(Microsoft Word - Gu - 355a de PR - 341ctica Micro LL 2019 2020 Ciclo L

Universidad de Guayaquil
Facultad de Ciencias Químicas

Carrera: Química y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
Asignatura MICROBIOLOGÍA II
Campo de PRAXIS PROFESIONAL

formación
Código 064 Semestre Sexto Período 2019-2020 Ciclo C-I
Unidad 1. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Práctica 1: Bioseguridad y Normas en el laboratorio de Microbiología
Práctica 2: Planes de Muestreo y Toma de muestras
Práctica 3: Preparación de Medios de cultivos y Preparación de dilucione
diluciones
Práctica 4: Determinación de Aerobios Totales
Unidad 2. INFECCIONES E INTOXICACIONES. MICROBIOLOGÌA PREDICTIVA-ETAS

PREDICTIVA
Práctica 5: Determinación de Coliform
Coliformes Totales. Número más probable (NMP)..
Práctica 6: Determinación de E. coli (NMP)
minación de coliformes totales y E. Coli. (Petrifilm)
Práctica 7: Determinación
Práctica 8: Determinación de Enterob
Enterobacterias.
Unidad 3. MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA ALIMENTICIA

Práctica 9: Determinación de Staphylococcus
Práctica 10: Determinación de Hongos y Levaduras
Práctica 11: Análisis de Aguas. (Diversas metodologías )
Práctica 12: Determinación de Salmonella spp
Unidad 4. MICROORGANISMOS PATÒGENOS DE IMPORTANCIA EN LOS DIFERENTES

ALIMENTOS
Práctica 13: Pruebas Bioquímicas para Enterobacterias
Práctica 14: Determinación deVibrios
Vibrios
Practica 15: Pruebas de ambiente, superficies, manos y fosas Nasales
PRACTICA
#1 Bioseguridad y Normas
ormas en el laboratorio de Microbiología
Objetivos de la práctica de laboratorio

1.- Concientizar al alumno la importancia de la Bioseguridad en el Laboratorio
2- Actualizar y difundir las Normas y medidas de Bioseguridad
3- Establecer normas y medidas
edidas de Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología
Instrucciones o consideraciones previas

1.- Investigar y exponer las Normas de Bioseguridad y Trabajo en el Laboratorio de Microbiología.
(Entregar documento de evidencia de la investigación)
investigación).
2.- Investigar y exponer el significado del uso de colores y señales de seguridad en el laboratorio
de Microbiología.
3.- Establecer un cuadro de los grupos de riesgo de los agentes biológicos.
Reactivos de laboratorio
No aplica para esta práctica
Materiales de laboratorio
Equipos de laboratorio
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

Resultados obtenidos
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
1.- Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología y Biomedicina, 4th editions. CDC
2- http://www.ucv.ve/file
admin/userupload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_normas_de_bioseguridad.pdf
acia/catedraMicro/10_normas_de_bioseguridad.pdf
PRACTICA Planes de muestreo y tomas de muestras
#2
1.- Conocer cómo se debe hacer un muestreo representativo para su análisis
2- Determinar el tamaño de la muestra
3- Determinar la cantidad de unidades de cada lote que se deben inspeccionar
El estudiante
ante deberá investigar y exponer lo que es un plan de muestreo, diferentes planes de
muestreo.
Muestreo para análisis microbiológicos, obtención de la muestra. (El estudiante deberá presentar
el trabajo investigado en físico como evidencia).
No aplica para esta practica

Investigativo
Resultados obtenidos.
No Aplica para esta práctica
Conclusiones
Recomendaciones
No aplica para esta práctica-
Bibliografía
1-www.fda.gov
2-www.codexalimentarius.net
PRACTICA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS Y PREPARACIÓN DE DILUCIONES
#3
1. Aprender a preparar correctamente
rectamente los principales medios de cultivos, que se usan en el
laboratorio de Microbiología.
2. Conocer los diferentes tipos de medios de cultivos, su clasificación y su importancia en el
diagnóstico.
3. Preparar adecuadamente las muestras de los alimentos baj bajo
o estudio, así como las
diluciones que les permitan investigar su contenido microbiológico.
4. Determinar el número de diluciones adecuado, con base en las características y datos de la
muestra y de los microorganismos que serán investigados.

Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos
de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no
cambian de localización. El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para
el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se
quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay
microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y
microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o
sangre para crecer.
Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar presente
presentess en un alimento, que
van desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa
requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras
decimales para facilitar los cálculos.
Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir de ella, todas las necesarias para
poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones decimales consecutivas,
es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, según la carga
carga.
El estudiante deberá investigar los diferentes medios de cultivos, su formulación, su uso y su

preparación. (Deberá entregar el respectivo documento como evidencia del trabajo).
trabajo)
Beakers
Cilindros
Tubos
Espátulas
Varillas de vidrio
Hornilla
Balanza
Potenciómetro
Estufas

Dependerá del medio de cultivo que se prepare
Los resultados siempre serán medios de cultivos estériles.
Conclusiones
Las conclusiones serán de acuerdo a los medios preparados
Recomendaciones
Seguir las recomendaciones para la elaboración de los medios de cultivos.
Bibliografía
http://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/preparacion-de-medios-
de-cultivo
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasic-Diluciones_6526.pdf

PRACTICA Determinación de Aerobios Totales
#4
Objetivos de la práctica
áctica de laboratorio
1-Confirmar la presencia
ncia de este microorganismo que puede ser agente causal de intoxicaciones e
infecciones.
2- Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este
microorganismo.
3- Demostrar la contaminación n pos proceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o
con superficies inadecuadamente sanitizadas.

