin- Elmer en 1985.
El primer experimento de Mullis y colaboradores, publicado en
Science en 1985 fue planeado para desarrollar un método de diagnóstico que no insumiera
más de 24 hs para la detección de la hemoglobinopatia de eritrocitos falciformes ("sickle
cellanemia"). En esta anemia la cadena de la globina está mutada a nivel de la segunda
base del séptimo codón de lo que resulta un cambio de glutámico (cadena PA normal) por
valina (cadena s patológica). A nivel del gen esto hace desaparecer un sitio Dde pero no
afecta a otro sitio Hinf contiguo.
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Ventajas y usos.
Fundamentos
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Cebadores. Los primers o cebadores son secuencias cortas de ADN de 20 a 30 bases que
se obtienen por síntesis; la secuencia de los mismos se diseña de acuerdo al fragmento de
ADN que se desea amplificar. Se debe tener una concentración de 0.2-1.0 M c/u, en
muchísimo exceso molar respecto del templado (relación primer/target: inicial: 108 y final:
10 aproximadamente. En el diseño de los primers es necesario tener en cuenta algunas
consideraciones:
- Deben ser específicos, especialmente en el extremo 3´.
- Las bases que lo componen deben tener una distribución homogénea a lo largo de la
secuencia, evitando regiones ricas en polipurinas, polipirimidinas u otras secuencias poco
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comunes. Se debe tratar en lo posible que el contenido de CG sea similar al del fragmento a
amplificar.
- Diseñar "primers" con el Tm más alto posible, 55 a 80 C y similares entre los
primers.
- Los primers no deben estar distanciados por mas de 3 kbp.
- Se debería evitar la presencia de secuencias que permitan la formación de
estructuras secundarias, particularmente en el extremo 3 del primer .
- Es muy conveniente controlar que no existan regiones de complementariedad entre
los primers (uno con otro) evitando que el par de cebadores posean extremos 3 solapados,
ya que podrían dar lugar a un artefacto de amplificación llamado dímero de primers. Estos
dímeros aparecerán como producto de la reacción de PCR especialmente cuando se hacen
muchos ciclos de amplificación sobre una muestra que tiene pocas copias iniciales del
material a amplificar. Un dímero de este tipo es un fragmento de ADN cuya longitud es
muy próxima a la suma de los dos primer y su formación ocurriría cuando un primer es
“extendido” por la polimerasa sobre el otro primer. La concatenación resultante es un
molde extremadamente eficiente que puede , si es que ocurre en un ciclo temprano,
fácilmente volverse el producto predominante de la reacción. Existen programas de
computación que facilitan el diseño de los primers.
dNTPs. Son necesarios para la formación del nuevo ADN amplificado. 0.2 mM c/u (0,8
mM en total), corresponden a aproximadamente a 1016 moléculas de dNTPs. Cuando se
amplifican productos largos se aumenta también la concentración de dNTPs. También se
puede reemplazar un dNTP por algún nucleótido modificado. Ej: ddNTP, bases
modificadas, adición de biotina, fluorocromos, etc.
Mg2+. Afecta la unión del primer, el Tm del templado, la especificidad del producto
(que los primers se unan únicamente a la secuencia de interés), la actividad de la enzima y
su fidelidad. Junto con la temperatura es uno de los parámetros a manipular. Usualmente se
ensayan concentraciones, entre 0.5 y 5.0 mM.
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Si los primers tienen una complementariedad perfecta con el templado se usa 55 C para
(C+G) < 50% o 60 C para (C+G) > 50%. Si no la tienen por ignorarse detalles de las
secuencia del primer, hay que hacer pruebas variando la temperatura entre 35 y 65 C,
hasta la obtención de un único producto con la longitud deseada.
Este último caso es el de la mezcla de oligonucleótidos “degenerados” donde la referencia
que se tiene del templado es sobre la secuencia de aminoácidos de la proteína y no de la
secuencia de bases del gen o mRNA.
En otros casos se introducen a propósito en los primers zonas sin homología; por ejemplo
cuando se trata de introducir una mutación o bien un sitio de restricción. Cuando esto
ocurre, la zona no homóloga debe estar en el lado 5´ del primer; caso contrario puede no
haber extensión.
Como vemos, son varios los parámetros a tener en cuenta en una reacción de PCR y
muchas veces puede ocurrir que una región particular del ADN presente dificultad en ser
amplificada por esta técnica. Este es el caso de aquellas regiones de ADN ricas en CG o
aquellas que forman estructuras secundarias; en estos casos se puede incluir en la mezcla
de reacción un aditivo que incremente el rendimiento y la especificidad. Los aditivos más
usados son dimetilsulfóxido (DMSO), la N,N,N-trimetilglicina (betaína) y la formamida,
también se utilizan el glicerol, detergentes no iónicos, polietilenglicol, albúmina sérica
bovina.
Tipos de PCR.
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El material de partida es ARN, pero como la PCR utiliza una ADN polimerasa, es necesario
hacer previamente una copia del ARN a ADNc; esto se consigue haciendo en una primera
etapa una transcripción reversa del ARN total o el ARNm a ADNc con una transcriptasa
reversa; el ADNc obtenido es el sustrato en la reacción de PCR usando cebadores
específicos.
Está basado en la utilización de “primers” con secuencias seleccionadas al azar. Se usa para
la detección de polimorfismos genéticos en ausencia de información sobre secuencias de
bases. El esquema de fragmentos amplificados con esta técnica es trnsmitido
mendelianamente de padres a hijos y sirve para caracterizar especies de indviduos y
eventualmente para construir mapas genéticos. El método se denomina “Random Amplified
Polymorphic DNA” y se realiza con primers de 10 nucleótidos y la renaturalización se debe
efectuar a 36C.
5. RNA display.
El método fue descripto por el grupo de Pardee (1991). Se basa en la utilización de primers
con secuencias seleccionadas al azar para detectar mRNAs específicos de un estadío celular
mediante RT- PCR. La renaturalización se debe efectuar a 40C. Un ejemplo de los primers
que se utilizan es:
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Es una metodologia que permite medir en tiempo real la formacion de un producto de PCR.
Utiliza un fluorometro adosado a un equipo convencional de PCR y tubos de calidad optica.
Se basa en el uso de un oligonucleotido que contiene un fluorocromo y un quencher. La
proximidad de estos dos elementos bloquea la fluorscencia. Cuando estos dos elementos se
separan en el transcurso de la amplificacion, aumenta la emision de fluorescencia.
Las desventajas que presenta incluyen la necesidad de una optimizacion perfecta, no se
puede asegurar la especificidad de la reaccion, complica el uso de controles internos, y
elevado costo.
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A- 3‟ RACE-PCR utiliza un primer antisense que empieza con una secuencia específica 5‟,
generalmente de más de 15 nucleótidos, que se incorpora en el transcripto de cDNA en el
paso donde interviene la transcriptasa reversa. Un primer sense interno se utiliza para
generar un segunda cadena corta que termina en una secuencia complementaria a la
secuencia original de anclaje. Después, la PCR se inicia utilizando el primer sense interno y
el primer de anclaje.
B- 5‟ RACE-PCR. Aquí un primer antisense interno se utiliza para preparar la síntesis del
templado de una cadena parcial de cDNA. Una cola de poly(dA) se añade al extremo 3‟del
cDNA usando una transferasa terminal. La síntesis de la segunda cadena se prepara
utilizando un primer sense con una secuencia de extensión específica (el ancla). Esta
cadena se utiliza como templado para un paso adicional de la síntesis que utiliza el primer
interno para producir una copia complementaria de la sucesión de anclaje. La PCR,
entonces, se puede realizar utilizando los primers interno y de anclaje
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8. PCR mutagénica
La PCR también puede ser utilizada para introducir mutaciones en sitios específicos.
