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p La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
permite a los investigadores para producir
millones de copias de una secuencia específica
de ADN en aproximadamente dos horas. Este
proceso automático evita la necesidad de
utilizar bacterias para amplificar el ADN.
En un tubo de ensayo el ADN de la especie objeto de estudio. Se añade en
dicho tubo un par de oligonucleótidos que actúen como cebadores para la ADN
polimerasa. Los cebadores o primers son los delimitan la región a amplificar y
deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la región a
amplificar.
Añadir al tubo de reacción los 4 tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos
(dNTPs) que componen el ADN (dATP, dGTP, dTTP y dCTP,) por último
también la ADN polimerasa.
Taq-polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus polimerasa especial
capaz de resistir las elevadas temperaturas a la que vamos a someter a
nuestro tubo de reacción
Por último, facilitar que la polimerasa lleve a cabo
la síntesis de ADN utilizando como cebadores los
extremos 3´ de los primers utilizados. Así,
nuestra reacción constaría de 3 pasos:
. Ú  
  Se
conseguiría elevando la temperatura
del tubo de reacción hasta 94oC,
durante, por ejemplo, un minuto (este
tiempo puede variar entre ½ minuto
y 2 minutos)

2.   . Se


desciende la temperatura hasta
una temperatura ue puede oscilar
entre 40 oC y 60 oC (dependiendo
de diversos par metros como la
secuencia de los pri r ,
ifi i ,...). r i
t il r tr
i t i t .
3.    . Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los
72 oC y se deja actuar a la Taq polimerasa durante  ó 2 minutos.

Estos tres pasos constituyen un ciclo. La repetición de este


ciclo unas 4 veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado
de un experimento de amplificación, millones de copias del
fragmento de interés.

Todo esto, por supuesto, se realiza de forma automatizada.


Para ello, los tubos de reacción se introducen en un termociclador
que de forma automática realiza los 4 ciclos de amplificación.
p ÿno de los aportes fundamentales de la PCR a la
investigación básica en biología molecular consiste,
precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante la
cual se realiza una tarea que antes requería largas
y tediosas jornadas.
p El producto que se obtiene al finalizar la reacción,
favorece la tarea de los investigadores empeñados
en ampliar nuestros conocimientos sobre la
estructura y función de los genes.
p a facilitado:

D La tarea de identificación de personas


D Nuevas estrategias de diagnóstico
D Detectar agentes infecciosos como los virus de las
hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la
inmunodeficiencia humana ( )
D Diagnosticar la presencia o ausencia de   en recién
nacidos de madres seropositivas
D Diagnóstico de enfermedades tales como las
hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis
quística, e hizo posible reconocer mutaciones de
genes vinculadas con enfermedades oncológicas.
La técnica de la PCR permite seleccionar la región del genoma que se desea
estudiar y realizar múltiples copias de la misma. Para ello, se prepara una
reacción (mezcla de PCR o "mix") que contiene todos los elementos necesarios
para producir una síntesis "in vitro" de ADN:
p Tampón de PCR (PCR buffer). Contiene sales que estabilizan el pH de la reacción.
p - Cloruro de Magnesio (MgCl2).Forma complejos solubles con los dNTPs para
producir un substrato reconocible por la polimerasa.
p - Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs: dATP, dTTP/dUTP, dCTP,dGTP). Constituyen
el sustrato con el que la ADN polimerasa construye la nueva cadena de ADN.
p - Una pareja de cebadores ("primers"). Secuencias cortas de ADN complementarias
a ambos extremos de la región de ADN que se desea copiar.
p - Taq polimerasa. Enzima encargada del copiado de las cadenas a partir de los
cebadores. Se trata de una DNA polimerasa purificada de la bacteria termófila
"Thermus aquaticus", y que por lo tanto es estable a temperaturas
superiores a los 90ºC.
p Esta se basa en tres porcedimientos:

‡ Desnaturalizacion: la desnanturalizacion por calor


(usualmente mayor o igual 9 ºC) separa la doble hebra de
DNA en dos hebras sencillas rompiendo los enlaces de
hidrogeno que unen a las bases, mientras que los enlaces
entre la desoxirribosa y los grupos fosfato permanecen
intactos.

‡ ibridacion: el cebador se unira a su secuencia


complementaria en el ADN molde3. para esto es necesario
que la temperatura descienda (generalmente entre 55ºC,
5ºC). Estos cebadores actuaran como limites de la region
de la molecula que va a ser amplificada.
p Alargamiento: por ultimo actua la DNA polimerasa,
tomando el DNA molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte
inicial necesario para la sintesis de nuevo DNA. Se
aumenta la temperatura hasta 72ºC (para la taq
polimerasa), temperatura a la cual la DNA polimerasa
presenta su maximo de actividad, aumentando
exponencialmente la cantidad de fragmentos de DNA en la
muestra.

ÿna vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos


pasos, uno de extension de la cadena a la temperatura
optima de la taq polimerasa, normalmente 72ºC, para
finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservacion.
Este ciclo (Desnaturalizacion,ibridacion y Alargamiento) se
repetira un numero de veces dependiendo la cantidad de
fragmentos amplificados que se desee
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m  .
p Las técnicas de RT-PCR permiten la formación de cDNA
(DNA complementario) del ARN, que salva la secuencia de
ARN (tal como mRNA) en la forma más estable de ácido
nucléico, DNA. Esta transcripción reversa del ARN en su
DNA reversa del complemento (cDNA) es el primer paso
de progresión de un proceso generalmente de dos etapas
de RT-PCR. Además, copiando el ARN en la DNA, una
puede entonces amplificar la secuencia del cDNA usando
las cartillas específicas para la secuencia de la DNA. Esta
amplificación es el segundo paso de progresión principal
final del proceso de dos etapas de RT-PCR.
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