Guía de Prácticas de Bacteriología - Ciclo 2022-I

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
GUÍA DE PRÁCTICA
DE
BACTERIOLOGÍA
Dra. Olga V. Francia Arana

Docente Principal a D.E
Dra. Olga Francia Arana Guía de Práctica de Bacteriología 2
INDICE
Práctica N° 1: Materiales y Equipos de Laboratorio ......................................................................................3

Práctica N° 2: Obtención de un cultivo Puro .................................................................................................6
Práctica N° 3. Aislamiento e identificación de los Géneros: Staphylococcus Micrococcus …………………..12
Práctica N° 4: Aislamiento e Identificación de los géneros: Streptococcus, Lactococcus y Enterococcus . 19
Practica N° 5: Aislamiento e identificación de los géneros Bacillus y Clostridium ..................................... 25
Práctica N° 6: Aislamiento e identificación de Lactobacillus delbruechii , L. plantarum........................... 31
Práctica N° 7: Aislamiento e identificación de los géneros Listeria y Corynebacterium ........................... 37
Práctica N° 8: Aislamiento e identificación de los Género Mycobacterium, Nocardia y Streptomyces .... 44
Práctica N° 9: Aislamiento e identificación de los géneros Neisseria y Pseudomonas .............................. 52
Práctica N° 10. Aislamiento e identificación de los géneros Azotobacter y Rhizobium ............................. 60
Práctica N° 11: Aislamiento e identificación de géneros de la Familia Enterobacteriaceae ...................... 67
Práctica N° 12: Aislamiento e identificación de lo género Vibrio y Aeromonas ........................................ 72
Práctica N° 13. Aislamiento e identificación del género Halobacterium ................................................... 80
Práctica N° 1: Materiales y Equipos de Laboratorio
Introducción
Para el desarrollo de las prácticas de la asignatura de Bacteriología, se necesita materiales y
equipos de laboratorio que permitan cumplir con los objetivos propuestos de aislar e identificar
las bacterias en cada una de las prácticas programadas
Los alumnos deben seleccionar los materiales necesarios para la ejecución de las prácticas del
conjunto de materiales y equipos existentes en el laboratorio y así cumplir con el objetivo
Competencias de la Práctica
El alumno:
 Maneja adecuadamente los materiales de vidrio y metal, su limpieza, acondicionamiento y
esterilización
 Conoce el manejo de los equipos que utilizará en el desarrollo de las prácticas.
Materiales de vidrio
Placas Petri Láminas Pipetas
Tubos de ensayo Matraces Vasos de precipitación

Materiales de metal y equipos
Mechero Bunsen pHmetro Jarra de Brewer
Contador de colonias Gradilla para pipetas Gradilla para tubos
Cámara de Flujo laminar Estufa Refrigeradora
Balanza analítica Balanza analítica Microscopio binocular

Otros Materiales
Pipeteador manual
Ansas bacteriológicas
Espátula de Drigalsky
Plumon negro marcador de vidrio
Tarea
1. Presenta el informe de práctica teniendo en cuenta las indicaciones siguientes:
 Introducción
Indique la importancia y los objetivos
 Material y Métodos
Esquematice o presente fotografías, con explicación del mismo. Redacte la metodología
 Resultados
Realice la descripción de los materiales y equipos que utilizará en cada práctica y regis-
tre en tablas o cuadros.
 Conclusiones
Las conclusiones deben ser puntuales relacionados a los objetivos y resultados
 Bibliografía. Tener en cuenta las normas APA para presentar la bibliografía
 Anexo. Explique por qué es importante el conocimiento de los materiales y equipos de

laboratorio.
Práctica N° 2: Obtención de un cultivo Puro
Introducción
Las bacterias, son microorganismos que se encuentran ampliamente distribuidas en la
naturaleza; habitan el suelo, aire, agua, organismos animales, vegetales y humanos. Su estudio
requiere de técnicas adecuadas para descubrir la compleja población mixta de diversos hábitats
y separarlas en sus partes integrantes, es decir cultivar una sola especie.
Se entiende por cultivo puro, una población de bacterias que proceden de una célula. Es un
estado artificial que se obtiene en el laboratorio, pero requiere proporcionar las condiciones
adecuadas para el desarrollo y conservación.
Competencias de la práctica
El alumno:
 Conoce las técnicas de aislamiento in vitro del hábitat de las diferentes especies
bacterianas
 Aplica correctamente las técnicas de aislamiento secundario para obtener un cultivo puro.
Materiales
 Muestra: tierra, agua, alimentos, secreción nasofaríngea (SNF), heces, sangre.
 Placas con agar nutritivo (AN), agar sangre (AS), agar tripticasa soya (ATS).
 Tubo con medio SIM
 Tubo con caldo nutritivo
 Asa bacteriológica
 Lámina excavada y laminilla
Metodología
 Seleccionar la muestra
 Realizar el aislamiento primario, mediante la siembra por estría en la superficie del medio
sólido, Agar Tripticasa Soya (ATS)
 Incubar las placas a 37C durante 24 horas en ambiente aeróbico
 Describir las colonias (Considerar aspectos de: forma, tamaño, color, superficie,
consistencia, bordes, elevación)
 Hacer la Tinción de las colonias empleando la técnica de Gram y proceder al estudio
microscópico de las células bacterianas.
 Realizar el aislamiento secundario en tubo o vial con medio sólido inclinado. La siembra se
realiza por puntura con aguja bacteriológica y hacer el estriado en la superficie inclinada
 Incubar el tubo o vial a 37°C durante 24 horas
 Evaluar el crecimiento y confirmar la morfología bacteriana con tinción de Gram
 Se obtiene el Cultivo puro o cepa, el mismo que es etiquetado y rotulado
 Determinar la movilidad de las bacterias. Se utiliza dos técnicas:
1. Técnica de movilidad en medio semisólido. Consiste en Sembrar por puntura la cepa
con aguja bacteriológica en medio SIM. Incubar a 37°C durante 24 horas. Observar la
movilidad de las bacterias por desplazamiento perpendicular a la estría vertical de
siembra
2. Movilidad en lámina excavada. Consiste en colocar un borde de vaselina en el
perímetro de la excavación. Sobre la laminilla colocar una gota del cultivo líquido de 24
horas. Cuidadosamente hacer coincidir la excavación con la gota. Observar con objetivo
de menor y mayor aumento. Si el movimiento es localizado, se presume que la bacteria
tiene flagelos peritricos, pero si el movimiento es rápido que se desplaza en el campo
microscópico, se presume que las bacterias tienen flagelos polares.
 Determinar las características de crecimiento en medio líquido. Se utiliza un tubo con caldo
Tripticasa soya. La siembra de hace con ansa bacteriológica (anillo); se toma una pequeña
porción de la cepa y se lava el ansa en el medio líquido. Se incuba a 37°C durante 24 horas y
se hace luego la lectura. Se puede observar: turbidez, sedimento, película, flóculos, etc.
Fig. 1. Cepario de bacterias
Fig. 2 Siembra por puntura

Fig .3. Características del crecimiento en medio
semisólido: 1. Bacteria móvil, 2. Bacteria
inmóvil, 3. medio sin cultivo
4
Fig. 4, 5 y 6. Colonias bacterianas observadas en placa después de un período de incubación

Fig. 6. Esquemas de Tipos morfológicos de colonias bacterianas por su forma, bordes, elevación y superficie
Fig. 6. Tipos de crecimiento de las bacterias en medio líquido
Tarea
Presentar el informe de práctica: y tener en cuenta las indicaciones siguientes:
 Introducción
Indique la importancia y los objetivos
 Resultados
Los resultados obtenidos de las cepas deben ser registrados en tablas. Interpretar las
tablas
 Conclusiones
Las conclusiones deben ser puntuales relacionados a los objetivos
 Bibliografía
 Cuestionario
1. ¿Se podría simplificar los pasos para obtener un cultivo puro? Explique
Sugiera que pasos
2. ¿Considera que un cultivo puro podría mantenerse en un medio selectivo diferencial? ¿Por
qué?
3. ¿Qué tiempo podría mantenerse las bacterias en cultivo puro?
4. ¿Qué características se deben tener en cuenta para prolongar el tiempo de conservación de
un cultivo puro?
Práctica N° 3. Aislamiento e identificación de los Géneros: Staphylococcus,

Micrococcus
Introducción
La Familia Staphylococcaceae y Micrococcaceae, agrupa a las bacterias de los géneros
Staphylococcus y Micrococcus respectivamente, entre otros géneros, cuyos hábitats naturales
son los mamíferos para el primero y el suelo y agua para el segundo. Sus células son esféricas
(cocos), se disponen en agrupaciones irregulares como consecuencia de la división celular en
tres planos. Con excepción del género Staphylococcus, forman agrupaciones en tétradas.
Producen pigmentos, blanco, dorado (Staphylococcus), rosa, anaranjado, amarillo
(Micrococcus)
Son bacterias Gram positivas, inmóviles con algunas excepciones, aeróbias (Micrococcus) y
aerobias o anaeróbias facultativas (Staphylococcus). Son catalasa positiva y la mayoría de
especies son saprofitas, con excepción de S. aureus que es patógena.
La especie representativa del género Staphylococcus es S. aureus y del género Micrococcus es

M. luteus
Competencias de la práctica
El alumno:
 Aísla e identifica S. aureus de muestras clínicas, haciendo uso correcto de las técnicas de
aislamiento e identificación.
 Aísla e Identifica la especie M. luteus haciendo uso correcto de las técnicas de aislamiento
e identificación
Materiales
Aislamiento de los géneros: Staphylococcus y Micrococcus
Muestra: secreciones, pus, leche, quesos para aislamiento de Staphylococcus y agua, tierra,
alimentos contaminados para aislamiento de Micrococcus
 Placa Petri con agar sangre, Placa Petri con agar Chapman o agar manitol salado, o agar
Baird Parker para el aislamiento de Staphylococcus y agar nutritivo para el aislamiento de
Micrococcus
 Placas Petri estériles,
 Ansa bacteriológica
 2 Tubos o viales con agar nutritivo o agar cepa.
 Microscopio compuesto
 Jarra de Brewer
Identificación Staphylococcus y Micrococcus
 Batería de Gram para reconocer la morfología celular de ambas cepas
 Agua oxigenada o peróxido de hidrógeno (H2O2) para la prueba de catalasa
 Plasma citratado estéril y Cultivo líquido de 24 horas con la cepa de S. aureus para la
prueba de coagulasa
 1 tubo estéril para la prueba de coagulasa
 2 tubo con medio gelatina para observar hidrólisis de la gelatina de ambas cepas
 2 tubo con caldo nitrato para observar reducción de los nitratos de ambas cepas
 1 tubos con caldo manitol para observar fermentación del manitol en anaerobiosis
 1 tubo con caldo arginina para observar hidrólisis de la arginina
 2 tubos de 160 x 15 mm, con 10 ml de medio O - F (Hugh - Leiffson) para M. luteus
Metodología
Toma de muestra
Para Staphylococcus utilizar una torunda estéril para la toma de muestra de una pústula o
herida; Para Micrococcus utilizar recipientes o bolsas con cierre hermético para depositar la
muestra de tierra
Aislamiento de Staphylococcus y Micrococcus
 Preparar la muestra clínica utilizando un diluyente (SSF) si el caso lo requiere.
 Sembrar la muestra con el asa bacteriológica estéril en la superficie de los Medios sólidos:
agar sangre (AS), agar Chapman (A.CH.), o agar manitol salado utilizando la técnica de
agotamiento y estría en la superficie del medio
 Incubar las placas invertidas a temperatura de 37 OC por 24 horas. Las placas de agar
sangre deben incubarse dentro de la Jarra de Brewer.
 Observar las colonias características y anotar:

 Morfología de la colonia: forma, bordes, tamaño, pigmento, elevación
 Morfología de la bacteria (tinción Gram): Forma, disposición
 Reacción tintorial. (Gram Positivo)
 Hemólisis. Si es hemolítica anotar si es beta o alfa hemolítica
 Para aislar M. luteus, se requiere una muestra de tierra. Se prepara una suspensión con
agua destilada estéril o SSF. Se toma una asada de la muestra diluida y se procede a
sembrar en la placa con agar nutritivo. Incubar a 35°C por 24 horas y luego a temperatura
ambiente por 24 horas más, en ambiente aeróbico. Observar colonias pigmentadas
características y anotar su forma, elevación, bordes, aspecto, consistencia, etc.
 Seleccionar las colonias características y transferirlas a tubos o viales con agar cepa o A.N
Sembrar por estría en la superficie inclinada del medio para obtener un cultivo puro y
conservar la cepas en refrigeración.
 Sembrar la muestra de pus y de leche directamente en la superficie de los medios sólidos
agar sangre y agar Packer, agotando la muestra en un extremo de la placa y continuando la
siembra con el asa bacteriológica (técnica de agotamiento y estría). Con La muestra de
queso se prepara una suspensión y con el asa bacteriológica se toma el inóculo para la
siembra en la superficie del medio, agar sangre y agar Packer.
 Las placas se colocan invertidas dentro de la Jarra de Brewer y se incuban a 37C durante
24 horas en la estufa bacteriológica
 Transcurrido el tiempo de incubación, se evalúa el crecimiento bacteriano y se observa la

morfología de las colonias (forma, tamaño, color, aspecto, borde, constancia) de cada placa
y la actividad hemolítica
 Realizar la tinción de Gram de las colonias características para observar la morfología de las
células y su reacción tintorial
 Transferir 3 a 5 colonias características a tubos con caldo extracto de levadura triptosa.
Incubar a 37C por 24 horas. Sembrar una asada del cultivo líquido característico en tubos
o viales con agar tripticasa soya para obtener el cultivo puro.
 Del cultivo puro, realizar tinción de Gram, para observar las características morfológicas de
las células y su reacción tintorial
 Conservar las cepas
Identificación de las especies: S. aureus y M. luteus
 Prueba de catalasa:
Sobre una lámina porta objetos, limpia y desengrasada, colocar una gota de agua
oxigenada, luego añadir una porción de cultivo con un mondadientes. Observar la
reacción. Si la bacteria produce la enzima catalasa, se observa un burbujeo característico,
por descomposición del peróxido.
 Prueba de coagulasa
Esta prueba sólo es para S. aureus
En un tubo con caldo nutritivo, sembrar una asada de la cepa. Incubar a 37 OC por 24
horas. En un tubo estéril con 0,5 ml de citrato de sodio (anticoagulante), depositar 5 ml
de sangre extraída asépticamente. Centrifugar por 15 minutos a 2 000 rpm o dejar el tubo
en posición vertical en refrigeración por algunas horas. Separar el plasma (sobrenadante)
en un tubo estéril. Tomar 0,5 ml de plasma y colocar en un tubo estéril, luego añadir 0,5
ml de cultivo de 24 horas. Incubar a 37 OC durante 4 horas. Observar cada 30 minutos. Si
no hay cambio la prueba es negativa, si hay formación de coágulo, la prueba es positiva
 Fermentación del manitol en anaerobiosis

Sembrar la cepa en un tubo con caldo manitol. Incubar el tubo dentro de la Jarra de Bre-
wer a 37 OC durante 24 horas. Observar el desarrollo y la actividad fermentativa. Si fer-
menta el manitol, el indicador rojo de fenol del medio vira a un color amarillo debido a la
reacción ácida del medio.
 Prueba de hidrólisis de la gelatina
Esta prueba es para ambas cepas.

Sembrar la cepa en medio gelatina. Incubar a 37 OC por 48 horas y en refrigeración por 3
horas. Observar la reacción. Si actúa la enzima gelatinasa, se observa licuefacción de la
gelatina, el medio no solidifica a temperatura de refrigeración. La ausencia de enzima se
pone de manifiesto porque la gelatina solidifica a temperatura de refrigeración.
 Prueba de reducción de nitratos

Esta prueba es para ambas cepas
Sembrar la cepa en un tubo con caldo nitrato. Incubar a 35 OC durante 24 horas en jarra
de Brewer. Evaluar crecimiento y adicionar los reactivos A y B para nitratos. Observar el
cambio de color a rojo intenso si la prueba es positiva.
 Prueba de Hidrólisis de arginina

Sembrar la cepa en un tubo con caldo arginina. Incubar a 35 OC durante 24 horas en
ambiente aeróbico. Observar crecimiento y cambio del color del medio a rojo, cuando la
prueba es positiva indicando que la cepa ha producido descarboxilación del aminoácido
arginina. Si se ha producido la desaminación el medio se torna de color amarillo .
 Prueba de oxidación-fermentación (O-F)

Esta prueba es para M. luteus
Sembrar la cepa, por puntura, en dos tubos con medio O - F (Hugh - Leiffson) que contiene
glucosa como sustrato. A uno de los tubos adicionar 1 ml de parafina o vaselina fundida
estéril, para excluir el oxígeno. Taponar ambos tubos. Incubar los tubos a 35 OC por 48
horas. Observar acidez por oxidación de la glucosa, que se manifiesta por el viraje del
indicador púrpura de bromocresol a color amarillo en el tubo sin parafina. Indicar tipo de
metabolismo.
Los resultados de las pruebas para identificar las especies deben compararse con las
tablas de identificación (Manual Determinativo de Bergey)
S. aureus
1 2 3
Fig. 1. Colonias amarillas de S. aureus Fig. 2. S. aureus (derecha) colonias Fig.3. Observación microscópica de S.
manitol positivo doradas. S. epidermidis (izquierda) aureus: Cocos agrupados en racimos
colonias blancas
Prueba de nitratos
Micrococcus luteus
Fig. 1. Colonias con pigmento Fig.2 Colonias con pigmento Fig. 3. Distribución de las células de M
amarillo de M. luteus amarillo de M. luteus luteus en tétradas. Tinción de Gram
Fig. 4. Cepa de M. luteus Fig. 5. Prueba de O-F Glucosa Prueba de catalasa positiva (B)
Tarea
 Introducción
Indique la importancia de la práctica y las competencias
 Resultados
tablas
 Conclusiones
 Bibliografía
Cuestionario:
1. ¿Cree usted que las pruebas realizadas para identificar S. aureus son suficientes? ¿Por
qué?
2. ¿Cómo actúa la enzima catalasa de S. aureus? Efectúe la reacción.
3. ¿Por qué vira el indicador rojo de fenol del caldo manitol cuando desarrolla S. aureus
en anaerobiosis? Fundamente su respuesta bioquímicamente.
4. ¿Cómo reconoce que S. aureus produce coagulasa? ¿Qué ha sucedido?
5. ¿Qué otros medios de cultivo se puede utilizar para aislar S. aureus? ¿Por qué?
Práctica N° 4: Aislamiento e Identificación de los géneros: Streptococcus,

Lactococcus y Enterococcus
Introducción
Los géneros, Streptococcus y Enterococcus comprenden una variedad de especies con hábitat
muy diferentes, cuyas actividades son de importancia considerable para el humano. Algunas
especies son patógenas para humanos y animales. Las especies del género Lactococcus, se
encuentran en la leche y productos lácteos
Las bacterias miden de 0,5 a 1,0 m. de diámetro, no pasan de 2,0 um, son esféricas u ovoides,
se disponen en pares o cadenas de varias células. No forman endosporas y son Gram positivos.
Tienen requerimientos nutricionales generalmente complejos y variables, necesitan
aminoácidos, purinas, pirimidinas, péptidos, vitaminas y tensión de CO2 a excepción de S. bovis
que sólo requiere glucosa y amonio inorgánico para crecer. Son quimiorganótrofos y tienen un
metabolismo fermentativo cuyo producto final predominante es el ácido láctico. Algunas
especies fermentan ácidos orgánicos (málico y cítrico) y aminoácidos (serina y arginina).
La proporción de G+C contenido en su ADN, se encuentra en el rango de 33 - 42 moles %. Las

especies pueden diferenciarse en grupos más limitados por medio de pruebas fisiológicas
(Sherman, 1957) o en grupos serológicos de Lancefield por medio de reacciones de
precipitación. También es importante considerar la hemólisis en agar sangre para subdividir el
género en  hemolíticos,  hemolíticos o no hemolíticos.
Las bacterias del género Enterococcus miden de 0,5 a 1,0 m. de diámetro, no pasan de 2,0 um,
sus células son esféricas u ovoides, se disponen en pares o cadenas de cuatro células. No
forman endosporas y son Gram positivos. Tienen requerimientos nutricionales generalmente
complejos y variables, necesitan aminoácidos, purinas, pirimidinas, péptidos, vitaminas y
tensión de CO2 cuando se cultiva en agar sangre. Son quimiorganótrofos y tienen un
metabolismo fermentativo cuyo producto final predominante es el ácido láctico. La especie
representativa es E. faecalis.
El alumno:
 Aísla los géneros, Streptococcus, Lactococcus y Enterococcus de muestras de secreción

nasofaríngea, leche, quesos y heces utilizando medios de cultivos enriquecidos y selectivos.
 Identifica las especies S. pyogenes, L. lactis y E. faecalis mediante pruebas de crecimiento a
diferentes temperaturas, tolerancia a sal y pruebas bioquímicas.
 Utiliza correctamente las técnicas y claves para identificar especies S, pyogenes, L. lactis, E.
faecalis
Materiales
Aislamiento
 Muestra: Secreción nasofaríngea, leche y productos lácteos

 Medio de cultivo: agar sangre y agar Packer
 Hisopo estéril y asa bacteriológica
 Jarra de Brewer para incubación
 Tubos o viales con Agar Tripticasa Soya (ATS) para mantener la cepa
Identificación
 Lámina y reactivo peróxido de Hidrógeno para la prueba de catalasa