Mutagénesis 5‟: (A) Los primers son modificados en el extremo 5‟, por lo que se pueden
introducir, por ejemplo, secuencias marcadas, secuencias que contengan un sitio de
restricción o un promotor que dirija la expresión.
Mutagénesis específica de sitio: (B) En este caso, la mutación ocurre en una zona
localizada en el centro del amplicón. Se llevan a cabo dos reacciones de PCR, A y B, que
amplifican segmentos superpuestos que contienen la mutación introducida a propósito, al
modificar los primers internos de la secuencia original. Luego los dos productos son
combinados mediante otra PCR.
Mutagénesis por unión incorrecta: En este caso el primer es solo parcialmente
complementario a la secuencia original.
Aplicaciones de la PCR.
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La técnica del PCR permite no solo determinar la presencia del virus en sangre sino
también la carga viral.
Puesto que la PCR solo puede amplificar ADN, el ARN del HIV-1 debe ser transcripto a
ADNc mediante una transcriptasa reversa (RT-PCR). El ARN del HIV-1 se extrae del
plasma usando agentes caotrópicos como el tiocianato de guanidina, que inactiva a las
RNAsas , luego se precipita con isopropanol y se solubiliza el pellet en agua y se coloca en
un tubo de micro centrífuga junto a los otros componentes de la reacción, para amplificar
una secuencia de 142-bases del gen gag.
Los primeros utilizados poseen 25 a 30 bases de longitud, hibridan por fuera de las regiones
de la secuencia del gen gag a amplificar. En la mezcla de reacción se coloca además
cantidades conocidas de un estándar interno que es una molécula de ARN sintético idéntico
al ARN viral a amplificar con la diferencia que posee una delección (ARN competidor); la
presencia de este estándar permite la cuantificación del virus en la muestra problema.
Luego que los ciclos de PCR han terminado, los productos de amplificación se separan por
electroforesis en un gel teñido con bromuro de etidio. Se determina la intensidad de la
banda de 142 pares de bases del ARN del HIV-1 y la intensidad de la banda del producto de
amplificación del estándar interno (que tiene una talla menor). La relación de intensidades
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de ambos fragmento permite realizar un cálculo del número de copias del ARN del HIV-1
en la muestra original.
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número de veces que se encuentran presentes ciertos segmentos de ADN, los que
constituyen unidades de repetición. Tal propiedad valió para que se las denominará
Repeticiones en Tándem de Número Variable (VNTR).
Visualización de ADN
ELECTROFORESIS
FUNDAMENTOS
Entre los soportes más comunes están: papel, acetato de celulosa, agarosa y poliacrilamida.
Estos soportes afectan la movilidad de las moléculas cargadas de manera diferente, ya que
pueden absorber moléculas al medio de soporte (tales como los grupos hidroxilos del papel
de celulosa) o reducir el movimiento mediante un tamiz de poros moleculares como en el
caso del PAGE. La migración de partículas cargadas en un gel, presenta un alto coeficiente
de rozamiento. Este tipo de medio no sólo previene la convección y minimiza la difusión
sino que participa activamente en la separación de las moléculas haciendo intervenir en
forma importante el criterio de dimensión ya que ejercen un efecto de filtración molecular.
Este efecto de tamiz es función de la dimensión de los poros del gel, lo que depende de la
concentración del gel.
Cualquier matriz que el operador elija es importante que sea eléctricamente neutra ya que la
presencia de grupos cargados en dicho soporte produce un fenómeno de electroósmosis que
disminuye el poder resolutivo de esta técnica. Los soportes más comunes para la
electroforesis en gel son los de agarosa y poliacrilamida. Los primeros dan un tamaño de
poros más grande y su utilización permite la separación de grandes moléculas mientras que
con geles de poliacrilamida se logran poros de pequeño tamaño, haciendo posible la
separación de pequeñas macromoléculas.
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Es un método estándar usado para analizar moléculas de ADN de más de 200 pares de base
(pb). La electroforesis en gel de agarosa fue desarrollada primariamente en plataformas
horizontales. Los geles horizontales se preparan colocando la agarosa fundida en un molde,
cerca del extremo se coloca un peine para formar los pocillos. Una vez que la agarosa ha
solidificado, el peine es removido. El método más común para la electroforesis del ADN es
el método submarino en el cual el buffer cubre el gel. Se utilizan buffers neutros o
alcalinos. Ej: TAE. Éste contiene EDTA que es un agente quelante de cationes divalentes,
que son requeridos por las DNasas y así se previene la degradación de la muestra de gel.
La agarosa actúa como tamiz molecular, por lo tanto la conformación del ADN afecta su
migración y separación durante la electroforesis. El ADN posee tres conformaciones
normales: superenrrollado, relajado (circular abierto) y lineal. Generalmente el ADN
superenrrollado corre más rápido que el ADN lineal, y éste corre más rápido que el ADN
relajado.
Cuando el análisis del ADN es cuantitativo, es muy importante que las bandas puedan
resolverse y verse claramente. La resolución depende de muchos factores: tamaño y forma
del pocillo, tamaño de los fragmentos de ADN, concentración de agarosa y voltaje usado.
La intensidad del campo también determina la velocidad de migración del ADN. Un
gradiente de altos voltajes conduce a una pobre resolución debido a que los fragmentos
tienden a atravesar el gel como una masa compacta. El uso de voltajes bajos puede producir
la difusión del ADN de la banda, reduciendo así la resolución.
PROTOCOLO CORRIDA ELECTROFORÉTICA EN GEL DE AGAROSA.
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2- Realizar el calculo necesario para preparar un gel de agarosa 0,8 %(25 ml).
3- Pesar la agarosa. Diluir con TAE 1x hasta 25 ml y calentar hasta disolución.
4- Dejar enfriar 10 minutos y verter solución de agarosa.
5- Dejar solidificar y cubrir el gel con TAE 1x.
COMPOSICIÓN QUÍMICA.
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Reactivos y soluciones
1. 10X TBE buffer ( 0.04 M Tris-borato, 0.001 M EDTA, pH 8.0)
2. 40% acrilamida: bis {19:1) y TEMED o:Acryl-a-Mix Solution (6%)
3. 0.5 % ácido acético en 95% de etanol.
4. Azul de bromofenol: 1mg/ml en H20 bidestilada.
5. Solución de persulfato de amonio: persulfato de amonio 10% en H20 bidestilada.
6. TEMED
Procedimiento
- Se preparan los soportes planos.
- Se preparan las soluciones del gel separador. Se cargan los soportes con la solución
de acrilamida-bisacrilamida.
- Se agrega agua en el borde superior, se deja gelificar.
- Se preparan las soluciones del gel concentrador. Se agrega sobre el primer gel,
previo secado del agua. Se deja gelificar.
- Se preparan las muestras para la corrida, diluyendo en cantidad suficiente del buffer
de preparación de muestras, se calienta a baño maría a 100º C durante un minuto y
medio.