1.- Seguir las Normas de Bioseguridad establecidas.
2.- Cumplir con los tiempos establecidos de siem
siembras.
3.- Cumplir con las normas de asepsia requeridas para este tipo de trabajos.
Medio de cultivo PlateCount

Diluyente: agua peptonada al 0.1%
Agua Destilada
Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón

(se debe utilizar una pipeta para cada dilución) o pipetas automáticas
Pipetas Pasteur estériles
Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón (en caso que la muestra sea líquida.)
Propipeta.
Varillas de vidrio de 3.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas en ángulo
recto (forma de “L”), estériles (se debe utilizar una por dilución).
Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras, espátulas y
separador de huevo.
Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher
Motor para licuadora o Stomacher
Asa bacteriológica
Portaobjetos
Balanza gramera
Horno para esterilizar material de vidrio.
Autoclave
Baño de agua a ebullición
Incubadora a 35 ± 2°C
Actividades / técnica operatoria por desarrollar o procedimiento
Preparar la muestra de alimento traída según su tipo, si es líquido hay que homogenizar, si es
sólido hay que licuar o triturar la mezcal por trituración en vaso esterilizado de licuadora a una
velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos.
Luego preparamos las diluciones correspondientes, generalmente hacemos 6
Luego de hacer las diluciones, y de haber agregado los inóculos, pasamos a agregar a cada placa
el agar PlateCount, este debe estar a 45 – 46 ºC (10 a 15 mL. por placa).
Luego hacemos la mezcla (agar + inóculo).
La mezcla se realiza de la siguiente. Manera: hacer rotaciones 5 veces sentido horario, 5 veces de
abajo arriba, 5 veces anti horario y 5 veces derecha e izquierda.
Luego esperamos que solidifique el medio y luego incubamos a 29 – 31 ºC por 24h (dejamos una
placa control).
Realizamos las lecturas a las 24 y 48 h.
Se puede realizar un cómputo de recuento estándar en placa o computo estimado de recuento
estándar en placa.
Hay que elegir placas que tengan de 30 a 300 colonias.
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras, fotos
y otros que así se consideren)
Los resultados obtenidos, serán de acuerdo a la calidad microbiológica de la muestra
Conclusiones
Las conclusiones serán de acuerdo a la calidad microbiológica de las muestras y de acuerdo a lo

que establecen las Normas INEM o sus similares.
Recomendaciones
1.- Aplicar las Normas de Bioseguridad
2- Respetar los tiempos de siembras
3- Seguir las indicaciones en la preparación de los medios de cultivos
Bibliografía
AOAC Official Methods of Analysis (Laboratorio de Microbiología)

Bacteriological Analytical Methods On Line (BAM)
www.fda.gov
www.codexalimentarius.net
www.foodsafety.gov.
www.consumaseguridad.com.es
UNIVERSIDAD
NIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
REPORTE DE RESULTADOS
MUESTRA………………….. MARCA……………………
MÉTODO………………….. FECHA……………………..
RESULTADO……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES………………………………………………………………
CONCLUSIONES…………………………………………………………………
TECNICOS
ECNICOS RESPONSABLES:
PRACTICA COLIFORMES TOTALES. NMP

# 5- 6-7-8

1.-Determinar la Calidad Microbiológica del alimento
2- Determinar la presencia de Indicadores de contaminación fecal
3- Determinar la eficiencia de un proceso de producción

Los controles microbiológicos rutinarios para determinar la inocuidad de un alimento, se basan en
la búsqueda de microorganismos indicadores cuya presencia nos aporte información sobre la
posibilidad
ibilidad de encontrar microorganismos patógenos.
Los microorganismos indicadores son microorganismos que generalmente se encuentran en la

materia fecal del hombre y los animales, su presencia en los alimentos es una evidencia de que
están contaminados con n materia fecal de humanos u otros animales de sangre caliente y por
consiguiente con el microorganismo patógeno.
Entre los microorganismos indicadores de la calidad de los alimentos se encuentran los coliformes
totales. Del grupo coliformes forman parte llos coliformes fecales como Escherichia coli,
Enterobacter, Klebsiella Citrobacter, entre otros.
El microorganismo utilizado como indicador es Escherichia coli y su detección se puede hacer

mediante pruebas sencillas como: determinación del número más probable (NMP) de
coliformes totales y fecales o mediante filtración en membrana (muestras líquidas) usando
medios selectivos y diferenciales.
Caldo Bilis verde brillante.
Caldo EC
Agar EMB
Agua de peptona
Caldo RM – VP
Agar SIM
Agar Urea
Agar Citrato de Simmons
Pipetas automáticas
Tubos de vidrio
Campanas durhann
Cajas petri
Puntas
Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.

Incubadora a 35° ± 2,0ºC
Horno para esterilizar material de vidrio
Potenciómetro
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimientos
PRUEBA PRESUNTIVA
Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de

Asepsia
1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una distribución uniforme de
los microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar diluciones.
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL de la muestra
original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 ml de agua de peptona estéril, obteniendo de
esta manera una dilución de 10-1
4. Agitar el tubo de la dilución 10-1 y con otra pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL y llevarlo a
otro tubo con 9 mL de agua de dilución estéril para obtener una dilución de 10-2
5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilución de 10-3
O hasta donde sea necesario.
6. Inocular asépticamente con 1 mL de muestra por triplicado tubos de fermentación conteniendo
caldo lactosado o caldo lauryl-triptosa, a partir de las últimas 3 diluciones y conservar todas las
anteriores en refrigeración por si se requieren su utilización posterior.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24 horas.
8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos
positivos, es decir, con producción de ácido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y
producción de gas en el interior de la campana Durham.
9. Al hacer esta verificación es importante asegurarse que la producción de gas sea resultado de
la fermentación de la lactosa, en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo, y no
confundir con burbujas de aire.
10. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes de
proceder a la inoculación y desechar aquellos tubos cuyas campanas contengan burbujas de aire
o de alguna manera eliminar éstas y así poder utilizarlos.
11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas
confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarán en incubación 24
horas más.
13. Después de 48 horas (± 2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni producción de gas, los tubos se toman
como negativos.
INTERPRETACIÓN:
• Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA
DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
• Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán
convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes
Totales y Fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis
Verde Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C.
3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACIÓN:
1. Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo

anotar el número de tubos positivos para
2. Posteriormente hacer el cálculo del NMP.
3. Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuandose observe turbidez: Se
consideran NEGATIVOS, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP
4. Si todos los tubos dan negativos o todos dan positivos, con base en los grados de dilución
analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución menores
(mayores volúmenes de muestra) o mayores (menores volúmenes de muestra),
respectivamente.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C.
(Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44.5 ± 0.2 °C. y después de este período,
3. Observar presencia de turbidez y gas.
INTERPRETACIÓN:
1. Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, Si se