 Batería de Gram
 Tubos con caldo extracto de levadura triptosa a pH 7 para crecimiento a 10C y 45 C, y
para resistencia a la temperatura de 63 C por 30 minutos,
 Tubos con caldo extracto de levadura triptosa con 6.5 % de NaCl para prueba de tolerancia
a la sal,
 Tubos con caldo extracto de levadura triptosa a pH 9,6
 Tubos con caldo arginina,
 Tubos con leche tornasolada para prueba de reducción y coagulación
 Tubos con caldo bilis al 40%
 Tubos con caldo glucosa y lactosa
Metodología
Toma de Muestra:
Con hisopo estéril tomar muestra de secreción nasofaríngea. La muestra de leche, recogerla en
frasco estéril con tapa de rosca y los productos lácteos sólidos recogerlos en frascos estériles o
bolsas de plástico con cierre hermético.
Aislamiento Primario
 Con el hisopo estéril embebido de la muestra de secreción nasofaríngea y leche, sembrar

directamente en la superficie de los medios sólidos agar sangre y agar Packer, agotando la
muestra en un extremo de la placa y continuando la siembra con el asa bacteriológica
(técnica de agotamiento y estría)
 Las placas se colocan invertidas dentro de la Jarra de Brewer y se incuban a 37C durante
24 horas en la estufa bacteriológica
 Transcurrido el tiempo de incubación, se evalúa el crecimiento bacteriano y se observa la

morfología de las colonias (forma, tamaño, color, aspecto, borde, constancia) de cada placa
y la actividad hemolítica
 Realizar la tinción de Gram de las colonias características para observar la morfología de las
células y su reacción tintorial
 Transferir 3 a 5 colonias características a tubos con caldo extracto de levadura triptosa.
Incubar a 37C por 24 horas. Sembrar una asada del cultivo líquido característico en tubos
o viales con agar tripticasa soya para obtener el cultivo puro.
 Del cultivo puro, realizar tinción de Gram, para observar las características morfológicas de
las células y su reacción tintorial
 Conservar las cepas
Identificación de las especies
 Prueba de catalasa
 Crecimiento a 10C y 45C. Se realiza esta prueba en caldo extracto de levadura triptosa a
pH 7. Si hay crecimiento se observa turbidez del caldo después del período de incubación.
 Crecimiento a pH 9,6. Si hay crecimiento se observa turbidez del caldo después del período
de incubación
 Crecimiento en bilis al 40%
 Prueba de resistencia térmica a 63C por 30 minutos
 Fermentación de inulina, trehalosa, sorbitol
 Prueba de Hidrólisis de la arginina e hipurato de sodio
 Prueba de Voges Proskawer.
Comparar resultados con las tablas de identificación (Manual Determinativo de Bergey). Los
resultados de las pruebas para identificar las especies deben compararse con las tablas de
identificación (Manual Determinativo de Bergey)
Streptococcus pyogenes
Lactococcus lactis
Colonias de Lactococcus lactis Característica microscópicas de Cadenas de L. lactis
No hemolíticas L. lactis
Enterococcus faecalis
Diatribución de los cocos Reducción del Telurito
Tolerancia a 6,5 % NaCl

Tarea
 Introducción
 Resultados
tablas
 Conclusiones
 Bibliografía
Responder el Cuestionario:
1. ¿Qué pruebas de identificación utilizaría para reconocer sólo S. pyogenes?

2. ¿Qué ventajas le proporciona el agar Packer en el reconocimiento de los estreptococos?
3. ¿Qué diferencias morfológicas encuentra en los estreptococos, enterococos y lactococos
observados microscópicamente de una colonia y de un cultivo líquido?
Practica N° 5: Aislamiento e identificación de los géneros Bacillus y Clostridium
Introducción
Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium se encuentran ampliamente distribuidas en la

naturaleza, tanto en el suelo como en el agua. Incluyen especies patógenas como B. anthracis.
y C. tetani agentes causales de enfermedades en el humano y animales; muchos de los géneros
de las familias Bacillaceae y Clostridiaceae son saprofitos, importantes porque sintetizan gran
cantidad de enzimas y compuestos orgánicos de utilidad industrial
Ambos géneros Son bacilos Gram positivos formadores de endosporas. En el género Bacillus,
las endosporas no deforman el soma bacteriano con algunas excepciones como B. sphaericus,
B. polymyxa etc. La ubicación de la espora es central en B. anthracis, en el género Clostridium si
deforman el soma y es terminal en C. tetani. Son móviles por flagelos peritricos con excepción
de B. anthracis y C. perfringens que son inmóviles
B. anthracis es aerobio o anaerobio facultativo, catalasa positivo y C. tetani es anaerobio

estricto y catalasa negativo. Ambos necesitan una temperatura óptima de 30 a 37 C para
desarrollar además son muy activos metabólicamente. Sintetizan muchas enzimas para utilizar
los sustratos necesarios: carbohidratos, proteínas, aminoácidos como fuente de energía, de
carbono y de nitrógeno.
El alumno:
 Aísla B. anthracis, y C. tetani de muestras de tierra, tejidos de animales enfermos y
estiércol utilizando medios de cultivo enriquecidos para estudiar las características de
crecimiento y morfología celular.
 Identifica a B. anthracis, y C. tetani por medio de pruebas bioquímicas que ponen de
manifiesto las diferentes actividades metabólicas
Materiales
 Muestra: Suelo, tejidos de animales, estiércol,
 2 tubos de ensayo con agua destilada estéril o solución salina fisiológica para suspender las
muestras
 2 Tubos de ensayo para colocar 5 ml de la suspensión de la muestra y someterlo a

tratamiento térmico de 80 °C por 10 minutos
 Un vaso con agua helada para introducir la muestra caliente
 Pipetas de 1.0 ml para extraer la suspensión
 Placa con agar sangre, agar nutritivo y agar Clostridium
 Asa bacteriológica
 1 Vial con agar nutritivo inclinado para Bacillus y otro con agar Clostridium para cultivo puro
o cepa
 Jarra de Brewer y estufa bacteriológica regulada a 35°C
Identificación
 Lámina y peróxido de hidrógeno para prueba de catalasa,
 Tubo con medio SIM para observar movilidad motilidad,
 2 Tubos con Medio gelatina para observar hidrólisis
 2 Tubos con caldo glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y arabinosa para observar
fermentación
 2 tubos con caldo nitrato para observar reducción de los nitratos
Metodología
Preparación de la muestra
 Pesar 10 g. de muestra de tierra, adicionar 90 ml de agua destilada estéril o solución salina
fisiológica. Agitar fuertemente. Dejar reposar y separar el sobrenadante en un tubo estéril
 Llevar el tubo a un baño de agua hirviente a 80 C por 10 minutos. Enfriar bruscamente en

agua fría
 Con el estiércol, se prepara igual que con la muestra de tierra, con tejidos, se macera en
mortero o se lava con agua destilada estéril.
Aislamiento y Evaluación del crecimiento

 De las muestras tratadas se toma una asada y se siembra por estría en la superficie de los
medios con agar sangre y agar nutritivo para aislar B. anthracis y para C. tetani medio
Robertson para enriquecimiento. Se siembra utilizando una pipeta de 1.0 ml para tomar 0,2
ml y dejar el inóculo en el fondo del tubo, luego colocar una capa de parafina evitando
formación de burbujas, se tapa rápidamente.
 Incubar la placa de AN en aerobiosis y la de agar sangre con atmósfera de CO2 durante 24 y

el tubo con medio Robertson en Jarra de Brewer durante 72 horas.
 Observar las colonias de B. anthracis anotar sus características: irregulares, de 2 a 4 mm de
diámetro, filamentosas ("cabellera de medusa"), rugosas con tendencia a presentarse en
forma de coma. En agar sangre, las colonias no son hemolíticas
 Realizar la tinción de Gram de las colonias características para observar la morfología bacilar y
la reacción al Gram: Los bacilos grandes de extremos rectos cadenas enmarañadas, Gram
positivos, endospora circular de posición central corresponden a B. anthracis.
 Transferir una porción de la colonia examinada a un vial o tubo con AN y sembrar en la

superficie inclinada, incubar a 35°C durante 24 horas, se confirma con tinción de Gram la
bacteria, se ha obtenido el cultivo puro o cepa.
 La tinción de Gram del medio Robertson después de 72 horas de incubación, demuestra la

presencia de bacilos delgados con espora circular, terminal, Gram positivos.
 Sembrar el cultivo en una placa con agar Clostridium. Incubar en anaerobiosis por 24 horas.
Al cabo de ese tiempo hacer la descripción de la colonia característica y con aguja
bacteriológica transferirla a un vial o tubo que contiene el medio sin inclinar y utilizando la
técnica de puntura se siembra hasta el fondo del tubo. Tapar y sellar el vial, incubar por 24
horas en anaerobiosis
Se realiza las siguientes pruebas:
 Prueba de catalasa. Para B. anthracis la prueba es positiva y para C. tetani la prueba es

negativa
 Prueba de hemólisis. Se observa si hay formación de halo alrededor de las colonias
 Fermentación de los carbohidratos: Se observa si hay viraje del indicador rojo de fenol a
color amarillo en los tubos con los carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y
arabinosa después de un período de incubación.
 Prueba de reducción de nitratos. Se siembra una ansada de las cepas en caldo nitrato, se
incuba en anaerobiosis y luego del crecimiento se adiciona gotas de los reactivos A y B para
nitratos.
 Prueba de hidrólisis de gelatina, para determinar actividad
Comparar los resultados con tablas de identificación

Los resultados de las pruebas para identificar las especies deben compararse con las tablas
de identificación (Manual Determinativo de Bergey)
Bacillus anthracis
+ -
Clostridium tetani
Cultivo en Medio Robertson
Swarming producido por C. tetani Tipo de Flagelos de C. tetani Prueba del Indol
Tarea
 Introducción
 Resultados
tablas
 Conclusiones
 Bibliografía
1. ¿Qué características le permite diferenciar a B. anthracis de B. subtilis y C. tetani de C.

botulinum?
2. ¿Del conjunto de pruebas para la identificación, ¿cuál de ellas utilizaría para diferenciar
a B. anthracis de B. subtilis y a C. tetani de C. botulinum?
Práctica N° 6: Aislamiento e identificación de Lactobacillus delbruechii y L.

plantarum
Introducción
Los lactobacilos, son bacilos Gram positivos, que varían desde largos y delgados a cortos y
gruesos. Se disponen aislados, en pares o cadenas. Son inmóviles; catalasa negativos y
microaerofílicos, muy exigentes nutricionalmente, debido a que necesitan factores de
crecimiento.
Se hallan en los productos lácteos y en vegetales fermentados. Algunas cepas se emplean en la
preparación de productos fermentados, como L. delbruecki sub especie bulgaricus en la
preparación del yogurt, L. acidophilus en la preparación de leche acida, y otras especies
participan en la producción de col fermentada, ensilaje, etc.
Comprenden especies homofermentativas y heterofermentativas y la actividad óptica del ácido
láctico producido depende de la especie. Son bacterias acidófilas, utilizando esta propiedad
para preparar los medios selectivos para su aislamiento primario, como el agar ROGOSA y agar
acetato cuyo pH final es 5,5 siendo el agente selectivo el acetato.
Para identificar los aislamientos de Lactobacilos, se debe determinar primero a que grupo
fisiológico pertenecen, luego la condición de homofermentativo o heterofermentativo por la
capacidad para producir CO2 a partir de la glucosa en el medio semisólido de Gibson. Debe
determinarse además la capacidad de crecimiento a 15 C y a 45 C en caldo MRS. Otra prueba
importante es la capacidad para producir amoníaco a partir de arginina siendo ideal para esta
prueba el caldo MRS con 0,3% de arginina. Según la temperatura se clasifican en mesó filos y
termófilos.
El alumno:
 Aísla las cepas de lactobacilos de productos lácteos.
 Identifica L. delbrueckii y L. plantarum mediante pruebas de crecimiento, de tolerancia, de

resistencia y pruebas bioquímicas.
 Aplica correctamente las técnicas de aislamiento e identificación.
Materiales
Aislamiento
 Muestra: yogurt, leche fresca, quesos
 Medio de cultivo: caldo MRS y agar ROGOSA,
 Asa bacteriológica,
 Agua peptonada al 0,1%,
 Tubo de ensayo con agar ROGOSA.
 Jarra de Brewer
Identificación
 Lámina y solución de peróxido de hidrógeno para prueba de catalasa,
 Tubo con caldo MRS con NaCl 2% para prueba de tolerancia a sal
 Tubo con caldo MRS con NaCl 4% para prueba de tolerancia a sal
 Tubo con caldo MRS con 0,3% de arginina,
 Tubo con caldo MRS con 1% de glucosa,
 Tubo con caldo MRS con 1% de lactosa,
 Tubo con caldo MRS con 1% de sacarosa,
 Tubo con caldo MRS con 1% de manitol,
 Tubo con caldo MRS con 1% de arabinosa,