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Este protocolo describe el uso del DNA Silver Staining System de Promega. Un sistema
contiene suficiente reactivo para teñir 10 medidas de gel e incluye: ,
Reactivos no provistos:
. Solución fix/stop,
. Solución de manchado
. Solución reveladora
Procedimiento
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3- Actividades prácticas
Materiales:
o Buffer STR
o DNA polimerasa
o Primers: pcoA1- pcoA2
o ADN
o Agua bidestilada estéril
o Micropipetas – Tips – Tubos de PCR – Termociclador.
o Agarosa – Cuba de electroforesis – Marcador de PM 1kb
o Bromuro de etidio - Analizador de imagenes
Metodología
1. Preparar la mezcla de reaccion (volumen final 25 ul)
95ºC 5‟
95ºC 90‟‟
57ºC 90‟‟ 35 ciclos
72ºC 2‟
72ºC 7‟
4ºC inf
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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1- Objetivos
• Que el alumno comprenda la importancia del uso de los vectores de clonado para la
tecnología del ADN recombinante.
• Que el alumno conozca las aplicaciones y usos de los vectores de clonado.
• Que el alumno adquiera destrezas conducentes a la manipulación de vectores de
clonado en el laboratorio.
• Que el alumno pueda interpretar los resultados obtenidos en relación al objetivo del
experimento planteado.
2- Introducción
La tecnología del ADN recombinante constituye una suma de técnicas siendo las más
importantes:
La rotura específica del ADN mediante nucleasas de restricción, que facilita el
aislamiento y la manipulación de los genes individuales.
La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de
ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos
que codifica.
La hibridación de los ácidos nucleicos que hace posible localizar secuencias
determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas
de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos.
La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de
ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (vectores de clonado y
expresión) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de
ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas.
La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN
produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a
células u organismos.
VECTORES DE CLONADO
Un Vector es un agente que lleva un fragmento de ADN foráneo a una célula huésped. Si
se lo utiliza con el fin de reproducir el fragmento de ADN, se llama vector de clonado. Si
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se usa para expresar un gen de interés, se llama vector de expresión. Los vectores
comúnmente utilizados son plásmidos, fago Lambda, cósmidos y cromosoma artificial de
levadura (YAC).
Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética como vectores de clonado por la facilidad
con la que se manipulan.
Un vector plasmídico se fabrica a partir de plásmidos naturales cuyos segmentos
innecesarios son eliminados, agregándose en cambio secuencias esenciales. Para clonar una
muestra de la ADN, se debe utilizar la misma enzima de restricción para cortar el vector y
la muestra de ADN. Por lo tanto, un vector contiene generalmente una secuencia
(polylinker) que pueda reconocer varias enzimas de restricción para poder utilizar el vector
para clonar diversos fragmentos de ADN.
PLÁSMIDOS.
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En cuanto al tamaño, existe una amplia gama: desde plásmidos muy pequeños (de unas 2
kb) hasta plásmidos muy grandes (ciertos plásmidos de Pseudomonas tienen 500 kb).
Incluso existen “megaplásmidos” en ciertos Rhizobium que llegan a tener 1600 kb.
Cada tipo de plásmido tiene un número medio de copias por célula característico. Por
regla general, los grandes plásmidos tienen una o dos copias por célula (plásmidos con
control estricto de la replicación), mientras que los pequeños suelen estar presentes como
varias copias (>10), denominándose plásmidos de control relajado.
En función de que los plásmidos sean o no transmisibles de una bacteria a otra por medio
de contactos intercelulares, se pueden distinguir:
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Los plásmidos no suelen determinar productos esenciales para el crecimiento (por eso son
dispensables), pero en la naturaleza parece que resultan favorecidas las bacterias con algún
plásmido, quizá porque acarrean ventajas selectivas en determinados ambientes o en
determinadas condiciones. Existe una variedad de fenotipos y funciones determinados
por plásmidos:
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Hay plásmidos que, aunque se pueden evidenciar por métodos físicos (p. ej., electroforesis),
no se ha podido demostrar que determinen ningún rasgo fenotípico: tales plásmidos se
califican como crípticos, constituyendo un ejemplo de “ADN egoísta” (sólo se mantienen
por su capacidad de replicación, sin necesidad de aportar ventaja selectiva clara a la
bacteria que los alberga).
REPLICACIÓN
Modelo de replicación en σ (sigma), o modelo del círculo rodante: una de las dos
cadenas es rota a nivel de oriV, de modo que el extremo 3‟ suministra el cebador
para la replicación de la “cadena adelantada”. La cadena desplazada (cadena
“menos”) funciona como cadena retrasada (“lagging”) y debe ser replicada a partir
de sitios de cebado especiales. Este tipo de replicación es frecuente en plásmidos de
bacterias Gram-positivas.
La regulación del número medio de copias de cada plásmido en cada bacteria es una
propiedad característica dependiente de cómo se controla el inicio de replicación, siendo
diferentes los mecanismos en los plásmidos de alto número de copias (con control relajado)
y en los plásmidos de bajo número de copias (de control estricto).
En general, los plásmidos de control relajado tienen mecanismos que inhiben el inicio de
replicación sólo cuando el número de copias ha llegado a un cierto nivel.
En cambio, los plásmidos de control estricto tienen mecanismos que logran que sólo se
repliquen una vez o un pequeño número de veces en cada ciclo celular.
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Muchos plásmidos poseen sistemas de reparto (= partición), que tienden a asegurar que una
vez que el plásmido ha sido replicado, cada una de las células hijas va a recibir al menos
una copia. A falta de un tal sistema, y si el reparto fuera aleatorio, de vez en cuando, las
propias fluctuaciones de la segregación aleatoria harían que parte de la progenie no
recibiera una copia, con lo que quedaría curada de ese plásmido.
El reparto de las copias a las células hijas se suele deber a las llamadas funciones par, que
están cerca de los genes rep y de la zona ori. Se trata de cortas secuencias de ADN que de
alguna manera aún no aclarada, debe unirse a alguna zona de la membrana de la bacteria
que se duplica durante la división celular, de modo que cada copia, unida a una de esas
zonas, se segrega a una célula hija.
Cada plásmido, dentro de la amplia diversidad de los que se conocen, se suele clasificar
según el grupo de incompatibilidad al que pertenece (los grupos de incompatibilidad se
suelen denominar con las siglas Inc seguidas de una letra mayúscula (por ejemplo IncP,
IncFII, etc.). Se dice que dos plásmidos son incompatibles cuando no pueden coexistir
establemente en la misma bacteria en ausencia de una presión selectiva permanente. Grupo
de incompatibilidad es el conjunto de plásmidos incompatibles entre sí. La
incompatibilidad depende del hecho de que los distintos miembros de un mismo grupo
poseen el mismo tipo de sistema de control del número de copias y de reparto de dichas
copias a las células hijas. En cada célula con dos plásmidos distintos del mismo grupo de
incompatibilidad, el número total de copias nA+nB = N (determinado por el sistema de
control) no varía, pero por fluctuaciones aleatorias en el reparto, algunas células heredan
más copias de uno de los plásmidos que del otro, y tras varias generaciones aparecen
células carentes de uno o del otro plásmido (nA = 0 y nB = N, o viceversa).
BACTERIÓFAGOS
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CÓSMIDOS
Los cósmidos surgen de una combinación de vectores plasmídicos con fragmentos de ADN
derivados del genoma del fago lambda que poseen un borde cohesivo (extremos cos). Estos
extremos permiten que el ADN se circularice y asemeje un plásmido con capacidad de
empaquetar fragmentos largos de ADN en el interior de un fago (hasta 45 kb). Otra ventaja
lo constituye su alta eficiencia de transformación.
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YACs
Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son vectores capaces de llevar largos
fragmentos de DNA (hasta 2 Mb) pero su eficiencia de transformación es muy baja.
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Una vez ligado el ADN de interés con el vector se transforman células de levadura para
obtener un gran número de copias.
