TÉCNICA MOLECULAR

QUE SE EMPLEA PARA EL

DIAGNÓSTICO DE
COVID-19
 TÉCNICA MOLECULAR QUE SE EMPLEA PARA EL DIAGNÓSTICO DE COVID-19
La PCR, siglas en inglés de ‘Reacción en Cadena de la Polimerasa’, es una prueba que permite
detectar un fragmento del material genético de un patógeno o microorganismo para el diagnóstico
de una enfermedad. Durante las últimas semanas, esta prueba se ha estado usando para referenciar
positivos en la pandemia del coronavirus Covid-19.

La PCR, cuyo uso es común y rutinario en el ambiente sanitario, se basa en las características de
estabilidad al calor de una enzima polimerasa, cuyo hallazgo y posterior aplicación mereció el
Premio Nobel de Medicina a Kari Mullis y Michael Smith en 1993.

Mediante la PCR se localiza y amplifica un fragmento de material genético, que en el caso del
coronavirus es una molécula de ARN. Si la técnica de PCR no detecta el material genético del virus -
contrapone-, la persona no estaría infectada; cuando hay una sospecha clínica importante se debe
realizar otra prueba para asegurar que el paciente no está infectado por el virus.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La técnica de amplificación de ADN o ARN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN o ARN específico.
Para llevar a cabo el experimento de amplificación es necesario conocer, al menos parcialmente, la
secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora,...).
Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ARN o ADN y, para ello,
debemos realizar in vitro lo que hacen las células in vivo para replicar su material genético.

Se trata de disponer en un tubo de ensayo una muestra del cual el ADN o ARN de la especie u se
estudiara en este caso el ARN del COVID-19. Además debemos añadir en dicho tubo un par de
oligonucleótidos que actúen como cebadores para la ADN polimerasa. La elección de estos
oligonucleótidos (cebadores o primers) es crucial dado que han de delimitar la región a amplificar.
En concreto, deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la región a amplificar:

En este esquema se dibuja en la parte superior una molécula de ADN y se delimita

la región que ha de ser amplificada (flechas verticales). En la parte inferior se destacan

los sitios de apareamiento de los primers utilizados (flechas horizontales) y la orientación de éstos.
Además del ADN y de los primers, es necesario añadir al tubo de reacción los 4 tipos de
desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) que componen el ADN (dATP, dGTP, dTTP y dCTP, en
una mezcla equimolar de cada uno de ellos). Por supuesto, añadiremos por último también la ADN
polimerasa que, en este caso, ha de ser una polimerasa especial capaz de resistir las elevadas
temperaturas a la que vamos a someter a nuestro tubo de reacción. Dicha ADN polimerasa es la
llamada Taq-polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus.

Una vez tenemos todos los componentes en nuestro tubo de reacción (Figura 1), tenemos que
favorecer de alguna forma que ocurra la síntesis de ADN. Para ello, lo primero que debemos hacer
es facilitar la desnaturalización del ADN. A continuación, permitir el alineamiento de
los primers (apareamiento con su región complementaria) y, por último, facilitar que la polimerasa
lleve a cabo la síntesis de ADN utilizando como cebadores los extremos 3´ de los primers utilizados.
Así, nuestra reacción constaría de 3 pasos:

1. Desnaturalización. Se conseguiría elevando la temperatura del tubo de reacción hasta 94oC,

durante, por ejemplo, un minuto (este tiempo puede variar entre ½ minuto y 2 minutos)

2. Alineamiento. Se desciende la temperatura hasta una temperatura que puede oscilar entre 40 oC
y 60 oC (dependiendo de diversos parámetros como la secuencia de los primers, su especificidad,...).
La duración de este paso puede oscilar entre ½ minuto y 2 minutos.

3. Extensión. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72 oC y se deja actuar a la Taq

polimerasa durante 1 o 2 minutos.

Estos tres pasos constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo unas 40 veces, por ejemplo, permite
obtener, como resultado de un experimento de amplificación, millones de copias del fragmento de
interés.

Todo esto, por supuesto, se realiza de forma automatizada. Para ello, los tubos de reacción se
introducen en un termociclador que de forma automática realiza los 40 ciclos de amplificación.