 Tubo con caldo MRS con 1% de esculina
Metodología
Enriquecimiento de Lactobacilos:
 Transferir 1 ml. de la muestra a un tubo con 10 ml. de caldo MRS (si es líquida) o pesar un
gramo y llevar a un tubo con 10 ml de caldo MRS
 Homogenizar la muestra
 Incubar el tubo a 37 C por 48 horas con una atmósfera de 5 % de CO2
 Confirmar crecimiento con una Tinción de Gram
Aislamiento de Lactobacilos
 Sembrar una asada del tubo de enriquecimiento en placa con agar ROGOSA aplicando la
técnica del agotamiento y estría
 Incubar la placa (colocada dentro de la jarra de Brewer) en la estufa bacteriológica a 37 C

por 48 horas
 Evaluar el crecimiento: colonias brillantes, convexas o lenticulares de 1 a 2 mm de diámetro
 Efectuar la tinción de Gram de las colonias características para observar la morfología

bacilar y reacción tintorial
 Repicar colonia característica a un tubo o vial con agar ROGOSA para mantener la cepa y
proceder a su identificación.
 Prueba de catalasa. Observar que la prueba es negativa
 Prueba de resistencia térmica a 65 C por 30 minutos. Observar si hay crecimiento
 Prueba de crecimiento a 45 C. Observar crecimiento de las cepas
 Prueba de tolerancia a la sal a las concentraciones de 2% y 4% de NaCl. Si tolera hay

crecimiento
 Prueba de fermentación de azúcares: glucosa, maltosa, lactosa, manitol y arabinosa.

Observar viraje del indicador a color amarillo si fermenta los carbohidratos.
 Prueba de hidrólisis de arginina con producción de amoníaco. Si la prueba es positiva se
observa color rojo intenso.
Lactobacillus delbrueckii
Enriquecimiento de
Lactobacilos
Fermentación de lactosa
Lactobacillus plantarum
Colonias pastosas Bacilos en empalizada
Tarea
 Introducción
 Resultados
tablas
 Conclusiones
 Bibliografía
 ¿Qué otros medios de cultivo se utiliza para el aislamiento primario de lactobacilos.

Fundamente.
 ¿Por qué se emplea para el aislamiento primario Agar ROGOSA?
 ¿Qué características le permite diferencias L. delbrueckii de L. plantarum?
Práctica N° 7: Aislamiento e identificación de los géneros Listeria y

Corynebacterium
Introducción
Las listerias, son bacilos Gram positivos cortos, regulares, no esporulados ni ramificados, con
extremos redondeados, de 0,4-0,5 x 0,5-2,0 m; se disponen aislados o en cortas cadenas. En
cultivos viejos pueden aparecer formando filamentos de 6 a 20 nm de longitud, no desarrollan
cápsula, pero son móviles por pocos flagelos peritricos, de 1 a 5 que le confieren movilidad a
28C mientras que las bacterias del género Corynebacterium son bacilos Gram positivos, cortos,
rectos o ligeramente curvos, plemórficos, delgados y a veces en forma de clava en un extremo;
pueden contener gránulos metacromáticos formando bandas o hileras. En frotís teñidos
aparecen en empalizada o como celulas individuales, formando ángulos agudos unos con otros,
en formaciones en ‘V’ o ‘L’, que son formas adoptadas después de la división celular en saltos.
Las colonias de Listeria son pequeñas, de 1 a 2 mm después de 24 a 48 horas de incubación,

lisas, al observarse a la lupa con epiluminación, con un ángulo de la luz de 45 a 60 se observan
reflejos de color azul verdoso sobre una superficie finamente granular. Su temperatura de
crecimiento está entre 30C y 37C, pero pueden crecer a 4C en pocos días.
Los bacilos de Listeria son anaerobios facultativos, quimioorganótrofos y tienen un

metabolismo fermentativo. Son catalasa positivos y oxidasa negativos. Las reacciones de Voges
Proskawer y rojo de metilo son positivas, hidrolizan la esculina en pocas horas pero no la úrea
ni la gelatina, no producen indol ni H2S. Producen ácido de D-glucosa y de otros azúcares. Los
bacilos de Corynebacterium igual que Listeria no forman esporas; son aerobios o anaerobios
facultativos, catalasa positivos con excepción de C. pyogenes y C. haemolyticum. Además no
producen cápsula y son inmóviles. En este género hay muchas especies saprófitas, otras
patógenas de humanos (C. diphtheriae), animales y plantas. Probablemente ampliamente
distribuidos en la naturaleza, son comunes en suelo y agua y residen en piel y mucosas de
humanos y animales
La naturaleza ubicua de Listeria, su capacidad para multiplicarse a temperaturas de

refrigeración, su tolerancia térmica y su resistencia a bajos pHs así como, su tolerancia a altas
concentraciones de sal, hacen difícil el control del potencial patogénico de estas bacterias en
los productos alimenticios.
Competencia de la Práctica
El alumno:
Aísla e identifica por lo menos una especie de Listeria y una especie de Corynebacterium
haciendo uso correcto de las técnicas de siembra, aislamiento e identificación
Materiales
Aislamiento
Género Listeria
 Muestra: carne de pollo, quesos, pescado
 Medio de cultivo: agar Listeria
 Agua peptonada al 0,1%,
 Tubo o vial con agar tripticasa soya
 Jarra de Brewer
Género Corynebacterium
 Muestra: secreción nasofaríngea,
 1 placa petri con medio Löffler (A.L.),
 1 hisopo estéril,
 1 tubo con agar suero--telurito.

Identificación
Listeria monocytogenes
 Batería de Gram,
 Una placa con agar sangre
 Tubo con caldo manitol
 Tubo con caldo hiputrato
 Tubo con caldo xilosa
 Tubo con caldo ramnosa
 Una placa con agar almidón
Corynebacterium diphtheriae
 1 Tubo con caldo nitrato
 2 tubos con medio O - F glucosa
 Tubos con caldo glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y xilosa
 1 tubo con caldo glucosao para la prueba de Voges - Proskawer
 1 tubo con medio gelatina,
 1 tubo con caldo urea,
 1 tubo con caldo arginina.
Metodología
Género Listeria
1. Enriquecimiento
 Preparar un homogenizado de la muestra con caldo de enriquecimiento de Listeria
utilizando 5 g de muestra con 45 ml de caldo.
 Incubar a 37 C durante 24 horas
 Confirmar crecimiento con una tinción de Gram

2. Aislamiento
 Sembrar una asada del cultivo líquido en la superficie del medio, agar Listeria aplicando la
técnica del estriado,
 Incubar la placa dentro de la jarra de Brewer en la estufa bacteriológica a 37 C por 48 horas
 Evaluar el crecimiento: Observar colonias convexas, de borde entero, de 0,8 a 1,0 mm de

diámetro, amarillas, brillantes.
 Hacer la tinción de Gram de las colonias características para observar morfología bacilar y
reacción tintorial
 Separar las colonias características a un tubo o vial con ATS para mantener la cepa y
proceder a su identificación.
3. Identificación
 Hacer una tinción de Gram de la colonia para observar los bacilos carácterísticos
 Hacer la prueba de catalasa para confirmar la positividad
 Determinar la hemólisis en la placa de agar sangre
 Hacer las pruebas de fermentación de los carbohidraatos: manitol, arabinosa, xilosa y

ramnosa y observar el viraje del indicador rojo de fenol a color amarillo si la prueba es
positiva
 Realizar las pruebas de reducción de los nitratos, de hidrólisis del hipurato y de

hidrólisis del almidón.
 Hacer las Pruebas de CAMP y de RM-VP
Género Corynebacterium
Identificación:
 Hacer la Prueba de catalasa
 Sembrar en una placa con agar sangre para observar el tipo de hemólisis
 Hacer la Prueba de Oxidación - Fermentación (O - F) de la glucosa
 Prueba de reducción del nitrato

 Prueba de fermentación de carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y

xilosa y observar el viraje del indicador rojo de fenol
 Prueba de Voges - Proskawer (V - P)
 Prueba de ureasa
 Prueba de la gelatinasa.
Comparar resultados con tablas de identificación (Manual de Bergey)
Listeria monocytogenes
Colonias de Listeria en agar Oxford Colonias de Listeria en agar sangre Tipo de movilidad deListeia
Pruebas bioquímicas en API-Listeria Cepa de Listeria

L. monocytogenes es Rhamnosa
positiva (amarillo) y xilosa negativo
(púrpura), mientras que L. inanovii
es inverso, rhamnosa negativo y
xilosa positivo
Corynebacterium diphtheriae
Colonias de C. diphtheriae telurito Bacilos irregulares en Tinción Cepa en medio Looffler

positivas Gram
Biotipo gravis Biotipo mitis Biotipo belfanti

Pruebas en el sistema API-Corynebacterium para identificar la especie
Tarea
 Introducción
 Resultados
tablas
 Conclusiones
 Bibliografía
1. ¿Por qué se emplea medio Löffler para aislar Corynebacterium? Fundamente.