MARCADORES
Los vectores de clonado deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven
para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como
marcadores:
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3- Actividades prácticas
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1- Objetivos
• Que el alumno comprenda los conceptos teóricos y prácticos que son área de
estudio de la bioinformática.
• Que el alumno comprenda la importancia de esta disciplina en la labor del biólogo
contemporáneo.
• Que el alumno conozca las aplicaciones de esta disciplina en las ciencias biológicas.
• Que el alumno sea capaz de manejar bases de datos disponibles on line.
• Que el alumno conozca y tenga un manejo básico de los distintos tipos de
programas bioinformáticos disponibles on line.
2- Introducción
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Las aplicaciones de las técnicas bioinformáticas son múltiples pero se pueden citar
algunos ejemplos:
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#!
http://www.fasta.genome.ad.jp/
http://www.ebi.ac.uk/embl/
http://147.47.212.35:8080/index.jsp
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/
http://www.toulouse.intra.fr/multalin.html
http://dot.imagen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/multi-align.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html
http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#!
http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primers/primers3_www.cgi
http://insilico.ehu.es/
http://expasy.cbr.nrc.ca/tools/dna.html
http://www2.ebi.ac.uk/translate/
http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#!
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi
http://www.smart.embl.heidelberg.de/
http://www.expasy.ch/
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3- Actividades prácticas
En este primera actividad, vamos a buscar la secuencia de ADN que codifica para el ARNr
16S de una bacteria en la base de datos NCBI y la vamos a comparar utilizando el
algoritmo BLAST con las secuencias cercanas para construir un árbol filogenético.
Todas las bases de datos del NCBI están disponibles en línea de manera gratuita, y son
accesibles usando el buscador Entrez. El NCBI ofrece además algunas herramientas
bioinformáticas para el análisis de secuencias de ADN, ARN y proteínas, siendo BLAST
una de las más usadas.
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Ingresa a http://www.ncbi.nlm.nih.gov
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Dentro de esa página, elige la opción “nucleotide blast” (compara nuestra secuencia de
ADN con otras secuencias de ADN en la base de datos).
Pegar la secuencia en el casillero vacío y poner las opciones “others” y “highly similar
sequences”, luego pinche en “blast” como se indica:
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Obtendrás un archivo con las secuencias en formato FASTA (este formato permite trabajar
con las secuencias en todos los programas bioinformáticos). Guárdalo para la siguiente
actividad.
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TGAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCGCG
TAATGGCGGGGACTCGCGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGA
CGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCTGGTACA
GAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGTGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATC
GCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACG
CTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGT
AACACCCGAAGCCCATGGCCCAACCCCGCTTGCGGGGAGGGAGTGGTCGAAGGTGGG
ACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTA
Un árbol filogenético es un árbol que muestra las relaciones evolutivas entre varias
especies u otras entidades que se cree que tienen una ascendencia común.
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Cada uno de estos métodos tiene sus fortalezas y sus debilidades, pero es más
ampliamente usado NJ, ya que ha probado ser bastante eficaz.
Una vez construidos, los árboles pueden visualizarse como enraizados (tomando
una de las OTUs como referencia o outgroup) o no enraizados.
Filograma: contiene información adicional dada por la longitud de las ramas. Los
números asociados con cada rama corresponden a un atributo de las secuencias, tal
como cantidad de cambio evolutivo. Es aditivo. Métricos.
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Dendrograma: tipo especial de árbol aditivo en el cual los extremos del árbol son
equidistantes de la raíz y son proporcionales al tiempo de divergencia.
Ultramétricos.
El test más simple para probar si el conjunto de datos “soportan” el árbol obtenido
es el del bootstrap.
Es un método estadístico que puede estimar las distribuciones por creación repetida
y análisis de conjuntos de datos artificiales.
Una forma de medir el error de muestreo es tomar muchas muestras de la población
estudiada y compararlas. Bootstrap simula esto pero en lugar de muestrear de una
población “remuestrea” los datos originando pseudorréplicas. Por ejemplo, un
boostrap de 100 implica que el árbol se construyó 100 veces, para determinar si
estadísticamente la constitución final del árbol fue la acertada.
Ingresa a http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/
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Ahora debes ir a la opción Philogeny, y dentro de esa opción debes subir tu archivo de
alineamiento que guardaste anteriormente, luego presiona el botón rojo “Submit”, lo cual te
permitirá construir el árbol filogenético. Por default, utilizamos el método de NJ para
construir el árbol.
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Obtendras el siguiente árbol, donde se pueden observar las relaciones de parentezco del
organismo problema en relación a otros organismos que existen en la base de datos.
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Tomando una secuencia de proteínas, podemos llevarla a la base de datos para compararla e
identificar la función de la misma. La secuencia de aminoácidos de la proteína X es la
siguiente (el docente se la facilitará via electrónica en formato fasta):
>Proteína X
TAAYQIEGAYNEDGRGMSIWDTFAHTPGKVKNGDNGNVACDSYHRVEEDVQLLK
DLGVKVYRFSISWPRVLPQGTGEVNRAGLDYYHRLVDELLANGIEPFCTLYHWDL
PQALQDQGGWGSRITIDAFAEYAELMFKELGGKIKQWITFNEPWCMAFLSNYLGV
HAPGNKDLQLAIDVSHHLLVAHGRAVTLFRELGISGEIGIAPNTSWAVPYRRTKED
MEACLRVNGWSGDWYLDPIYFGEYPKFMLDWYENLGYKPPIVDGDMELIHQPIDF
IGINYYTSSMNRYNPGEAGGMLSSEAISMGAPKTDIGWEIYAEGLYDLLRYTADKY
GNPTLYITENGACYNDGLSLDGRIHDQRRIDYLAMHLIQASRAIEDGINLKGYMEW
SLMDNFEWAEGYGMRFGLVHVDYDTLVRTPK
LOCUS __________________________________________________
DEFINITION _____________________________________________
ACCESSION ______________________________________________
VERSION ________________________________________________
KEDWORDS _______________________________________________
SOURCE _________________________________________________
ORGANISM _____________________________________________
REFERENCE ______________________________________________
AUTHORS ______________________________________________
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TITLE ________________________________________________
JOURNAL _______________________________________________
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4. Seleccionar gene
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gggccagaaggcgctggactacatcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagaaggcctga
>S. flavogriseus
atgctttcccgcctgtttgcccccaaggtgaaggtcagcgcccactgcgacctgccctgcggcgtgtacgacccggcccagg
cccgcatcgaggccgagtccgtcaaggccgtccaggagaagtaccaggccaatgaggacgcggacttccgcacccgcgc
cgttctgatcaaggaacagcgtgccgagctcgcgaagcaccacgtctcggtgctctggagcgactacttcaagcccccgcac
ttcgagaagtacccggagctgcaccagctggtcaacgacaccctgaaggcgctctccgcggccaagggctcgaacgaccc
ggccacgggccagaaggctctggacctgatcgcccagatcgacacgatcttctgggagaccaagaaggcctga
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12. Ir a Primer/Design PCR Primers for DNA y seguir los pasos indicados en las
pantallas siguientes:
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13. Evaluar las características de los pares de primers generados por el programa.
a. Copiar la secuencia del primer cebador, ir a Primer/Load primer/ From input
y pegar la secuencia.
b. Ir a Primer/Self complementary. Analizar.
c. Ir a Primer/Two primer complentarity/Second primer from input y pegar el
segundo primer. Analizar.
d. Para este primer repetir el punto b
e. Repetir para todos los pares de primers obtenidos.
f. Seleccionar el par de primer más adecuado.