observaproducción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de
tubos positivos y establecer el código para posteriormente hacer el cálculo del NMP,
2. Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez:
3. Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto delcálculo del NMP.
4. Si todos los tubos dan negativos o todos dan positivos, con base en los grados de dilución
analizados, considerar la necesidad de repetir elanálisis a partir de grados de dilución menores
(mayores volúmenes demuestra) o mayores (menores volúmenes de muestra),
respectivamente.
y otros que así se consideren
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para ColiformesTotales y Fecales,
establecer los códigos correspondientes para calcular por referencia en las tablas estadísticas el
NMP de ColiformesTotales y Fecales en 10 g o mL de muestra.
En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para los
cálculos la siguiente ecuación:
Se puede hacer uso de la tabla de NMP, para obtención de los resultados.
CONCLUSIONES
Las conclusiones van a depender de la calidad microbiológica de la muestra analizada y de
acuerdo a la Norma INEN o su similar
RECOMENDACIONES
Las recomendaciones van a depender de la calidad microbiológica de la muestra
Bibliografía
Norma INEN
AOAC OfficialMethods of Analysis (Laboratorio de Microbiología)
www.fda.gov
www.foodsafey.gov
www.consumaseguridad.com.es
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
MUESTRA…………………..
UESTRA………………….. MARCA……………………
MÉTODO………………….. FECHA……………………..
RESULTADO……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES……………………………
OBSERVACIONES………………………………………………………………
…………………………………
CONCLUSIONES…………………………………………………………………
PRACTICA USO DE OTRAS METODOLOGÍAS. PETRIFILM
#4
( DETERMINACIÓN DE AEROBIOS)
Reducir tiempos y movimientos en el área de Microbiología.
La Placa Petrifilm® para el Recuento de Aerobios puede ser usada para enumerar aerobios
totales en todos los alimentos y cuenta con aprobaciones AOAC
AOAC-OMA
. Debido a que las colonias en la Placa Petrifilm® AC son de color rojo, se las puede diferenciar de
las partículas de producto que tienen forma irregular y color opaco.

Verificar el pH de las muestras antes d
dee inocular las Placas Petrifilm®. • Para productos ácidos,
ajuste el pH de la muestra diluida a un 6.5 - 7.2 con NaOH 1N para asegurar que vire a rojo.
Tiempo y temperatura de incubación:
Incube las Placas Petrifilm® cara arriba en grupos de no más de 20 piezas. El tiempo de
incubación y la temperatura varían según el método. Los métodos aprobados más conocidos son:
• AOAC método oficial 986.33 & 989.10 (leche y productos lácteos) Incubar 48 h ± 3 h a 32 °C ±
1°C. • AOAC método oficial 990.12 Incubar 48 h ± 3 h a 35 °C ± 1° C. • AFNOR método validado
3M 01/1-09/89
09/89 Incubar 72 h ± 3 h a 30 °C ± 1 °C.
1- Agua de peptona
2- Placas Petrifilm
1. Pipetas automáticas
2.Tubos
3. Fiolas
Balanza gramera
Stomacher
Estufa
Contador de colonias
La Placa Petrifilm® para recuento Aerobio permite el crecimiento de bacterias aerobias totales
(cuenta total en placa o aerobios mesófilos). La Placa Petrifilm® para Recuento de Aerobios
Totales (AC) es un sistema de medio de cultivo listo para ser empleado, que contiene nutrientes
del Agar Cuenta Estándar, un agente gelificante soluble en frío y tetrazoilo que facilita la
enumeración de las colonias.
y otros que así se consideren)
Los resultados serán de acuerdo a la calidad Microbiológica del alimento
Conclusiones
Las conclusiones serán de acuerdo a la calidad microbiológica del alimento
Recomendaciones
Aplicar las Normas de Bioseguridad
Respetar los tiempos de siembras de las muestras
Bibliografía
AOAC Official Methods of Analysis (Laboratorio de Microbiología)
Bacteriological Analytical Methods On Line (BAM)
http://solutions.3m.com.co/3MContentRetrievalAPI/BlobServlet?lmd=1332535872000&locale=es_C
O&as
MÉTODO………………….. FECHA……………………..
RESULTADO……………………………………………………………………
………………………………………………
…………………………………………………………………………………….
…………………………………….
…………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES………………………………………………………………
CONCLUSIONES…………………………………………………………………
Guía de Prácticas de Laborat
Laboratorio
Práctica Determinación De Staphilococcusaureus en alimentos

N° 9
1- Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este

microorganismo enterotoxigénico.
2- Demostrar la contaminación
ción postproceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o
con superficies inadecuadamente sanitizada.
3- Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones.
Los estafilococos son

on cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en
pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una
toxina altamente termoestable, así por ejemplo, Staphilococcusaureusproduce
produce 5 toxinas,
toxina que
pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo,
es catalasa positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones
aeróbicas, con la subsecuente liberación de ácido, principalmen
principalmente
te ácido acético con pequeñas
cantidades de bióxido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la
fermentación es el ácido láctico.
Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad,
temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos competitivos. Este último punto es
importante, ya que Staphilococcusaureus no es competitivo en presencia de otros
microorganismos.Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire,
polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por
ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados
lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal,
uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el
caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de
S.aureus,, sin embargo, al diluirse y neutra
neutralizarse
lizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo
suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c)
también se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas son
los principales reservorios de estos microorganismos.
Medios de cultivo y diluyentes
1. Agar Baird Parker
2. Emulsión de yema de huevo con telurito de potasio
3. Caldo infusión cerebro corazón (BHI)
4. Agua peptonada al 0.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2
Biológicos
1. Plasma de conejo o plasma humano con EDTA (O+) obtenido del banco de sangre.
1.-Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón (se debe utilizar una pipeta
para cada dilución) o pipetas automáticas.
1. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón (en caso que la muestra sea
líquida.)
2. Auxiliar de pipeta.
3. Matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad o frascos de vidrio de 500 mL de capacidad.
4. tubos 16 x 150 mm
5. cajas de Petri
6. Varillas de vidrio de 3.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas en
ángulo recto (forma de “L”), estériles (se debe utilizar una por dilución).
7. Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras,
espátulas y separador de huevo.
8. Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher
9. Motor para licuadora o Stomacher
10. Asa bacteriológica
11. Mecheros de Bunsen
12. Tubos de 13 x 100 mm
1- Balanza de precisión
2- Horno para esterilizar material de vidrio.
3- Autoclave
4- Incubadora a 35 ± 2°C
MÉTODO DE RECUENTO DE PLACA DIRECTA