2. ¿En qué otros medios podrían desarrollar Corynebacterium? ¿Fundamente?
3. ¿Corynebacterium produce hemolisinas solubles? Explique
4. Qué características hacen que Listeria sea considerada como un contaminante peligroso
de los quesos y otros alimentos?
5. Cree Ud. Que las pruebas utilizadas para la identificación de Listeria, son suficientes?
Explique.
Práctica N° 8: Aislamiento e identificación de los Género Mycobacterium,

Nocardia y Streptomyces
Introducción
El género Mycobacterium, agrupa a bacilos alcohol ácido-resistente ligeramente curvos o
rectos, con extremos redondeados. Ocasionalmente forman ramificaciones en los cultivos
viejos, no forman esporas, son inmóviles, aerobios, de metabolismo oxidativo. No se colorean
fácilmente con el método de Gram. La coloración diferencial de Ziehl-Neelsen se usa para teñir
estas bacterias, que aparecen como bastones teñidos de rojo brillante en un fondo azulado.
Algunas se tiñen irregularmente y aparecen como rosarios debido a su contenido de gránulos
de polifosfato y vacuolas. La especie más importante por su patogenicidad para el humano es
Mycobacterium tuberculosis.
Los géneros: Streptomyces y Nocardia, están representados por un gran número de especies
que habitan ambientes acuáticos (de agua dulce, mar) y terrestres (de preferencia alcalinos y
neutros). Se caracterizan por ser filamentosos, cada filamento mide de 0,5 - 10 m de
diámetro y tiene una longitud indefinida, no fragmentaria y muy ramificado en el género
Streptomyces y fragmentados en Nocardia. Los filamentos aéreos pueden ser rudimentarios o
extensos, y pueden presentarse en forma de espiral, hélices o con ramificaciones múltiples. En
éstos filamentos se originan las esporas denominadas "conidias", que se disponen a menudo en
cadenas. Las diferencias con la forma y disposición de los filamentos aéreos y las estructuras
que sostienen las esporas, se utilizan para diferenciar grupos de Streptomyces. En Nocardia las
esporas o conidias, se separan de los filamentos adoptando la forma cocoide o bacilar
Las conidias y los filamentos aéreos pueden ser pigmentados e influyen en el color típico de la
colonia madura. A veces los pigmentos se producen por el micelio del sustrato y colaboran con
el color final de la colonia. Las colonias crecen lentamente, requiriendo muchos días para
hacerse visible. Son pegajosas y se adhieren al agar a medida que los filamentos penetran en el
medio. Después de 7 a 10 días las colonias son opacas, compactas y tienen un aspecto
pulverulento.
En cultivos líquidos estacionarios, Streptomyces crecen en la superficie como una ‘estera’, que
luego se hunde por su propio peso. En cultivos aireados crecen como microcolonias esféricas y
no producen filamentos aéreos. El crecimiento se reconoce por su olor característico a
geosminas.
Son bacterias inmóviles, aerobias, catalasa y oxidasa positivas con un metabolismo respiratorio,
algunas hidrolizan la urea.
El alumno:
1. Aísla el Mycobacterium en medio Löwenstein – Jensen inclinado
2. Aísla los géneros Streptomyces y Nocardiia de suelos alcalinos, en medio de cultivo sólido.
3. Identifica las colonias y estructuras microscópicas de Streptomyces y Nocardia, por sus
características morfológicas.
Materiales
Género Mycobacterium
Tinción de Ziehl - Neelsen
 Colorante fucsina fenicada,
 Solución alcohol - ácido clorhídrico,
 Colorante azul de metileno,
 Mechero de alcohol,
 Pipetas
 Tubos de centrífuga estéril
 Un Tubo estéril.
Para tratamiento de la muestra de esputo de pacientes con tuberculosis
 Solución de HCl 4%,

 Solución NaOH 4%,
 Solución rojo de fenol estéril.
Aislamiento
Género: Mycobacterium
 1 tubo con tapa de rosca que contiene medio Löwenstein – Jensen inclinado
 Asa bacteriológica.
Géneros: Streptomyces y Nocadia

 Muestra: Tierra de cultivo
 Solución salina fisiológica estéril (S.S.F)
 1 frasco de vidrio estéril, con tapa de rosca
 1 placa con agar Streptomyces
 1 tubo con agar nutritivo
 1 tubo con caldo nutritivo
Identificación
 Agua oxigenada y lámina porta objeto,
 tubos con caldo arabinosa, galactosa, glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa, manitol, xilosa
 1 tubo con caldo urea
 1 placa con agar almidón
 1 placa con agar caseína

Metodología
Mycobacterium tuberculosis
Examen Microscópico Directo: Tinción de Ziehl - Neelsen
 Extender cuidadosamente la muestra de esputo, con el asa bacteriológica
 Fijar la muestra, al calor suave del mechero
 Cubrir la extensión con el colorante fucsina fenicada. Calentar la lámina hasta la emisión de
vapor; repetir 3 veces y luego dejar la lámina hasta completar 5 minutos.
 Lavar con agua corriente
 Eliminar el exceso de colorante r con alcohol - ácido clorhídrico
 Lavar la lámina con agua corriente
 Cubrir el frotis con azul de metileno y dejar 1 minuto
 Lavar la lámina con agua corriente
 Observar con objetivo de inmersión.
Cultivo
Preparación de la muestra: (Método de Petroff)
 Colocar en un tubo de centrífuga graduado, 1 volumen de esputo y 1 volumen de solución de

NaOH
 Incubar por 1 hora, retirando de la estufa a los 30 minutos para agitar fuertemente la
muestra del tubo,
 Centrifugar el tubo a 3000 rpm por 20 minutos
 Retirar el sobrenadante, en otro tubo
 Utilizar sólo el sedimento. Adicionar 1 - 2 gotas de solución rojo de fenol estéril. Neutralizar el
sedimento con HCl el color ámbar indicaque lq mezcla se ha neutralizado.
Aislamiento
 Sembrar la muestra neutralizada utilizando el asa bacteriológica, sobre la superficie inclinada
del medio Löwentein - Jensen
 Incubar el tubo con tapa de rosca floja, a 37 OC por 2 - 3 semanas
 Retirar el tubo y observar el crecimiento de colonias características: colonias secas,

amarillentas, lobuladas, de 2 - 3 mm de diámetro.
 Confirmar con la tinción de Zield-Neelsen
Géneros Streptomyces y Nocardia
Preparación de la muestra
En un frasco estéril pesar 10 g de muestra de tierra, adicionar luego 90 ml de S.F.F. Agitar el
frasco y dejar reposar.
Aislamiento primario
 Con el asa de Kolle estéril, tomar la muestra de la superficie y sembrar en la placa por la
técnica de agotamiento y estría en superficie dl medio
 Incubar la placa a 25 - 30 OC por 7 - 10 días en aerobiosis
 Observar el desarrollo bacteriano: colonias características de 2 - 4 mm de diámetro,

compactas, pigmentadas y con olor a tierra húmeda.
 Seleccionar la colonia, para observar su morfología microscópica, mediante la técnica de

tinción de Gram.
Aislamiento secundario
Repicar 2 colonias seleccionadas, con la morfología de Streptomyces y Nocardia en 2 tubos o
viales con agar nutritivo, para obtener los cultivos puros.
Identificación
 Prueba de catalasa,
 Prueba de acidez de los carbohidratos.
 Prueba de hidrólisis de la urea, almidón y caseína. Para el almidón utilizar gotas de lugol para
la lectura y para la caseína gotas de ácido ácido acético
 Prueba de resistencia térmica a 45°C

Comparar resultados con las tablas de identificación (Manual de Bergey)
Mycobacterium tuberculosis
Colonias de M. tuberculosis en tubo con medio Bacilos teñidos con Zield-Neelsen Disposición de bacilos
Lowenstein Jensen
Nocardia asteroides
Colonias opacas irregulares
Colonias en agar sangre Colonias irregulares en tubo inclinado Colonias en la superficie de

medio líquido
Género Streptomyces
Colonias blancas circulares
Filamentos reproductores
Colonias de S. coelicolor (sup) y Cepas en superficie inclinada de Filamentos reproductores

colonias circulares de Streptomyces sp mediosólido y en medio SIM espiralados
Tarea
 Introducción
 Resultados
tablas
 Conclusiones
 Bibliografía
1. ¿Por qué no se recomienda utilizar la técnica de tinción de Gram, para colorear

Mycobacterium?
2. ¿Por qué se emplea el medio Löwestein - Jensen, para su aislamiento?
3. ¿Qué diferencias morfológicas (macroscópicas y microscópicas) observó en
Streptomyces y Nocardia? Haga un cuadro comparativo
4. ¿Qué otras pruebas se pueden utilizar para identificar las especies de Streptomyces y
Nocardia? Indíquelas y explique porqué.
5. ¿Qué son las geosminas y que función cumplen?
Práctica N° 9: Aislamiento e identificación de los géneros Neisseria y

Pseudomonas
Introducción
Las bacterias del género Neisseria, son cocos Gram negativos, de 0,6 - 1,0 m de diámetro, que
se disponen en pares con los lados adyacentes aplanados, semejando la forma de un grano de
café o arriñonada. No forman esporas, la cápsula es variable, son aerobios y anaerobios
facultativos, oxidasa y catalasa positiva y son inmóviles. Son muy susceptibles a condiciones
cambiantes como desecación, enfriamiento, exposición a un pH desfavorable o a la luz solar.
Para su desarrollo algunas cepas requieren hierro y factores de crecimiento.
Este género tiene dos especies importantes por su patogenicidad: N. meningitidis y N.

gonorrhoeae, además de especies saprófitas, que habitan la región nasofaríngea.
El género Pseudomonas, agrupa bacilos Gram negativos, rectos o ligeramente curvados, no

formadoras de esporas, móviles mediante flagelos monotricos o lofotricos, o inmóviles (P.
mallei). Con frecuencia elaboran pigmentos difusibles, fluorescentes, de color verdoso, azulado,
violeta, lila, rosa, amarillo o de otros matices; algunas veces, los pigmentos son rojo brillantes o
amarillo no difusibles pero existen otras especies que no desarrollan ninguna pigmentación.
Son aerobio estricto, catalasa y oxidasa positivos. La mayoría oxidan la glucosa a ácido
glucónico, ácido 2-ceto glucónico y otros compuestos intermedios. Generalmente son inactivos
para la oxidación de la lactosa. Reducen con frecuencia los nitratos a nitritos, NH3 o a nitrógeno
molecular.
Las bacterias del género Pseudomonas se encuentran ampliamente distribuidos en la

naturaleza, habitando comúnmente el suelo y agua, inclusive el agua del mar y aún en
salmueras concentradas. Algunos son patógenos para las plantas, animales y el hombre; otras
son saprófitas y desempeñan un papel importante en la descomposición de la materia orgánica.
El alumno:
 Aísla e identifica una cepa de Neisseria reconociendo sus características

macroscópicas, microscópicas y fisiológicas
 Aísla e identifica Pseudomonas aeruginosa, de muestras clínicas (pus) o agua reconociendo

sus características macroscópicas, microscópicas y fisiológicas.
Materiales
Género Neisseria
Aislamiento
 Muestra: secreción nasofaríngea (SNF), líquido cefalorraquídeo, secreción uretral
 Agar chocolate o agar Thayer - Martin
 Jarra de Brewer
 1 tubo con medio de transporte: Medio Stuart,
 Hisopo estéril,
 Un tubo con agar tripticasa soya.
Identificación
 Lámina y solución de agua destilada para tinción de Gram
 Reactivo oxidasa
 Tubo con caldo nutritivo
 1 placa de agar sangre de carnero
 1 tubo con medio gelatina
 Tubo con caldo nitrato

 Tubos con medio semisólido de los carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y
manitol
 Placa con agar sacarosa al 5%
 1 placa con agar nutritivo
Género Pseudomonas
Aislamiento
 Muestra: pus (quemados), agua, suelo
 1 placa con agar glutamato o agar cetrimide
 1 tubo con agar nutritivo,
 Asa bacteriológica
Identificación
 Lámina porta objeto y agua oxigenada,
 2 tubos con medio O - F glucosa, maltosa, lactosa, manitol
 1 tubo con caldo nutritivo
 1 tubo con caldo nitrato
 1 tubo con medio LIA
 1 tubo con caldo RM-VP
 1 tubo con caldo TS con NaCl 6,5%
 1 tubo con medio gelatina
 1 tubo con caldo peptona
 1 tubo con medio gelatina.