Para saber si los oligos diseñados permiten amplificar la secuencia de interés, tienes que
realizar una PCR in silico (virtual, utilizando herramientas bioinformáticas) utilizando el
genoma disponible del organismo similar al modelo que tienes. Para ello, debes ingresar en
http://insilico.ehu.es/PCR/
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Luego de apretar el botón “Amplify” te aparecerá una nueva ventana, contesta las
siguientes preguntas:
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1- Objetivos
2- Introducción
SECUENCIACIÓN
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tarde, el genoma diploide de una sola persona (J. Craig Venter) fue leído mediante
secuenciación de genomas completos por perdigonazos (del inglés, “wholegenome shotgun
sequencing”), necesitando 10 años y 70 millones de dólares, usando la tecnología
optimizada de Sanger. Por su parte, el genoma de Watson fue secuenciado en sólo dos
meses y un costo de un millón de dólares, usando la maquina “454 Life Sciences”.
Otro ejemplo es la secuenciación del genoma del “ornitorrinco” ( Ornithorhynchus
anatinus), revelando marcas únicas de su evolución, con genes que aparecen en reptiles, o
aves y otros de mamíferos. Esta mezcla fascinante de características en el genoma del
“ornitorrinco” proporciona pistas sobre el rol y la evolución de los genomas de los
mamíferos.
La tercera generación (también llamada “next-next-generation”) de la secuenciación de
ADN ha sido producida en 2008, con químicas revolucionarias de una sola molécula:
1) El secuenciador HeliScope de molécula única (del inglés, “HeliScope Single Molecule
Sequencer”), de Helicos BioSciences <http://www.helicosbio.com>, fue anunciado este
año. Ofrece lecturas muy precisas de 25 a 45 bases para miles de millones (millardos) de
cadenas en un solo experimento (produciendo más que 2 Gb de datos de secuenciación por
día), y hasta un millardo de bases por hora en el futuro
<http://www.helicosbio.com/Portals/0/Vid eos/tSM S-How_It_Works.flv> Ello es debido
al uso de la verdadera secuenciación de molécula única (del inglés, “true Single Molecule
Sequencing” (tSMS), para leer hebras individuales de ADN.
2) “VisiGen Biotechnologies” <http://visigenbio.com> no ha sido producido todavía, pero
promete micromatrices masivamente paralelas (del inglés, “microarrays”) de
nanomáquinas, con una tasa de secuenciación de un Mb/s/maquina (más de 86 Gb de
secuencia de datos por día)
<http://visigenbio.com/flash/stream/visigen_movie_6mb.swf>, leyendo también moléculas
simples.
Estos avances permitirán reducir el precio de la secuenciación de uno a dos órdenes de
magnitud, lo cual propiciará el desarrollo del “la genómica personal”: hacer la
secuenciación de todo el genoma humano de cualquier persona en menos de un día, por
1.000 dólares o menos.
Por otra parte, la tercera generación de métodos de secuenciación es tan poderosa que
permite hacer estudios no solamente de genómica estructural, sino también de genómica
funcional y consenso de secuencias, incluyendo : i) ChIP-Seq, que está basado en la
inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), para mapear in vivo las secuencias del ADN
ocupadas por proteínas de unión al ADN; ii) Sec-ARNm (del inglés, “mRNA-Seq”), para
estudiar la expresión de genes; y iii) Sec-Metil (del inglés, “Methyl-Seq”), para analizar los
patrones de metilación. Estos procedimientos se pueden aplicar también al ADN antiguo,
siempre que ADN, ADN-proteína o ARNm pueda ser aislado de tales muestras.
GENÓMICA
Un genoma es el conjunto de secuencias de ADN que caracterizan a un individuo. Por
extensión a las secuencias de ADN características de una especie se les conoce igualmente
como genoma.
La secuenciación del genoma, es un proceso de laboratorio que determina la secuencia el
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total del ADN del genoma de un organismo de una sola vez. Esto implica la secuenciación
de todo el ADN cromosómico, así como el ADN contenido en la mitocondria y, en el caso
de las plantas, en el cloroplasto del organismo. Casi cualquier muestra biológica, incluso
una cantidad muy pequeña de ADN o de ADN antiguo, puede proporcionar el material
genético necesario para la secuenciación del genoma completo. Las muestras podrán
incluir la saliva, células epiteliales, médula ósea, el pelo (siempre y cuando el pelo
contiene un folículo del pelo), semillas, hojas de plantas, o cualquier otra parte con
células que contienen ADN. Debido a que la secuencia de datos que se produce puede ser
muy grande (por ejemplo, hay aproximadamente seis mil millones de pares de bases en
cada genoma diploide humano), los datos genómicos se almacenan electrónicamente y
requieren una gran cantidad de potencia informática y capacidad de almacenamiento. Es
por ello que la secuenciación del genoma completo habría sido casi imposible antes de la
llegada de los microprocesadores, los ordenadores y la era de la información.
A diferencia de la genética clásica que a partir de un fenotipo, generalmente por un
mutante, busca el o los genes responsables de dicho fenotipo, la genómica tiene como
objetivo predecir la función de los genes a partir de su secuencia o de sus interacciones
con otros genes. Así, la genómica tiene un enfoque distinto para responder preguntas
biológicas cuando se compara a otras ramas de la biología más tradicionales. Por lo tanto
genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del
funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. Es una de las áreas
más vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos derivados de distintas
ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas,
física, etc. Muchas veces, la genómica es usada como sinónimo de otras áreas de estudio
relacionadas, como la proteómica y la transcriptómica, por ejemplo.
Las ciencias genómicas han tenido un importante auge en los últimos años, sobre todo
gracias a las tecnologías avanzadas de secuenciación de ADN, a los avances en
bioinformática, y a las técnicas cada vez más sofisticadas para realizar análisis de
genomas completos. El desarrollo de la genómica ha contribuido al avance de distintos
campos de la ciencia como la medicina, la agricultura, etc; gracias al descubrimiento de
secuencias de genes necesarias para la producción de proteínas de importancia médica y
a la comparación de secuencias genómicas de distintos organismos. Por ejemplo en varios
países como Estados Unidos, la Unión Europea y Japón se han realizado enormes
proyectos para secuenciar el genoma de diversos organismos modelo. Probablemente el
más conocido es el Proyecto Genoma Humano. En la actualidad se cuenta además con
importantes servidores de acceso público, como el del NCBI (National Center for
Biotechnology Information), que permiten que cualquier usuario con conexión a Internet
acceda a la secuencia completa del genoma de decenas de organismos y a las secuencias
de cientos de miles de genes de distintos organismos.
De acuerdo a la página web
http://www.genomenewsnetwork.org/resources/sequenced, hasta el presente se han
secuenciado el genoma completo de 189 organismos.
LA GENÓMICA EN EL FUTURO
Los genomas que han sido secuenciados han sido muy útiles para la humanidad, pero es
una mínima parte del total de genomas existentes. La secuenciación de estos genomas
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IZ8jbAW
3. Seleccionar SeedViewer
4. Seleccionar el organismo del que se quiere analizar el genoma completo
5. Seleccionar Anopheles gambiae
6. En esta página, se abre una tabla que muestra cuantos contig (fragmentos vecinos
derivados de una fuente de secuenciación simple) hay, el número de genes que se
asignan para completar los subsistemas y las categorías de subsistemas representados
en su genoma. Ahora, copia esos datos y realiza una tabla con esta información en un
archivo word.