PROCEDIMIENTO
Aislamiento y enumeración
1- Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estéril.
2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril.
3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estéril al 01% o solución amortiguadora de fosfatos 0.1M
de pH 7.2estéril.
4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a
velocidad mínima.
5. Realizar diluciones decimales hasta 10-3(el número de diluciones está en función de la
procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo
diluyente.
6. Por cada dilución que se va a sembrar, se transfiere asépticamente 1 ml de suspensión de
muestra a 3 placas de agar Baird-Parker, distribuyendo 1 ml de inóculo equitativamente a 3 placas
(por ejemplo, 0,4 ml, 0,3 ml y 0,3 ml
Nota Una alternativa para utilizar un menor cantidad de cajas de agar Baird-Parker consiste en
transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 a cajas de Petri con agar Baird Parker.
7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril,
en forma de “L”, iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en
superficie).
8. Mantener las placas en su posición hasta que el inoculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10
minutos aproximadamente.
9. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. durante 45 a 48 h.
10. Después de incubar, observar las colonias características de este microorganismo en el agar
Baird Parker (BP). Éstas se presentan como: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas
con diámetro de 1 a 2 mm, muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la
colonia.
11. Seleccionar las placas que contengan entre 20 y 200 colonias típicas de S. aureus, a menos
que sólo las placas con diluciones más bajas (> 200 colonias) tengan colonias con apariencia
típica de S.aureus. Las colonias de S. aureus son circulares, lisos, convexos, húmedos, de 2-3 mm
de diámetro en las placas sin aglomeración, de color gris a negro intenso, frecuentemente con
márgenes claros (blancuzcos), rodeados de zonas opacas y frecuentemente con una zona exterior
clara.
12. Si se observan varios tipos de colonias que parecen ser S. aureus en las placas
seleccionadas, haga el recuento del número de colonias de cada tipo y registre por
separado. Cuando las placas de la dilución más baja contienen menos de 20 colonias, éstas
pueden ser usadas. Si las placas que contienen más de 200 colonias tienen colonias con la
apariencia típica de S. aureus y las colonias típicas no aparecen en las diluciones más altas, se
debe utilizar estas placas para la enumeración de S. aureus, pero no se deben contarlas colonias
no típicas.
13. Seleccione más de 1 colonia de cada tipo contado y realice la prueba de producción de
coagulasa.
14. El número de colonias en las placas representadas por colonias que dan prueba de coagulasa
positiva se multiplican por el factor de dilución de la muestra.
15. Informe este número como número de S. aureus / g de alimento probado.
Pruebas bioquímicas.
Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.
1. Transferencia las colonias sospechosas de S. aureus en pequeños tubos que contienen 0,2-
0,3 ml de caldo infusión cerebro corazón (BHI).
2. Con una pipeta estéril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensión del microorganismo que
desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón, adicionar 0.2 mL de plasma de conejo. Dicho
plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril.
3. Incubar en baño termostático o en incubadora, entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. en
intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formación de coágulo, prolongar el período
de observación hasta por 24 h.
4. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de plasma
reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente añadir una gota de
cloruro de calcio al 5%; se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos.
Prueba de la enzima termonucleasa.

1. Calentar 0.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro
corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo.
2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana, del
punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. Incubar a 35ºC ± 2 ºC en cámara
húmeda, durante 4 a 24 h.
3. Después de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los orificios hechos
en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de ortotoluidina).
4. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del
orificio, en donde se inoculó, indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa.
5. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como indicador. De
encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente alrededor de la colonia, seguido
de un precipitado blanco.
1. El número de colonias en las placas representadas por colonias que dan prueba de
coagulasa positiva se multiplican por el factor de dilución de la muestra.
2. Informe este número como número de S. aureus / g de alimento probado
Conclusiones
1-
2-
3-
Recomendaciones
1-
2-
3-
Bibliografía
1- https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071429.htm
2- Técnicas para el análisis Microbiológico de Alimentos. Segunda Edición. Universidad
Nacional Autónoma de México. Facultad de Química, Departamento de Biología
MUESTRA…………………... MARCA……………………
MÉTODO………………….. FECHA……………………..
RESULTADO……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES………………………………………………………………
CONCLUSIONES…………………………………………………………………
Práctica N: Determinación de Hongos y Levaduras

10
1- Obtener mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y levaduras

presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano.
2- Explicar el fundamento del método de detección y cuantificación de mohos y levaduras en
alimentos.
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden

encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados.
Ciertas especies de hongoss y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin
embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su
crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los
alimentos
tos donde el crecimiento bacteriano es menos probable. Estas condiciones pueden ser
bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de
almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo
tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de
frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad
intermedia como las mermeladas, manjares, especias, e etc.
Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como carbohidratos incluyendo pectinas y
otros polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a
través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas
(micotoxinas)) y (b) habilidad para alterar sustratos no
favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos
olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos.
El término moho se suele aplicar para designar a cie
ciertos
rtos hongos filamentosos multicelulares cuyo
crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fácilmente por su aspecto
aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se
considera no apto para el consumo.
mo. La identificación y clasificación de los mohos se basa en
observaciones macroscópicas y microscópicas.
Propiedades fisiológicas. En comparación con la mayoría de las levaduras y de las bacterias, la
mayoría de los mohos necesitan menor cantidad de hum
humedad
edad disponible. Un porcentaje total de
humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedirá o
retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podrían considerarse mesófilos, es decir,
que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría
se encuentra alrededor de los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son
termófilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de
los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH
(pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. Son capaces de
utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos.
Poseen enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción industrial de las
amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas.
Levaduras y hongos levaduriformes.
El término levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino
unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemación o por fisión.
Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales. Las
levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y
quesos, también se utilizan en la obtención de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras
son perjudiciales cuando producen la alteración de los zumos de frutas, de los jarabes, de la
melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos.
Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación
microscópica. Su forma puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme, cilíndrica,
triangular e incluso alargada. La mayoría se reproducen asexualmente por gemación multicelular o
por gemación polar. Unas pocas especies se reproducen por fisión.
En los cultivos en placas de agar es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias
bacterianas; la observación microscópica de los microorganismos es la única forma segura de
diferenciarlas. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas; la
mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Son
oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos.
La mayoría de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen
mejor que la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de
solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo
la mayoría de las levaduras necesitan mayor humedad que los mohos. Para la mayoría de las
levaduras la Aw mínima de crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de
crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30°C y
una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las
especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los
azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas,
pueden oxidar los ácidos orgánicos y el alcohol.
FUNDAMENTO
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo
específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los
polisacáridos que contiene el medio. La hidrólisis de estos compuestos se efectúa por enzimas
que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH ácidos se
pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. Así mismo, la
acidificación permite la eliminación de la mayoría de las bacterias. Finalmente, las condiciones
deaerobiosis y la incubación a una temperatura de 25 1 ºC da como resultado el crecimiento de
colonias características para este tipo de microorganismos.
1. Agua de peptona al 0.1% o, solución amortig

amortiguadora
uadora de fosfatos de pH 7.2.
2. Agar papa dextrosa
3. Agar extracto de malta
4. Solución estéril de ácido tartárico al 10.0 %
1. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón

3. Matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad o frascos de vidrio de 500 mL de capacidad.
5. cajas de Petri
6. Utensilios estériles para la manipulación de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc
7. Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher
8. Motor para licuadora o Stomacher
omacher
1. Balanza de precisión
2. Horno para esterilizar material de vidrio.
3. Autoclave
4. Incubadora a 25 ± 2°C
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que
contenga 90.0 mL de una solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 o agua de peptona
al 0.1%.
2. Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un vaso de licuadora estéril o pasarla
a una bolsa de Stomacher er y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la licuadora a
velocidad mínima, o 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal.
3. De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que
contenga 9.0 mL de solución amor
amortiguadora
tiguadora de fosfatos de pH 7.2ó agua de peptona al
0.1%, agitar y repetir esta operación tantas veces como diluciones sean necesarias. Se
debe utilizar una pipeta estéril para cada dilución.
4. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de la
muestra, utilizando una pipeta estéril.
5. Fundir el agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estériles. Enfriarlos y
mantenerlos a 45°C.
6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4
mL de ácido tartárico al 10% esterilizado por filtración en membrana, o bien esterilizar la
solución a 121°C 1°C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0
mL del medio fundido y mantenido a 45°C se le deberá adicionar 0.3 mL del ácido.
7. En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa
acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45 °C. El tiempo
transcurrido entre la preparación de las diluciones y el momento en que es vertido el medio
de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.
8. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el
sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia adelante,
sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja
de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejándolas reposar sobre una
superficie horizontal fría.
9. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verterá en una caja de
Petri sin inóculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de
malta acidificado. Después de la incubación estas cajas no deberán presentar desarrollo de
colonias.
10. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 °C.
11. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5
días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las
cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas,
considerar la cuantificación de 4 días de incubación o incluso las de 3 días. En este caso,
se informa el período de incubación en los resultados de los análisis.
12. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 3, 4 y 5 días de incubación (a
25 ± 1ºC o a temperatura ambiente).
13. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el
informe. Multiplicar por el inverso de la dilución.
14. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos
y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 25 1 C durante 5 días.
15. Describir las características macroscópicas observadas, de los mohos y/o levaduras
desarrollados a partir de la muestra analizada.
16. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difícil contar las
colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 días de incubación y
aún a los 3 días. En este caso se debe informar el periodo de incubación de 3 ó 4 días, en
los resultados del análisis.
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Para hacer un reporte cuantitativo de este análisis, se deben seleccionar las placas que contengan
entre 10 y 150 colonias (representat
(representatividad
ividad estadística). Posteriormente, contar las colonias
presentes y calcular el número de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede
calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado
físico de la muestra
uestra analizada. Esto se logra multiplicando el número de UFC encontradas en una
caja representativa, por el inverso de la dilución correspondiente a esa caja.
En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se
debe reportar el número obtenido de UFC indicando la dilución correspondiente.
En el caso de no encontrar colonias características de hongos y/o levaduras, el resultado a
reportar es: menos de 10 UFC/g o bien menos de 10 UFC/mL (Sensibilidad del Método)
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar el tiempo de incubación en el que se
realizó la cuantificación.
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar por separado el resultado de la
cuantificación de hongos y de levaduras.
ANÁLISIS CUALITATIVO
Reportar las observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes tipos de colonias de
mohos y levaduras obtenidas durante el análisis. Si es posible reportar el o los géneros probables.
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
1- Técnicas para el análisis Microbiológico de Alimentos. Segunda Edición. Universidad Nacional
Autónoma de México. Facultad de Química, Departamento de Biología
MÉTODO………………….. FECHA……………………..
RESULTADO……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES………………………………………………………………
CONCLUSIONES…………………………………………………………………
Práctica N: Determinación de Salmonella spp