Metodología
Género Neisseria
Aislamiento
 Sembrar una asada de la muestra en placa de agar chocolate, utilizando la técnica de

agotamiento y estría
 Incubar la placa a 37 OC durante 24 horas con atmósfera de CO2 al 5% (Jarra de Brewer),
 Observar las colonias características: 1 - 3 mm, lobuladas o circulares, brillantes,

transparentes u opacas, pigmentadas, de elevación media, mucoides o pastosas
 Transferir la colonia seleccionada en un tubo con agar tripticasa soya, incubar a 37 OC por
24 horas para obtener cultivo puro.
Identificación
 Hacer la prueba de oxidasa y de catalasa
 Realizar la prueba de hemólisis en agar sangre
 Hacer las Pruebas de acidez de los carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y
manitol
 Prueba de reducción de nitrato y prueba de gelatinasa
 Determinar el crecimiento de las bacterias a la temperatura de 22 OC
 Hacer la prueba de síntesis de polisacáridos, a partir de sacarosa al 5%; que consiste en:
Sembrar la cepa (técnica de siembra en superficie y en estría) en la superficie del medio
agar hipersacarosado (sacarosa al 5%), Incubar a 37 OC por 24 horas en aerobiosis.
Observar el crecimiento de colonias. Pipetear solución de lugol sobre el cultivo para
observar formación de polisacáridos (almidón) por el color rojo o azul oscuro del medio
que rodea las colonias.
Género Pseudomonas
Aislamiento
 Sembrar la muestra por la técnica de agotamiento y estría. Incubar 35 OC durante 24

horas. Observar: desarrollo de colonias características: circulares con producción de
pigmento de color azul, difusible en el medio.
 Efectuar tinción de Gram, para observar la morfología de la bacteria y la reacción tintorial.
 Repicar la colonia seleccionada en un tubo inclinado con agar nutritivo, para obtener cultivo
puro.
Identificación
 Hacer la prueba de oxidasa: Frotar una porción de colonia tomada con un palito
mondadientes en papel de filtro impregnado con la reactiva oxidasa. El color azul que
aparece en pocos segundos, indica que la prueba es positiva.
 Prueba de catalasa
 Prueba de acidez de los carbohidratos: OF glucosa, maltosa, lactosa y manitol.
 Observar prueba de crecimiento 42 OC. Se realizará en un tubo con caldo nutritivo. La

turbidez y pigmento confirma crecimiento
 Hacer las pruebas de reducción del nitrato, de lisina descarboxilasa (LIA), de Voges
Proskawer (VP), de arginina di hidrolasa, de gelatinasa
 Observar crecimiento 22 OC y crecimiento en caldo nutritivo con NaCl 6,5%,
 Prueba de indol.
Para la identificación comparar los resultados con las Tablas del Manual Determinativo de
Bargey
Neisseria meningitidis
Colonias de N. meningitidis a las 24 y 48 horas
Prueba de oxidasa Prueba de catalasa

Acidez glucosa y maltosa
Neisseria gonorrhoeae
N. gonorrhoeae en muestra clínica Colonias Observación microscópica

Prueba de oxidasa Prueba de catalasa Acidez de carbohidrato glucosa
Pseudomonas aeruginosa
Colonias con pigmento difusible
Pruebas bioquímicas Movilidad en medio SIM

Tarea
 Introducción
 Resultados
tablas
 Conclusiones
 Bibliografía
1. ¿Qué componentes del agar chocolate, permiten el desarrollo Neisseria? ¿Por qué?
2. ¿Por qué se emplea agar Thayer - Martin, para aislar Neisseria?
3. ¿Qué características le permiten diferenciar a Neisseria de otros géneros de la familia?
4. Fundamente la prueba oxidasa. Haga la reacción química.
5. ¿Es P. aeruginosa una bacteria exigente nutricionalmente? ¿Por qué?
6. P. aeruginosa produce acidez de la glucosa, ¿Qué vía metabólica sigue para obtener
energía de la glucosa? Haga el esquema bioquímico.
Práctica N° 10. Aislamiento e identificación de los géneros Azotobacter y

Rhizobium
Introducción
Las bacterias del género Azotobacter son bacilos grandes y gruesos que llegan a medir de 3 - 6
m de largo, con extremos redondeados, a veces formas ovoides y grandes, que se disponen
como diplobacilos gigantes. Tienden a presentar cambios ciclógenos, desde grandes formas
bacilares a cocoides. Se disponen aislados, en pares o en pequeñas cadenas. Las células están
rodeadas por una capa mucilaginosa de grosor variable, que se vuelve parduzca en cultivos
viejos. Son Gram negativos, móviles mediante flagelos peritricos o no móviles. Forman una
estructura no regular de resistencia, que recibe el nombre de ‘quiste’. Su hábitat natural son los
suelos neutros o alcalinos. Desarrollan a una temperatura óptima de 25 - 30 OC. Utilizan pocos
compuestos nitrogenados: N2, amonio, nitrato, nitrito, urea. Fija el nitrógeno de manera libre
En medios que contienen carbohidratos, desarrollan grandes cápsulas. El metabolismo de los

compuestos de carbono es oxidativo estricto
Las bacterias del género Rhizobium viven en el suelo, pero dada su movilidad, se aproximan a
las leguminosas apropiadas para infectarla y causar la formación de nódulos y participar en la
adquisición simbiótica del nitrógeno (N2). Presentan una variedad de formas durante su ciclo
vital; bastones móviles, formas cocoides, formas elipsoidales muy pequeños y altamente
móviles, bacteroides, formas irregulares en X y Y En cultivo puro, se observan como bacilos
desprovistos de esporas, Gram negativos, con tamaños que varían de 0,5 - 0,9 m de ancho y
de 1,2 - 3,0 m de largo, a veces capsulados y móviles, comúnmente poseen gránulos poli-B-
hidrooxibutirato. Móviles por un flagelo polar o subpolar o 2 a 6 flagelos peritricos. Es difícil el
cultivo de las bacterias en medios ordinarios, pero el desarrollo en agar manitol es rápido, con
tendencia a la diseminación. Las colonias son circulares, convexas, brillantes, semitranslúcidas
y mucilaginosas, usualmente de 2 a 4 mm de diámetro alrededor de 3 a 5 días. Son aerobias
estrictas, poseen un metabolismo respiratorio con oxígeno como aceptor final de electrones,
su temperatura óptima 25 a 30C. Utilizan la glucosa y en algunos casos otros azúcares,
produciendo acidez.
El alumno:
 Aísla e identifica Azotobacter, de suelos fértiles, en medios de cultivo libre de nitrógeno y

reconocer su crecimiento en medios sólidos y líquidos así como su fisiología
 Aísla Rhizobium, a partir de nódulos de leguminosas, aplicando correctamente las técnicas

de esterilización y tratamiento de los nódulos.
 Identifica por lo menos una especie de Rhizobium, por sus características morfológicas,
fisiológicas y de relación simbiótica.
Materiales
Género Azotobacter
Aislamiento
 Muestra: suelos neutros o alcalinos, de cultivo vegetales leguminosas
 1 tubo con 10 ml de caldo Azotobacter para enriquecimiento
 1 placa con agar Azotobacter
 1 tubo con agar Azotobacter.
Identificación
 1 tubo con caldo nutritivo,
 1 tubo con medio gelatina,
 1 tubo con caldo glucosa, maltosa, lactosa
 1 tubo con medio almidón.

Género Rhizobium
Aislamiento
 Muestra: Nódulos de raíces de leguminosas
 Solución al 0,1% de bicloruro de mercurio acidificado (HgCl2 = 1 g; HCl = 5 cc) y Etanol 95%,
 Agua corriente esterilizada
 Placa con agar extracto de levadura manitol, rojo de congo
 Asa bacteriológica.
 Tubo con agar extracto de levadura manitol para la cepa
Identificación
 1 placa con agar nutritivo,
 1 tubo con caldo glucosa, con caldo manitol y caldo lactosa
Metodología
Género: Azotobacter
Proceso de enriquecimiento:
 Pesar 1 g de suelo y colocarlo en el tubo con caldo Azotobacter; mezclar cuidadosamente y

dejar a temperatura ambiente por 2 a 3 días para su desarrollo
 Observar las características de crecimiento, en la superficie del medio. Realizar un frotís

para teñirlo por la técnica de Gram
 Observar microscópicamente las células de Azotobacter y su reacción tintorial.
Aislamiento:
 Sembrar el cultivo de enriquecimiento en placa con agar Azotobacter, por la técnica de

agotamiento y estría en la superficie del medio. Incubar a temperatura de 25 - 30 OC por 3 -
5 días
 Observar las colonias características, grandes, mucoides, brillantes, lobuladas semielevadas

 Efectuar la tinción Gram, de la colonia seleccionada, para estudiar la morfología de la

bacteria
 Repicar la colonia en un tubo con agar Azotobacter, para obtener un cultivo puro o cepa
Identificación:
 Observar crecimiento en caldo nutritivo.
 Realizar la prueba de hidrólisis de la gelatina y del almidón
 Determinar la fermentación de carbohidratos: glucosa, maltosa, lactosa.
Género: Rhizobium
Aislamiento
Obtención de nódulos
 Escoger plantas de leguminosas de mayor desarrollo, de color verde intenso, que en lo

posible sobresalgan del resto; extraerlas con cuidado, grandes, rojizos y turgentes.
 En el laboratorio, escoger los mejores nódulos de las raíces y separarlos con parte del pelo
radicular, con el objeto de facilitar su manipulación.
Tratamiento de los nódulos
Los nódulos seleccionados, deben colocarse dentro de tubos con tapa de rosca o frascos
para ser lavados enérgicamente, primero con agua corriente y luego con agua destilada,
con la finalidad de eliminar toda la tierra, luego proceder a desinfectarlos colocándolos en
placas estériles; Sumergirlos en alcohol de 95%, por algunos segundos, seguido en una
solución al 0,1% de bicloruro de mercurio acidificado durante 1 - 30 minutos, según el
tamaño y número de nódulos de 3 - 4 minutos. Lavar con agua corriente estéril, no menos
de seis veces y colocarlos en una placa.
Aislamiento
 Los nódulos desinfectados, se aplasta asépticamente con una pinza desinfectada, y el

jugo lechoso del nódulo se siembra en la superficie de una o dos placas con agar
extracto de levadura manitol. Incubar las placas a 30 OC por 3 - 5 días, dependiendo de

la velocidad de crecimiento de las bacterias.
 Observar las colonias características, relativamente grandes y gomosas y ligeramente
rosadas. De esta colonia, hacer un frotís y teñir por la técnica de Gram. Observar bacilos
Gram negativos, delgados y pequeños.
 De una colonia aislada y analizada, repicar a un tubo inclinado con agar extracto de
levadura manitol, registrando número de cepa, huésped y fecha de aislamiento, para
su conservación por uno o dos años a baja temperatura o en ambiente.
Identificación
 Observar si hay crecimiento en caldo nutritivo
 Hacer la prueba de acidez de glucosa, arabinosa y galactosa así como la prueba de

catalasa
 Prueba de crecimiento en 2% de NaCl
 Prueba de resistencia térmica a temperaturas de 39 a 40C.
Los resultados de las pruebas para identificar las especies deben compararse con las tablas de
identificación (Manual Determinativo de Bergey)
Azotobacter chroococum
Quistes de Azotobacter
Colonias de Azotobacter
Rhizobium leguminosarum
Raíz de leguminosa con nódulos Bacteoides de los nódulos Aislamiento de Rhizobium en

de Rhizobium medio BYMA
Bacilos de Rhizobium en tinción Bacilos Gram negativos de Colonia de Rhizobium

negativa Rhizobium
Tarea
 Introducción
 Resultados
Los resultados obtenidos de las cepas deben ser registrados en tablas. Interpretar las tablas
 Conclusiones
 Bibliografía
1. ¿Cree Ud. que los pasos descritos son los necesarios para el aislamiento de Rhizobium?
¿Por qué?
2. ¿Qué diferencias morfológicas encuentra en las bacterias del género Rhizobium de
nódulo y de cultivo puro? ¿Por qué?
3. ¿Cuáles son las características de crecimiento de Azotobacter en caldo ?
4. Al observar los quistes de Azotobacter ¿Qué diferencias encuentra con las endosporas?
5. ¿Qué diferencias morfológicas y reproductivas encuentra entre los Bacteroides de
Rhizobium y los rizobios en el nódulo de las leguminosas?
Práctica N° 11: Aislamiento e identificación de géneros de la Familia