7. La página de la información del genoma muestra un gráfico circular de subsistemas
completos identificados en el genoma. Se puede ampliar las categorías para ver las
subcategorías y nombres de subsistema, junto con el número o las proteínas asignadas
a cada uno. La tabla (haga clic en el botón verde "Características de los subsistemas")
y ello ofrece un acceso similar, y usted puede seleccionar la categoría de
los "carbohidratos", desde la parte superior de la columna. Desde la categoría
carbohidratos, ya sea en el gráfico o tabla, puede hacer clic para abrir los
subsistemas de la glucólisis y de la Gluconeogénesis.
8. Haciendo clic en cualquiera de los genes del genoma recién anotado se abre la página
de “Información general de anotación”, por lo que se abre en una nueva ventana o
pestaña. Copia y realiza un resumen de la información de los genes que seleccionaste.
3.2. Anotación de genes mediante Programa ARTEMIS.
1. Abre la secuencia FASTA (Ava1) que te facilita el docente, utilizando el comando
File/Open. Observa que al abrir el archivo, aparecen tres ventanas, una inferior
vacía y dos superiores que muestran la secuencia nucleotídica y las secuencias
aminoacídicas correspondientes a las traducciones en los seis marcos de lectura
posibles (tres marcos de lectura por hebra) (Figura 1).
2. Utilizando la opción Create/Mark ORF (open reading frames), se establecen los
posibles ORFs, con un largo superior a 100 aminoácidos
3. El programa identifica diversas regiones de una secuencia, como unidades con un
determinado significado, a las cuales se les pueden asignar nombres y anotar datos
acerca de ellas. Estas regiones se denominan “features” (características o marcas),
y pueden ser ORFs, exones, etc.
4. Analiza los features (en este caso ORFs) obtenidos utilizando BLAST. Los features
aparecen indicados en la ventana inferior como CDS. Debes seleccionar cada uno
de los CDS y presionando el botón derecho del mouse sobre el feature, y utilizando
la opción View/Amino Acids of selection as FASTA (también se puede seleccionar
la secuencia nucleotidíca View/Bases of selection as FASTA) podrás obtener la
secuencia de cada CDS para su análisis.
5. Utilizando la información obtenida mediante BLAST, ahora puedes editar la
información contenida en los features, haciendo click con el botón derecho, y
seleccionando la opción Edit/Selected feature in editor. En la ventana que se abre
se puede modificar el nombre del feature con la opción Key, y agregar
información, colores, etc., con la opción Add Qualifiers.
6. Los features pueden estar separados de la secuencia en un archivo aparte
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Trabajo Práctico N °5
TAXONOMÍA MOLECULAR
1- Objetivos
2- Introducción
TAXONOMÍA Y SISTEMÁTICA
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TAXONOMÍA MICROBIANA
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Posteriormente, Woese introdujo el término Dominio para sustituir al reino como categoría
taxonómica de rango superior, y distribuyó a los organismos celulares en tres dominios :
Bacteria, Archea y Eukarya, el último de los cuales engloba a todos los seres eucariotas.
Desde entonces, el análisis de los ARNr 16S se ha utilizando ampliamente para establecer
las relaciones filogenéticas dentro del mundo procariota, causando un profundo impacto en
nuestra visión de la evolución y, como consecuencia, en la clasificación e identificación
bacteriana. De hecho, las ediciones vigentes de los dos tratados fundamentales de
bacteriología, Bergey‟s Manual of Systematic Bacteriology (http://www.springer-
ny.com/bergeysoutline/main.htm) y The Prokaryotes (http://www.prokaryotes.com), basan
su estructuración del mundo procariota en las relaciones filogenéticas establecidas con esta
macromolécula.
Los ARNr 16S pueden actualmente mediante amplificación por PCR y posterior
secuenciación por método enzimático.
Ribosomas
Son orgánulos complejos, altamente especializados, que utilizan los organismos para el
complicado proceso de síntesis de proteínas. El ribosoma bacteriano tiene un coeficiente de
sedimentación de 70S (expresado en unidades Svedberg), y puede disociarse en dos
subunidades, la subunidad grande (50S) y la subunidad pequeña (30S). Cada subunidad es
un complejo ribonucleoproteico constituido por proteínas ribosómicas y moléculas de
ARNr específicas.
La subunidad 30S contiene el ARNr 16S y 21 proteínas diferentes (numeradas desde S1-
S21, donde S procede de small l), mientras que la subunidad 50S contiene los ARNr 5S y
23S junto con unas 34 proteínas (L1-L34; L: large). En bacterias, los genes que codifican
los ARN ribosomales están organizados en operones (conjunto de genes que se transcriben
a partir de la misma región promotora). Cada operón ribosómico incluye genes para los
ARNr 23S (rrl), 16S (rrs) y 5S (rrf), separados por regiones espaciadoras o intergénicas
(IG), y contiene además genes para uno o más ARN de transferencia (ARNt). El producto
de la transcripción del operón a partir de dos promotores, P1 y P2, situados en la región
anterior a rrs, será procesado por el enzima ARNasa III mediante cortes en sitios
específicos que separan las tres clases de ARNr, el/los ARNt y las dos IG.
ARNr 16S
Es un polirribonucleótido de aproximadamente 1.500 nt, codificado por el gen rrs, también
denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya secuencia se puede obtener
información filogenética y taxonómica. Como cualquier secuencia de nucleótidos de
cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la
presencia de segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla. En
eucariotas, el ARNr 18S es la macromolécula equivalente. Dado que los ARNr 16S y 18S
proceden de las subunidades pequeñas de los ribosomas, el acrónimo ARNr SSU (del
inglés, small subunit) se utiliza para ambos. Los ARNr SSU se encuentran altamente
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conservados, presentando regiones comunes a todos los organismos, pero contienen además
variaciones que se concentran en zonas específicas. El análisis de la secuencia de los ARNr
16S de distintos grupos filogenéticos reveló un hecho adicional de gran importancia
práctica: la presencia de una o más secuencias características que se denominan
oligonucleótidos firma. Se trata de secuencias específicas cortas que aparecen en todos (o
en la mayor parte de) los miembros de un determinado grupo filogenético, y nunca (o sólo
raramente) están presentes en otros grupos, incluidos los más próximos. Por ello, los
oligonucleótidos firma pueden utilizarse para ubicar a cada bacteria dentro de su propio
grupo.
El número de copias del operón ribosómico por genoma bacteriano varía
considerablemente, de 1 a 15, siendo relativamente constante a nivel de especie, género e
incluso familia. Entre las copias de los ARNr 16S codificadas por un mismo genoma se ha
detectado un cierto grado de heterogeneidad (denominada microheterogeneidad).
1. Se trata de una molécula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales.
Constituye, por tanto, una diana universal para la identificación.
2. Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy
prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente
cambios aleatorios.
3. Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar
información acerca de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los
ARNr 18S, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los ARNr SSU contienen, sin
embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no sólo los organismos más
alejados, sino también los más próximos.
4. El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.500 nt) minimiza las
fluctuaciones estadísticas.
5. La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las
comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso.
6. Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr 16S existen bases de
datos amplias, en continuo crecimiento.
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Definición y origen
Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia de ADN doble
cadena de entre 4 y 8 pb. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la
enzima rompe un enlace fosfodiester en cada hebra. Las secuencias de reconocimiento son
repeticiones invertidas perfectamente simétricas conocidas como palíndromos.
Las enzimas de restricción se encuentran en muchas especies de bacterias. Las bacterias
desarrollaron las enzimas de restricción como una defensa frente a la infección por fagos
(virus bacterianos). Se denominan de restricción porque estas enzimas restringen la
invasión del ADN exógeno cortándolo en pedazos. En cambio, el ADN propio no es
reconocido por sus enzimas de restricción, ya que puede protegerse del corte por metilación
específica de la secuencia mediante una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos
metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas). Los sitios de reconocimiento de las
metiltransferasas corresponden a los de las endonucleasas. Este sistema es análogo a un
sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su ADN y el ADN exógeno.
Estás enzimas son aprovechadas para la tecnología del ADN recombinante. Se denomina
ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño en un
ADN receptor por enzimas denominadas ligasas. Por ejemplo, la integración de un ADN
vírico en un ADN celular.
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Tipo I: es una enzima formada por 3 subunidades que reconoce el sitio de ADN. Esta
enzima metila y corta. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al
azar y en sitios distantes al de reconocimiento.
Tipo II: dos enzimas diferentes realizan la restricción y la metilación. La restricción ocurre
en el sitio de reconocimiento. Estas enzimas son las utilizadas en ingeniería genética debido
a que permiten romper el ADN en sitios específicos.
Tipo III: es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las
actividades enzimáticas, y rompen el ADN 25-27 pb, más allá del sitio de reconocimiento.
Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos
de cortes:
A.Cortes pegajosos, dejando productos con extremos cohesivos (sticky) Ej: Eco RI y Pst I
B.Cortes simétricos, dejando productos con extremos romos (blunt). Ej: Pvu II
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Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos romos y con extremos
cohesivos), en ingeniería genética se prefieren aquellos con extremos cohesivos, puesto que
permiten la unión espontánea del gen a clonar con el vector. Si las moléculas a utilizar
presentan extremos romos, hay que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando
la enzima transferasa terminal.
Eco RI
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E = Escherichia, género
co = coli, especie
R = factor R, variedad
I = orden de aparición
En las siguientes tablas se pueden observar las enzimas más comúnmente usadas en
biología molecular, nomenclatura, fuentes y sitios de corte.
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3. Mezclar y centrifugar.
4. Poner a baño María (37°C) durante 1 hora.
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El análisis del patrón de restricción del ADN es una de las técnicas más utilizadas para la
identificación y agrupación de bacterias. Esta técnica puede ser usada para separar especies
pertenecientes al mismo género, o para distinguir cepas bacterianas que presenten gran
similitud dentro de la misma especie o subespecie.
Los fragmentos resultantes de la digestión del ADN total por la acción de las enzimas de
restricción pueden ser separados por electroforesis generando un patrón de bandas, el cual
es la huella dactilar de la cepa, ya que el número y localización de los sitios de restricción
es específico para cada genoma.
El análisis de restricción del ADN ribosomal amplificado es una técnica muy útil para la
identificación y clasificación de bacterias, incluso a nivel de especie, además permite la
clasificación de aislamientos y clones de manera simple, rápida y económica
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
2000
2000
1500
1500
1000
1000
750
750
500
500
250 250
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A B
1 2 3 4 5 6 7 8
2000
1500
1000
750
500
250
C
(Extraído con permiso Albarracín, 2007-Tesis Doctoral)
Patrones de restricción de los fragmentos de ADN que codifican para el ARNr 16S. A. Calles: 1. Marcador 1Kb (Promega). 2, 3 y 4.
ADNr 16S del aislamiento AB0, digerido con Kpn I, Pst I y Sau3AI, respectivamente. 6, 7 y 8. ADNr 16S del aislamiento AB2C,
digerido con Kpn I, Pst I y Sau3AI, respectivamente. B. Calles: 1. Marcador 1Kb (Promega). 3 y 5. ADNr 16S digerido con Sau3AI de
los aislamientos AB2A y AB3, respectivamente. 7 y 8. ADNr 16S digerido con Kpn I de los aislamientos AB3 y AB5F, respectivamente.
C. Calles: 1. Marcador 1Kb (Promega). ADNr 16S amplificado a partir de ADN del aislamiento AB0 y digerido con: 2. Sal I. 3. Sau3A
El poder resolutorio del ARDRA depende de la/s enzima/s utilizada/s. Primero se debe
realizar una PCR para amplificar el ADNr 16s y luego se cortan los amplicones con
enzimas de restricción. Los amplicones digeridos se separan por electroforesis. El método
se basa en la variación en la posición de sitios de restricción entre las secuencias y en la
determinación de la longitud de fragmentos de restricción.
Los patrones obtenidos se pueden comparar con los ARDRA de bacterias conocidas,
usando las secuencias de ADNr presentes en bases de datos, empleando la digestión in
silico. La digestión in silico permite realizar una selección adecuada de las enzimas a
utilizar.
- 83 -
Cátedra Biología Molecular
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-2015-
3- Actividades prácticas
- 84 -
Cátedra Biología Molecular
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-2015-
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Cátedra Biología Molecular
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-2015-
AAGCGTCTGTAGGTTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCC
AAAACGCGTTGGATACTGGCAGACTAGAGTTATGTAGAGGTTAGCGGAATTCC
TTGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATAAGGAAGAACATCAATATGGCGAAGG
CAGCTAACTGGGCATACACTGACACTGAGAGACGAAAGCGTGGGGAGCAAAC
AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCATTAGTTGATGG
GGAACTCATCGACGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACGTTC
GCAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCA
TGTGGTTTAATTTGAAGATACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTG
CAAAGCTATGGAGACATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTT
GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCC
TTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGAGCACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAA
TCGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGC
TACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGAAGCGAAGTGGTGACATGGA
GCAAACCTCAAAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCA
TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTT
CTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAA
GTCGGTTTATTAAGAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTCG
TAACAAGGTATCCCTACGAGAAC
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Cátedra Biología Molecular
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-2015-
CTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTA
ATCGTAGATCNCGTACGCTACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGC
CCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAGTCGGTTTATNAACAAATCGC
CTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGG
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Cátedra Biología Molecular
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-2015-
ATATTCCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCGACACAGCGTGCATGATGACG
GTCTTCGGATTGTAAAGTGCTGTTATAAGGGAAGAACACTTAGTTGAGGAAAT
GCTTCTAAGCTGACGGTACCTTATTAGAAAGCGATGGCTAACTATGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGC
GTTCGTAGGCTGTTTATTAAGTCTGAAGTCAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGTT
CGCTTTGGATACTGGTAAACTAGAGTTGGATAGAGGTAAGCGGAATTCCATGT
GAAGCGGTGAAATGCGTAGATATATATGGAAGAACACCAAAGGCGAAGGCAG
CTTACTGGGTCTATACTGACGCTGAGGGACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA
TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATCATTAGTCGGTGGAGAA
TCACTGACGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTATGCTCGCAAG
AGTGAAACTTAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT
TTAATTTGAAGATACACGGAGAACCTTACCCACTCTTGACATCCTTCGCAATAC