Enterobacteriaceae
Introducción
La Familia Enterobacteriaceae agrupa especies bacilares Gram negativas, móviles por flagelos
peritricos o inmóviles (atricos) con un metabolismo fermentativo y oxidasa negativos.
Los bacilos suelen ser aerobios o anaerobios facultativos, no formadores de esporas; algunas
especies forman una amplia cápsula que se refleja en colonias mucoides y viscosas; otras son
hemolíticas en agar sangre, como sucede con cepas de Escherichia y Proteus. Rara vez producen
pigmentos bajo ciertas condiciones de cultivo, Serratia produce un pigmento rojo y Erwinia un
pigmento que va del crema al amarillo. En cultivos, las colonias muestran tendencia a ser lisas,
convexas, con bordes enteros, húmedos brillantes y de color grisáceo. Con frecuencia se
pueden observar colonias rugosas. Fermentan los carbohidratos, reducen los nitratos y algunas
especies hidrolizan la urea.
El alumno:
 Aísla por lo menos 2 cepas de la familia Enterobacteriaceae en medios de cultivo selectivo-

diferenciales, aplicando correctamente las técnicas de aislamiento
 Identifica por lo menos dos especies aplicando correctamente las pruebas bioquímicas y
tablas de identificación.
Materiales
 Muestra: aguas servidas, alimentos contaminados, refrescos contaminados
 1 tubo con caldo selenito o caldo tetrationato para enriquecimiento de la muestra
 1 placa con agar Mc Conkey y con agar Salmonella - Shigella (SS)
 Tubos o viales con agar nutritivo para conservar la cepa

 Tubos con agar TSI (triple azúcar y hierro)
 Tubos con agar LIA (agar lisina hierro)
 Tubos con caldo peptonado,
 Tubo con caldo RM - VP (caldo glucosa buffer fosfato).
 Tubos con caldo urea,
 Tubos con agar citrato
 Tubos con caldo nitrato
 Lámina y agua oxigenada,
 Reactivo oxidasa y Batería de Gram.

 Microscopio Compuesto
Procedimiento
Aislamiento
 Diluir la muestra sólida 1/10 en solución salina fisiológica estéril
 Sembrar con el asa bacteriológica por la técnica de estriado, la muestra diluida o la muestra
líquida, directamente en placas con agar Mc Conkey y agar salmonella-Shigella (S-S)
 Incubar las placas a 37 OC por 18 - 24 horas. Observar el crecimiento por el desarrollo de

colonias características. Seleccionar las colonias lactosa positivos (rojas) y negativas
(incoloras) para realizar una tinción de Gram y observar la morfología de las bacterias y su
reacción tintorial
 Repicar las colonias lactosa positiva y negativa en tubos con agar cepa o A.N. para
mantenerlos en cultivo puro.
Identificación
Fermentación de los carbohidratos glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa
 En medio TSI la siembra se hace por puntura y estriado en superficie inclinada. Se Incuba a
37 OC por 24 horas y se hace la lectura:
 Acidez, el indicador rojo de fenol vira a color amarillo. Se simboliza con la letra A
 La presencia de gas (burbujas de aire). Se simboliza su intensidad de 1+ a 4+

 La producción de hidrógeno sulfurado (H2S) se manifiesta por el color negro en el medio.
Se simboliza de acuerdo a su intensidad 1+ a 4+
 La alcalinidad en este medio se manifiesta por el cambio al color grosella y se simboliza
con la letra K
 Se interpreta de la siguiente manera:
A/A ++, - significa: Acidez en superficie inclinada, acidez en el fondo, gas positivo, e
hidrógeno sulfurado negativo.
K/A -, + significa: Alcalinidad en la superficie inclinada y acidez en el fondo, gas
negativo, e hidrógeno sulfurado positivo.
K/A ++, ++++ significa: Alcalinidad en la superficie inclinada y acidez en el fondo, gas
positivo 2+, e hidrógeno sulfurado positivo 4+. En estos casos el negro es tan abundante
que no es posible observar el color amarillo del fondo.
Prueba de utilización de la lisina
 Prueba de LIA. La siembre se hace por puntura y estría en la superficie inclinada. Se

incuba a 35 - 37 OC por 18 - 24 horas. Se hace la lectura:
Descarboxilación de la lisina, produce alcalinidad en todo el medio, se intensifica el
color violeta. Se simboliza K / K,
Desaminación de la lisina, empieza en la parte inclinada, virando a un color rojo ladrillo,
el fondo se torna amarillo. Se interpreta como lisina negativa y se simboliza R / A
 Negativos. Es decir no se producen las dos reacciones anteriores. Puede observarse
además violeta en la superficie y amarillo en el fondo;
 También se simboliza K / A; si es totalmente amarillo se simboliza A / A. En ambos casos
se interpretan como lisina negativa.
Pruebas de IMViC
Prueba de Indol
 Sembrar una asada del cultivo puro en caldo peptona. Incubar a 35°C durante 24 horas
 La lectura se hace por adición de 3 a 5 gotas del reactivo de Kovacs. Se interpreta:
Anillo rojo = Indol positivo.
Anillo marrón = Indol negativo.
Prueba de Rojo de Metilo (RM) y Voges Proskawer (VP)
Se siembra una asada del cultivo puro en un tubo con caldo glucosado, se incuba a la 35°C
El cultivo se divide en dos tubos, a uno se adiciona 3 - 4 gotas del reactivo Rojo de Metilo, y al
otro tubo 2 gotas del reactivo -naftol y 4 gotas de KOH luego se hace la lectura:
Rojo de Metilo +, si el cultivo se tiñe de color rojo intenso.
Voges Proskawer +, si el medio se torna de color rosado.
Prueba de utilización de Citrato
Sembrar la cepa por puntura y en la superficie inclinada. Incubar a 35 OC por 48 horas. Se

hace la lectura:
Utilización de citrato = medio vira a color azul.
No utiliza citrato = no desarrolla.
Prueba de ureasa
Sembrar la cepa en caldo urea. Incubar a 35°C durante 24 horas. Hacer la lectura
Ureasa positiva = medio vira a color grosella.
Ureasa negativa = medio vira a color amarillo.
E. coli, Sh. dysenteriae, S. typhi, P. mirabilis
IMViC para E. coli IMViC para Shigella Colonia de Proteus mirabilis
- + + - -
TSI Utilización del citrato
LIA
Práctica N° 12: Aislamiento e identificación de los géneros Vibrio y Aeromonas
Introducción
Las bacterias del género Vibrio, son bacilos Gram negativos rectos o curvados, de 0,5 a 0,8 um
de ancho x 1,4 a 2,6 um de largo, aislados o unidos formando espirales. Móviles por uno o más
flagelos polares los cuales son envueltos en una vaina continua con la membrana externa de la
pared celular, No forman esporas. No son capsulados. Crecen bien y rápidamente en los
medios de cultivo ordinarios; el agar sales biliares-citrato-tiosulfato (TCBS) es el medio que se
utiliza preferentemente para el aislamiento primario., son aerobios y anaerobios facultativos,
su temperatura optima varía considerablemente, todos crecen a 20C, más crecen a 30C, su
pH óptimo 7,0, pero pueden tolerar condiciones alcalinas con pH 9,5. Son oxidasa y catalasa
positivas. Muchas especies son sensibles al agente viiibriostático O/129. Se encuentran
ampliamente distribuidos como formas saprófitas en el agua dulce y salada y las formas
patógenas afectan al humano; entre éstas V. cholerae agente causal del “cólera” y V.
parahaemolyticus que produce “gastroenteritis”.
El género Aeromonas, comprende bacilos rectos de extremos redondeados miden de 0,3 a

1,0 m de diámetro y 1,0 a 3,5 m de largo; después de la división celular, se disponen,
aislados o forman cortas cadenas. Son Gram negativos, móviles mediante un flagelo, no
forman esporas y no son capsulados. Crecen en medios de cultivo ordinarios; no desarrollan
en agar TCBS. Son anaerobias facultativas, quimioorganótrofas con metabolismo respiratorio
y fermentativo; la temperatura óptima de crecimiento es de 22 a 28C, muchas especies
crecen bien a 37C. Fermentan los carbohidratos con producción de ácido pero no gas. Son
oxidasa y catalasa positivas, ureasa negativa, gelatinasa y DNAasa positivas, reducen los
nitratos y son resistentes al agente vibriostático 0/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropilptheridina).
Se encuentran con frecuencia en el agua dulce y de albañal. Algunas especies son patógenas
de ranas, peces y humanos. Las infecciones humanas se caracterizan por diarreas o
bacteriemias.
El alumno:
 Aísla e identifica dos especies de Vibrio en medio TCBS de muestra de agua de mar y agua
residual.
 Aísla Aeromonas en medio GSP de muestra de agua de mar y productos marinos e
identifica una especie aplicando pruebas bioquímicas.
Materiales
Género Vibrio
Muestra:
Heces de paciente con “cólera”, aguas servidas y agua de mar
Enriquecimiento:
Tubo con caldo peptona alcalina pH 8,5.
Aislamiento:
 Placa con agar TCBS
 2 Tubos o viales con agar tripticasa soya (ATS).
Identificación:
 Lámina y agua oxigenada para la prueba de catalasa
 2 tubos con medio LIA
 2 tubos con caldo arginina
 2 tubos con caldo peptona

 Reactivo de Kovac, para prueba del indol
 2 tubos con agar TSI para observar fermentación de los carbohidratos, glucosa, lactosa y
sacarosa
 2 tubos con caldo V-P (caldo glucosa fosfato),
 2 tubos con caldo peptona sin sal,
 2 tubos con caldo peptona con NaCl 3%,
 2 tubos con caldo peptona con NaCl 8%,
 2 tubos con caldo peptona con NaCl 10%
 2 tubos con caldo nitrato.
Género Aeromonas
Muestra:
Aguas servidas, heces humanas con diagnóstico de gastroenteritis
Aislamiento
 Placa con agar GSP
 Tubos con ATS
Identificación
 Lámina y agua oxigenada,
 Tubo con medio LIA
 Tubo con caldo arginina y 1 tubo con caldo peptona
 Reactivo de Kovac para la lectura de indol
 Tubo con caldo caldo glucosa fosfato, 1 tubo con medio gelatina
 Tubos con caldo glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa
 Tubo con caldo nitrato, 1 tubo con caldo urea y 1tubo con caldo peptona con NaCl 3,5%
Métodología
Aslamiento de V. cholerae y V. parahaemolyticus
Aislamiento directo
Sembrar la muestra directamente por la técnica de estría en la superficie del agar TCBS, Incubar
las placas a 37 OC por 24 horas.
Aislamiento indirecto
 Enriquecimiento
Sembrar la muestra en un tubo con 10 ml de caldo peptona alcalino pH 8,5. Incubar a 37 OC

por 8 horas, Observar crecimiento (turbidez).
 Aislamiento en placa:
Sembrar una asada de cultivo de 8 horas en la superficie del agar TCBS, por la técnica de
agotamiento y estría, Incubar la placa a 37 OC por 24 horas. Observar el crecimiento de
colonias características:
 Las colonias de V. cholerae, son amarillas, más intensa en la parte central; redondeadas,
cremosas, ligeramente convexas, de 2 - 3 mm de diámetro.
 Las colonias de V. parahaemolyticus, son verde azuladas, circulares de 2 mm de

diámetro, ligeramente convexas y cremosas
Las colonias características, se repican en tubos o viales con ATS inclinado, se incuban a la
misma temperatura del aislamiento para obtener un cultivo puro.
Identificación de las especies:

 Prueba de oxidasa y Prueba de catalasa
 Prueba del cordón (String test): Sobre una lámina, colocar una gota de desoxicolato de
sodio al 0,5%, Hacer una suspensión con una porción de colonia y observar.
 La prueba es positiva si la suspensión se vuelve viscosa y se observa la formación de
cordón al levantar suavemente el asa.
 Prueba de lisina descarboxilasa y Prueba de arginina di hidrolasa

 Prueba de indol
 Prueba de fermentación de carbohidratos (TSI) de glucosa, sacarosa y lactosa

 Prueba de Voges Proskawer (V - P) y Prueba de tolerancia a la sal. 0, 3, 8 y 10 %. Son
pruebas complementarias
Aeromonas hidrophyla
Aislamiento
Sembrar la muestra directamente por la técnica de estría en la superficie del agar GSP en placa.
Incubar a 37 OC por 24 horas. Observar el crecimiento de colonias características, amarillas
brillantes, lisas, circulares de bordes enteros y de 2 a 2.5 mm. Aislar las colonias características
en a ATS inclinado, incubar a la misma temperatura para obtener un cultivo puro.
Identificación:
 Hacer una tinción de Gram para observar la morfología microscópica y su reacción
 Prueba de oxidasa y Prueba de catalasa
 Hacer las pruebas del IMViC y pruebas de lisina descarboxilasa (LIA), arginina dihidrolasa
y gelatinasa
 Prueba de fermentación de carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa
 Prueba de reducción de nitratos y Prueba de tolerancia a la sal.
Vibrio parahaemolyticus
Colonias sacarosa negativas en TCBS TSI K/A
Vibrio Chalerae
Colonias sacarosa positivas Bacilos cortos Gram negativos Bacilos curvados, Gram negativos
con flagelo monotrico
Descarboxilación de la lisina TSI K/A Prueba de filamentosidad +

API Vibrio cholerae Oxidasa + Catalasa +
Aeromonas hydrophila
Colonias en agar GSP
Colonias con beta hemólisis
Pruebas bioquímicas para identificar A. hydrophila

Tarea
 Introducción
 Resultados
 Conclusiones
 Bibliografía
Responder el Cuestionario
1. Cómo diferencia las distintas cepas de Vibrio, en medio TCBS? Explique
2. ¿Pueden desarrollar otras bacterias en medio TCBS? ¿Por qué?
3. A parte de la muestra utilizada en la práctica, de que otras muestras puede aislar

Aeromonas?
4. Se puede aislar Aeromonas en los medios Mc Conkey y TCBS por qué?

Práctica N° 13. Aislamiento e identificación del género Halobacterium
Introducción
El género Halobacterium pertenece al dominio Archaea. Estas bacterias viven en ambientes
salinos con alta concentración de sal. Muchas de sus proteínas no funcionan en
concentraciones bajas en sal. Su pared celular es diferente a las del dominio BACTERIA, sus
membranas están constituidas por lipoproteínas Son aerobios obligados y requieren
aminoácidos para su crecimiento. Tienen forma de coco o de bacilo, y sus colonias son rojas o
púrpuras; son móviles. Se reproducen por fisión binaria
La temperatura óptima de Halobacterium es de 42 ºC. El genoma de una especie indeterminada

de Halobacterium ha sido secuenciado y consta de 2.571.010 pares de bases en un ADN
repartido entre tres filamentos circulares: un gran cromosoma de 2.014.239 pb y dos más
pequeños de 191.346 y 365.425 pares de bases. La especie, denominada Halobacterium sp.
NRC-1, se ha usado extensivamente para análisis pos genómico.
Las especies de Halobacterium se encuentran en el Gran Lago Salado, mar Muerto, y en otras
muchas aguas con altas concentraciones de sal. Las especies púrpuras deben su color a la
bacteriorodopsina, una proteína sensible a la luz que proporciona energía química a la célula
usando la luz del sol para desplazar protones fuera de la célula. La bacteriorodopsina es una
proteína químicamente muy similar al pigmento sensible a la luz rodopsina que se encuentra
en la retina de los vertebrados.
El alumno:
 Aísla una cepa de la familia Halobacteriaceae en medios de cultivo salinos aplicando

correctamente las técnicas de aislamiento
 Identifica una especie aplicando correctamente las pruebas bioquímicas y tablas de

identificación.
Materiales
Aislamiento
 Muestra: agua de salina, mar

 Tubo con medio de enriquecimiento: caldo extracto de lavadura con 10% de NaCl
 Placa con agar trpticasa soya con 10% de NaCl
 Tubo o vial con TSA con 10% de NaCl
Identificación
 Lámina y solución de peróxido de Hidrogeno
 Tubos con carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa, arabinosa, galactosa con NaCl
al 5%
 Tubo con caldo nitrato
 Tubo con medio LIA con sal
 Tubo con medio TSI con sal
 Tubo con caldo peptona con sal
Metodología
Enriquecimiento
 Sembrar 5ml de agua de salina en un tubo con caldo de enriquecimiento doble

concentrado. Mezclar convenientemente. Incubar a 35°C durante 48 horas
 Observar crecimiento (Turbidez)
 Teñir con la técnica de Gram y observar bacilos.
Aislamiento
 Sembrar con el asa bacteriológica por agotamiento y estría en la superficie del medio
sólido.
 Incubar la placa invertida durante 48 horas en aerobiosis
 Observar las colonias características: brillantes, lisas, con pigmentación roja, de bordes
enteros
 Hacer la Tinción de Gram para el estudio microscópico (Bacilos) y gota pendiente para
observar movilidad.
 Transferir una asada de la colonia a un tubo o vial. Sembrar en superficie inclinada. Incubar
a la misma temperatura y durante 24 horas confirmando la cepa con una tinción.
Identificación
 Realizar las pruebas de acidez de los carbohidratos, sembrando una asada de la cepa en los
caldos tripticasa soya con el indicador rojo de fenol y los carbohidratos glucosa, lactosa,
sacarosa, maltosa, arabinosa
 Prueba de reducción de los nitratos
 Descarboxilación de la lisina en medio LIA. La siembra de la cepa se hace con aguja

bacteriológica, por puntura y estría en la superficie inclinada.
 Hidrólisis de la gelatina, se toma una porción de la cepa con asa bacteriológica y se siembra
en el medio gelatina con sal. Se incuba a 35 °C por 24 horas y se observa la actividad
 Gota pendiente para observar la movilidad.
Los resultados deben ser comparados con las tablas de identificación (Manual de Bergey)
Halobacterium salinarum
Salina Colonias rojas de Halobacterim
Bacilos con tinción especial
Tarea
 Introducción
 Resultados
 Conclusiones
Dra. Olga Victoria Francia Arana

Docente Principal a D.E
Ciclo 2021-II
2022

Guía de Prácticas de Bacteriología - Ciclo 2022-I

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Guía de Prácticas de Bacteriología - Ciclo 2022-I

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dra. Olga V. Francia Arana

Práctica N° 1: Materiales y Equipos de Laboratorio ......................................................................................3

Práctica N° 1: Materiales y Equipos de Laboratorio

Placas Petri Láminas Pipetas

Tubos de ensayo Matraces Vasos de precipitación

Materiales de metal y equipos

Mechero Bunsen pHmetro Jarra de Brewer

Contador de colonias Gradilla para pipetas Gradilla para tubos

Cámara de Flujo laminar Estufa Refrigeradora

Balanza analítica Balanza analítica Microscopio binocular

Plumon negro marcador de vidrio

 Anexo. Explique por qué es importante el conocimiento de los materiales y equipos de

Práctica N° 2: Obtención de un cultivo Puro

 Muestra: tierra, agua, alimentos, secreción nasofaríngea (SNF), heces, sangre.

 Tubo con medio SIM

 Tubo con caldo nutritivo

 Lámina excavada y laminilla

Fig. 1. Cepario de bacterias

Fig. 2 Siembra por puntura

Fig. 4, 5 y 6. Colonias bacterianas observadas en placa después de un período de incubación

Fig. 6. Tipos de crecimiento de las bacterias en medio líquido

Práctica N° 3. Aislamiento e identificación de los Géneros: Staphylococcus,

La especie representativa del género Staphylococcus es S. aureus y del género Micrococcus es

 Placas Petri estériles,

 2 Tubos o viales con agar nutritivo o agar cepa.

Identificación Staphylococcus y Micrococcus

 Batería de Gram para reconocer la morfología celular de ambas cepas

 Agua oxigenada o peróxido de hidrógeno (H2O2) para la prueba de catalasa

Aislamiento de Staphylococcus y Micrococcus

 Preparar la muestra clínica utilizando un diluyente (SSF) si el caso lo requiere.

 Observar las colonias características y anotar:

 Morfología de la bacteria (tinción Gram): Forma, disposición

 Reacción tintorial. (Gram Positivo)

 Hemólisis. Si es hemolítica anotar si es beta o alfa hemolítica

 Transcurrido el tiempo de incubación, se evalúa el crecimiento bacteriano y se observa la

 Conservar las cepas

Identificación de las especies: S. aureus y M. luteus

 Fermentación del manitol en anaerobiosis

 Prueba de hidrólisis de la gelatina

Esta prueba es para ambas cepas.

 Prueba de reducción de nitratos

 Prueba de Hidrólisis de arginina

 Prueba de oxidación-fermentación (O-F)

Presentar el informe de práctica: y tener en cuenta las indicaciones siguientes:

Práctica N° 4: Aislamiento e Identificación de los géneros: Streptococcus,

La proporción de G+C contenido en su ADN, se encuentra en el rango de 33 - 42 moles %. Las

 Aísla los géneros, Streptococcus, Lactococcus y Enterococcus de muestras de secreción

 Muestra: Secreción nasofaríngea, leche y productos lácteos

 Lámina y reactivo peróxido de Hidrógeno para la prueba de catalasa

 Con el hisopo estéril embebido de la muestra de secreción nasofaríngea y leche, sembrar

 Transcurrido el tiempo de incubación, se evalúa el crecimiento bacteriano y se observa la

 Conservar las cepas

Identificación de las especies

 Crecimiento en bilis al 40%

 Prueba de resistencia térmica a 63C por 30 minutos

 Fermentación de inulina, trehalosa, sorbitol

 Prueba de Hidrólisis de la arginina e hipurato de sodio

 Prueba de Voges Proskawer.

Colonias de Lactococcus lactis Característica microscópicas de Cadenas de L. lactis

Diatribución de los cocos Reducción del Telurito

Tolerancia a 6,5 % NaCl