TATAGAGATATAGTGGAGGTTAACGGAGTGACAGATGGTGCATGGTTGTCGTC
AGCTCGTGTCGTGAGATGTTTGGTCAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTATCT
TTAGTTACTAACGAGTCATGTCGAGGACTCTAGAGATACTGCCTGGGTAACTGG
GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGCAACA
CACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGAGAAGCAATATGGCGACATGGAGCAA
ATCTCAAAAAGCCGATCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAATTCGACTTCATGAA
GTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCTATGCTGCGGTGAATACGTTCTCGG
GTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCTGGTAATACCCAAAGTCGG
TTTGCTAACCTCGGAGGCGACTGCCTAAGGTAGGACTGGTGACTGGGGTGAAG
TCGTAACAAGGTATCCCTACGAGAAC
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Cátedra Biología Molecular
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-2015-
AACGCGTTGGATACTGGCAGACTAGAGTTGTGTAGAGGTTAGCGGAATTCCTT
GTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATAAGGAAGAACACCAATATGGCGAAGGC
AGCTAACTGGACATATACTGACACTGAGAGACGAAAGCGTGGGGAGCAAACA
GGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCATTAGCTGATGGG
GAACTCATCGGCGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACGTTCG
CAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCAT
GTGGTTTAATTTGAAGATACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTGC
AAAGCTATGGAGACATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTTG
TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCT
TATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGAGGACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAAT
CGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGCA
ACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGAAGCGAAGTGGTGACATGGAG
CAAACCTCAAAAAACCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACAT
GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTTC
TCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAG
TCGGTTTATAAACAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTCGT
AACAAGGTATCCCTACGAGAAC
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Cátedra Biología Molecular
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-2015-
TGAAGCCGGAATCACTAGTAATCGCGAATCAGCTATGTCGCGGTGAATACGTT
CTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGTAATACCAGAA
GTGGGTAGCTTAACCGCAAGGAGAGCGCCTCCCAAGGTAGGACTGGCGATTGG
GGTGAAGTCGTAACAAGGTATCCGTACGGGAAC
>Secuencia 1
CTGGCTGTGTGGCTAATACATGCATGTCGAGCGAAGGTAGCAATACCTTAGCG
GCGAATGGGTGAGTAACACGTGCTCAACGTACCCTTCAGTTTGGCATAGCGAC
TGGAAACAGTCGATAATTCCAAATACTCGTAATTTTCGCATGAAGATTACGTAA
AAGAGGCGTTTGCTTCGCTGRAGGATCGGGGTGCGTAACATTAGCTAGTTGGT
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-2015-
GAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGATGTTTAGCGGGGTTGAGAGACTGAACG
GCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG
AATATTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCGACACAGCGTGAAGGATGA
AGGTCCTATGGATTGTAAACTTCTGTGGTGAGGGAAGAAAAGACAGAATAGGA
AATGATTTTGTTTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCAACGGCTAACTATGTGCCA
GCAGCCGCGGTAATACATAGGTTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAA
AGCGTCTGTAGGTTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCCA
AAACGCGTTGGATACTGGCAGACTAGAGTTGTGTAGAGGTTAGCGGAATTCCT
TGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATAAGGAAGAACACCAATATGGCGAAGG
CAGCTAACTGGACATATACTGACACTGAGAGACGAAAGCGTGGGGAGCAAAC
AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCATTAGCTGATGG
GGAACTCATCGGCGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACGTTC
GCAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCA
TGTGGTTTAATTTGAAGATACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTG
CAAAGCTATGGAGACATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTT
GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCC
TTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGAGGACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAA
TCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGC
AACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGAAGCGAAGTGGTGACATGGA
GCAAACCTCAAAAAACCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTAC
ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGT
TCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGA
AGTCGGTTTATAAACAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTC
GTAACAAGGTATCCCTACGAGAAG
>Secuencia 2
CTGGCTGTGTGCCTAATACATGCATGTCGAGCGATGATAGCAATATCATAGCG
GCGAATGGGTGAGTAACACGTACTCAACGTACCTTTTAGATTGGGATAGCGGA
TGGAAACATCCGATAATACCGAATACTTATTATTTTTGCATGAAAGTAATATAA
AAGGAAGCGCTTGCTTCGCTAGAAGATCGGAGTGCGCAACATTAGCTAGTTGG
TGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGATGTTTAGCGGGGTTGAGAGATTGATC
CGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG
GAATATTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCGACACAGCGTGCAGGATGA
ATGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTGTGGTTAGGGAAGAAAAAGTAGCGTAGGA
AATGACGCTACCTTGACGGTACCTGATTAGAAAGCAACGGCTAACTATGTGCC
AGCAGCCGCGGTAATACATAGGTTGCAAGCGTTATGCGAAATTATTGGGCGTA
AAGCGTCTGTAGGTTGTTTGTTAAGTCTGGCGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCC
AAAACGCGTTGGATACTGGCAGACTAGAGTTATGTAGAGGTTAGCGGAATTCC
TTGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATAAGGAAGAACATCAATATGGCGAAGG
CAGCTAACTGGGCATACACTGACACTGAGAGACGAAAGCGTGGGGAGCAAAC
AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCATTAGTTGATGG
GGAACTCATCGAGGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACGTTC
GCAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCA
TGTGGTTTAATTTGAAGATACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTG
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CAAAGCTATGGAGACATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTT
GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGACGTTCGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCC
TTATCCTTAGTTACTACCATTTAGTTGAGCACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAA
TCGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGC
TACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGAAGCGAAGTGGTGACATGGA
GCAAACCTCAAGAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCA
TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTT
CTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAA
GTCGGTTTATTAAGAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTCG
TAACAAGGTATCCCTACGAGAAC
>Secuencia 3
CTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGGGGGTGCTTGCACCTCAGTG
GCGAACGGGTGAGTAACACGTATCTAACCTACCTTATAGCGGGGGATAACTTT
TGGAAACGAAAGATAATACCGCATGTAGATCTTATTATCGCATGAGAAAAGAT
CAAAAGAACCGTTTGGTTCACTATGAGATGGGGATGCGGCGTATTAGCTAGTA
GGTGAGATAATAGCCCACCTAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGA
TCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA
GGGAATTTTTCACAATGGACGAAAGTCTGATGAAGCAATGCCGCGTGAGTGAT
GACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTGTAAGGGAAGAAAAAATAAAGTAGG
AAATGACTTTATCTTGACAGTACCTTACCAGAAAGCCACGGCTAACTATGTGCC
AGCAGCCGCGGTAATACATAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTA
TAGGGTGCGTAGGCGGTTTTGCAAGTTTGAGGTTAAAGTCCGGAGCTCAACTCC
GGTTCGCCTTGAAAACTGTTTTACTAGAATGCAAGAGAGGTAAGCGGAATTCC
ATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCTGTGGCGAAAGCG
GCTTACTGGCTTGTTATTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAATAGG
ATTAGATACCCTAGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAGTGTTGGGGT
AACTCAGCGCTGCAGCTAACGCATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTATGCTCGCA
AGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGTGGTGGAGCATGT
GGTTTAATTCGAAGCAACACGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCAGTGCA
AAGCTATAGAGATATAGTAGAGGTTAACATTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGT
CGTCAGTTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAACGCAACCCTT
GTCGTTAGTTACTAACATTAAGTTGAGAACTCTAACGAGACTGCTAGTGTAAGC
TAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCTGGGCTA
CACACGTGCTACAATGGCTGGTACAAAGAGTTGCAATCCTGTGAAGGGGAGCT
AATCTCAAAAAACCAGTCTCAGTTCGGATTGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGA
AGCCGGAATCACTAGTAATCGCGAATCAGCTATGTCGCGGTGAATACGTTCTC
GGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGTAATACCAGAAGTA
GGTAGCTTAACCATTTGGAGAGCGCTTCCCAAGGTAGGACTAGCGATTGGGGT
GAAGTCGTAACAAGGTATCCGTACGGGAAC
3) Con ayuda del programa DNAMAN, realizar la digestión in silico de las 13 secuencias:
1. Al abrir el programa se verá la siguiente pantalla:
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