12 - 13
1. Describir la metodología llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la

detección, aislamiento e identificación de Salmonella spp. en muestras de alimentos.
Instrucciones o consideraciones p
previas
Salmonella spp.. es un bacilo Gram Gram-negativo

negativo anaerobio facultativo perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae.. Aunque los miembros de este género son capaces de moverse por medio de
flagelos perítricos, existen variantes no móviles, S. entérica serovarPullorum Pullorum y S. entérica
serovarGallinarum,, así como cepas no móviles debido a la presencia de flagelos disfuncionales. Las
especies de Salmonella son quimioorganótrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las
vías fermentativa y respiratoria.. Las bacterias crecen óptimamente a 37°C y pueden catabolizar la D-D
glucosa y otros carbohidratos con producción de ácido y gas. Estos microorganismos son oxidasa
negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como única fuente de carbono, generalmente
producen ácido sulfhídrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayoría de
estas características se utilizan para la identificación bioquímica de cepas aisladas de Salmonella.
De acuerdo con la definición contemporánea, una cep cepaa de Salmonella típica produce ácido y gas a
partir de la glucosa en el agar hierro tres azúcares, pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa
en éste medio, o en medios sólidos selectivos tales como verde brillante, xilosa lisina desoxicolato
y/o entérico
rico de Hektöen. Las especies típicas de Salmonella producen en agar hierro lisina, una
rápida reacción alcalina por la descarboxilación de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad
genética observada en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e
intergenérico de plásmidos lo cual ha reducido los biotipos típicos de Salmonella. En muestras
clínicas y de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la
lisina, que incluso hidrolizan la urea, q
que
ue producen indol y que crecen rápidamente en KCN. Esta
situación ha llevado a reevaluar el esquema de identificación del género, e incluso a utilizar
tecnologías moleculares para establecer loci genéticos y/o productos únicos para el género
Salmonella.
FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un

esquema general que consiste de 5 pasos básicos:
Preenriquecimiento,, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no
selectivo, que permite restaurar
taurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una
condición fisiológica estable.
Enriquecimiento selectivo,, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones,
por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonel
Salmonella
la y por otro inhibir otros microorganismos
presentes en la muestra.
Siembra en medios sólidos,, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios
selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el
reconocimiento visual característico de colonias sospechosas.
Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de
Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.
Serotipificación, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la identificación
específica de un microorganismo.
Los medios de cultivo que a continuación se presentan son los utilizados en el procedimiento
general.
1. Caldo lactosado o Agua de peptona bufferada
2. Caldotetrationato
3. Caldo RappaportVassiliadis
4. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
5. Agar entérico de Hektöen (HE)
6. Agar sulfito de bismuto (SB)
7. Agar hierro-triple azúcar (TSI) o agar hierro Kligler (KIA) solidificado e inclinado
8. Agar hierro-lisina (LIA) inclinado.
9. Agar urea
10. Agar SIM (sulfuro-indol-motilidad)
11. Agar citrato de Simmons inclinado
12. Caldo rojo de metilo-VogesProskauer (RM-VP)
13. Solución de verde brillante al 0.1%
14. Soluciónyodoyoduro de potasio
15. Reactivo de Kovac’s
16. Solución de rojo de metilo.
17. Solución reactivo de Voges-Proskauer N° 1 (VP1; solución etanólica de alfa-naftol al 5% P/V)
18. Solución reactivo de Voges-Proskauer N° 2 (VP2; hidróxido de potasio al 40% P/V).
1. matraz Erlenmeyer de 500 mL de capacidad o frasco de vidrio de 500 mL de capacidad
2. Funda de stomacher (funda estéril) o un vaso de licuadora estéril
3. Utensilios necesarios para la manipulación de muestras: cucharas, cuchillos, tenedores,
estériles
4. tubos de ensayo de 16 x 150 mm.
5. cajas de Petri estéril.
6. tubos de ensayo de 13 x 100 mm.
7. Pipetas de vidrio de 1 mL estériles con filtro de algodón
10. Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón
11. Asa de inoculaciónredonda
12. Asa de inoculación en punta
2. Stomacher o motor para licuadora
3. Incubadora a 35°C Incubadora a 42°C
PROCEDIMIENTO
El siguiente método se basa en el análisis de 25.0 g de la muestra, que se considera como una
unidad analítica, en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variar siempre que
se mantenga la misma proporción de 1:9 en el medio de preenriquecimiento. La mínima muestra
recomendada es de 25.0 g, es decir, una unidad analítica. Para algunos casos donde el riesgo es
mayor, se utilizan dos unidades analíticas (50.0 g) o más.
1. Preenriquecimiento.
a. Procedimiento general para la preparación de muestras
b. Pesar en una bolsa de Stomacher estéril, en área aséptica 25.0 g de muestra a analizar.
c. Verter 225.0 mL de caldo lactosado estéril en la bolsa.
d. Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg
e. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con
tapón de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura ambiente con la tapa
perfectamente cerrada.
f. Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH.
g. Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8 ± 0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estériles.
h. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz
i. Incubar la muestra homogénea a 35 ± 2 °C durante 24 h.
2. Enriquecimientoselectivo.
a. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y
agitar suavemente.
b. Transferir 1.0 mL del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de 1 mL, estéril)
a un tubo con 10.0 mL de cada uno de los siguientes medios de enriquecimiento: Caldo
tetrationato (antes de su uso, deberá activarse añadiendo al medio base 0.2 mL de solución
yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solución de verde brillante al 0.1 %) y Caldo Rappaport-
Vassiliadis.
c. Incubar los tubos inoculados en caldo tetrationato y caldo Rappaport- Vassiliadis a 35 ±1 °C
durante 24 h. Para alimentos altamente contaminados deberán incubarse los medios de
enriquecimiento a 42°C por el mismo periodo
3. Siembraenmediosselectivos
La metodología descrita deberá realizarse para cada uno de los caldos de
enriquecimiento descritos anteriormente, es decir para los cultivos desarrollados en
caldo, caldo tetrationato y/o caldo Rappaport- Vassiliadis.
a. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado.
b. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiológica estéril y sembrar por
agotamiento en cajas de Petri, en cada uno de los siguientes medios selectivos:
• Agar SulfitoBismuto (SB)
• Agar Xilosa Lisina Desoxicolato(XLD) y,
• Agar Hektoenenteric
c. Incubar las cajas ya sembradas en posición invertida a 35 ±2 °C durante 24 2 h.
d. Observar las características macroscópicas de las colonias en los medios sólidos selectivos.
e. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de acuerdo con las
características específicas de desarrollo en cada uno de los medios.
MEDIO SELECTIVO Color antes de la Características coloniales de
inoculación Salmonellaspp.
Agar Sulfito Bismuto (SB) Opaco, verde pálido Café, grises o negras; con o sin
brillo metálico. Algunas veces
presencia de halo café o negro.
Agar Xilosa Lisina Claro,
aro, color rojo brillante Rosas o rojas pueden ser
Desoxicolato (XLD) transparentes, con o sin centro
negro. En algunos casos
completamente negras.
Agar Hektoenentérico Oscuro, color verde Verdes o azul verdes con o sin
centro negro. En algunos casos
completamente negras
negra
f. Almacenar en refrigeración de 5 a 8°C, las placas con medios selectivos por si es necesario
tomar más colonias.
g. Realizar una purificación de las colonias seleccionadas, sembrando nuevamente por
agotamiento en cajas de Petri conteniendo un medio idént
idéntico
ico del que se tomó la colonia.
4. Pruebasbioquímicaspreliminares
NOTA
Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analítica (25.0 g). Seleccionar colonias
procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
4.1. Agar triple azúcar hierro
1. istrar las características del medio TSI antes de la inoculación (color del medio).
Registrar
2. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa
bacteriológica recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar
azúc
hierro (TSI) inclinado.
3. Incubar el medio TSI a 35 ±2 °C durante 24 h.
4. Consultar la tabla para la interpretación de los resultados.
4.2. Agar lisinahierro.
1. Hacer la misma operación que se hizo para TSI,tomando la asada de la misma colonia
con la quee se sembró en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA).
3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella
en los medios TSI y LIA para
a realizar las pruebas bioquímicas complementarias.
4. Los cultivos desarrollados en TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan
reacciones en LIA típicos deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en
estos casos, el medio LIA permi
permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que
utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestre reacciones
atípicas en ambos medios.
5. Pruebasbioquímicascomplementarias
5.1. Caldo urea (convencional)
1. Con asa bacteriológica

iológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo TSI e inocular en el
tubo con caldo urea.
2. Incubar a 35 ±2 °Cdurante 2 24 ±2 h.
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conse
Conservar
rvar los cultivos que den la
prueba negativa.
5.2. Agar citrato de Simmons
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI e inocular por
estría en el tubo con agar citrato de Simmons.
2. Incubar a 35 ±2 °C durante 24 ±2 h.
3. Interpretar
etar los resultados (Consultar tabla).
5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad)

movilidad)
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI e inocular por
punción vertical en el tubo con medio de SIM.
2. Incubar a 35 ±2 °C durante 24 ±2 h
3. Para verificar
erificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente
crecimiento de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovac’s.
4. Interpretarresultados (Consultartabla).
VP (Rojo de metilo
5.5. Caldo RM-VP metilo-VogesProskauer)
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI e inocular el tubo con caldo
RM-VP.
Proskauer (VP)
5.5.1. Prueba de Voges-Proskauer
1. Para la prueba de Voges

Voges-Proskauer incubar a 35 ±2 °C durante 48 2 h. h
2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estéril un mililitro de cultivo
cultivo.
3. Adicionar a este cultivo, 0.6 mL de reactivo de VP1 (alfa
(alfa-naftol
naftol etanólico al 5 %), agitar
y agregar 0.2 mL del reactivo VP2 (hidróxido de potasio al 40%).
4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).
5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto que la
reacción se lleve a cabo en presencia de oxígeno.
6. Interpretar los resultados después de 2 h. de incubación a temperatura ambiente
(Consultar tabla).
5.5.2.
.5.2. Prueba de Rojo de Metilo
1. Para la prueba de rojo de me metilo (RM) incubar a 35 ±2 °C el resto del medio RMVP
durante 48 h más (96 h. de incubación en total a partir de la inoculación del medio RMVP).
2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora de rojo de metilo.
3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar tabla).
Las pruebas bioquímicas se pueden interpretar en la siguiente tabla, sin embargo se sugiere
que se consulten otras referencias, además de las ya expresadas aquí, con el fin de
determinar la especie del género en cuestión, esto quiere decir que no necesariamente se
encuentre en el alimento analizado la Salmonella,, pero sí puede encontrarse otra
Enterobacteria,, el que es indispensable identificar.
En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioq

bioquímicas
uímicas más generales de
Salmonella.
Medio a Color antes de Color después de

Resultado
inocular/incubar inocular/incubar
TSI: + Naranja Fondo tubo amarillo
Fermentación Glucosa Crecimiento
TSI: -c Naranja Pico de flauta naranja.

Fermentación Lactosa Crecimiento
TSI: Producción de H2S + Naranja Ennegrecimiento Crecimiento
Agar LIA: Lisin- + Púrpura tenue Púrpura intenso Crecimiento

descarboxilasa
Agar LIA: H2S + Púrpura tenue Ennegrecimiento Crecimiento
Agar LIA: + Púrpura tenue Fondo tubo amarillo

Fermentación Glucosa Crecimiento
Medio SIM: Movilidad +d Amarillo tenue. Crecimiento en superficie y

Semisólido, translúcido picadura, turbiedad/difusión
fuera de picadura
Medio SIM: Indol - Amarillo tenue. Con reactivo Kovac’s:

Semisólido, translúcido Formación de anillo rojo en
superficie
Medio SIM: H2S + Amarillo tenue. Ennegrecimiento Crecimiento
Semisólido, translúcido
Caldo RMVP: Prueba de + Amarillo tenue, Con indicador rojo de metilo:

rojo de metilo translúcido Rojo
Caldo RMVP: Prueba - Amarillo tenue, Con reactivos VP1 y VP2:
Voges-Proskauer translúcido Anillo rojizo
Agar Citrato a+ Verde Azul Crecimiento
V
Simmons
Observación
Bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados
microscópica
a
+,90% o más positivos en 1 o 2 días;- 90% o más negativos en 1 o 2 días; v, variable.
b
La mayoría de los cultivos de S. arizonae son negativos. c La mayoría de los cultivos de S.
arizonae son positivos. d Excepto S. entéricaserovarPullorum y S. entéricaserovarGallinarum y
cepas con flagelos disfuncionales
6. Identificaciónserológica.
6.1. Investigación de los antígenos somáticos de Salmonella (suero anti Salmonella “O”
polivalente).
1. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril
(NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.
3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella “O” polivalente y mezclar con
el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
4. Agitar inclinando la lámina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto.
5. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción.

6. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretación de los resultados.
NOTAS
La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Salmonella “O” polivalente se
considerará como el control negativo para poder inter
interpretar el resultado.
Cuando la aglutinación es positiva con el suero anti Salmonella “O” polivalente, puede
determinarse el subgrupo empleando sueros inmunes para los diferentes subgrupos (los más
frecuentes son B, C, D y E).
Si la aglutinación con el suero anti Salmonella “O” polivalente es negativa, utilizar el suero anti
Salmonella “Vi” polivalente y efectuar la prueba en las mismas condiciones ya descritas. Si hay
aglutinación con “Vi” calentar a ebullición y repetir nuevamente la prueba con el suero s anti
Salmonella “O” polivalente.
6.2. Investigación de los antígenos flagelares de Salmonella (suero anti Salmonella “H”
polivalente).
1. Para ensayo el antígeno flagelar en el mismo día día,, inocular el crecimiento del cultivo
de TSI en agar infusión cerebro
erebro corazón (BHI).
2. Incubar a 35°C durante 4 a 6 h.
3. Adicionar al cultivo 2.5 mL de solución salina formalizada.
4. Colocar 0.5 mL del suero antiflagelar “H” polivalente en un tubo de ensayo para
serología (12 x 75 mm).
5. Adicionar 0.5 mL del cultivo form
formalizado
alizado (el obtenido en el punto 3 de este inciso).
6. Preparar un control de solución salina mezclando 0.5 mL de solución salina formalizada
con 0.5 mL del antígeno formalizado.
7. Incubar las mezclas en baño de agua a una temperatura entre 48 y 50 °C.
8. Observar
var en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora.
9. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la muestra de prueba pero
no en el control.
10. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas
muestre aglutinación.
11. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
1. Técnicas para el análisis Microbiológico de Alimentos. Segunda Edición. Universidad Nacional
Autónoma de México. Facultad de Química, Departamento de Biología.
2. https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm
MÉTODO………………….. FECHA……………………..
RESULTADO…………………………
RESULTADO……………………………………………………………………
…………………………………………
…………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES………………………………………………………………
CONCLUSIONES…………………………………………………………………
Práctica N: Determinación de Vibrio spp

14
Objetivo de la práctica de laboratorio
Explicar el fundamento de cada etapa del análisis de

deVibrio sppen
en alimentos.
Entre
e los alimentos involucrados en ETA’s que están contaminados por V. cholerae resaltan los
moluscos bivalvos así como los crustáceos y los pescados frescosrefrigerados y congelados.
Estos productos pueden generar enfermedades a los consumidores debido a que
q desde su origen
están sometidos a contaminación microbiológica y química entre otras, aunado a la forma de
consumo que en muchos casos es cruda.
El cólera es una enfermedad relacionada con el abastecimiento de aguas con poca higiene, o bien
de los alimentos
mentos provenientes de aguas contaminadas con materia fecal y que se consumen
crudos. También puede aparecer V. cholerae O1 en moluscos bivalvos, crustáceos o pescados
que se obtienen de aguas no contaminadas en donde el microorganismo forma parte de la l
microbiota autóctona.
El género Vibrio incluye a los bacilos rectos o curvos Gram

Gram-negativos,
negativos, oxidasa positivos (excepto
las especiesmetschnikovii y gazogenes
gazogenes), ), anaerobios o anaerobios facultativos. Muchas especies
de Vibriospp.
spp. son patógenas para huma
humanos
nos y están implicadas en toxiinfecciones transmitidas por
alimentos. La mayoría de los microorganismos que pertenecen a este género no crecen en medios
sin cloruro de sodio a excepción de V. cholerae y V. mimicus,, por lo tanto, debido a esta
característica
a no es considerado un Vibrio halofílico, aunque requieran trazas del ión sodio para su
crecimiento.
Las especies de Vibriocholerae comprenden varios grupos antigénicos somáticos incluyendo el

grupo O1, el cual se asocia con los biotipos clásico y El Tor
Tor.. A su vez, este grupo O1 puede tener
varios serotipos incluyendo Inaba, Ogawa e Hikojima. Las especies de V. cholerae no-O1
(referidos en la literatura como vibrios no aglutinables o NAG), se encuentran en aguas estuarinas
y pueden causar enfermedad gastr gastrointestinal,
ointestinal, aunque típicamente es menos severa que la
causada por el V. cholerae O1. El serotipo O139 identificado por primera vez en 1992 como el
causante de una nueva epidemia de cólera en la India y Bangladesh y el cual no se ha podido
encontrar en aguas
uas estuarinas, es una excepción de los vibrios NAG que si produce los síntomas
clásicos del cólera.
El método de detección estándar para la recuperación y la detección de Vibrio cholerae es

cualitativo. Sin embargo se recomienda para las especies aisla
aisladas de V. cholerae de los serotipos
O1 y no-O1O1 demostrar la producción de la toxina del cólera. Este método describe un esquema
general que consiste en:
Enriquecimiento a diferentes temperaturas, dependiendo del tipo de alimento que se desee

analizar, donde
onde se pretende incrementar las poblaciones de Vibrio e inhibir otros microorganismos
presentes en la muestra.
Aislamiento diferencial en medio sólido selectivo, el cual restringe el crecimiento de otros

géneros diferentes a Vibrio,, permitiendo el re
reconocimiento
conocimiento de colonias sospechosas de la especie
Vibrio cholerae.
Purificación: Las colonias características sospechosas de pertenecer a la especie cholerae, se

purifican en medios no selectivos.
Identificación bioquímica, que permite la identifica
identificación
ción de los cultivos de V. cholerae.
Pruebas serológicas, que permitan la identificación de los cultivos de V. cholerae.
1- Agua de peptona alcalina
2- Agar tiosulfato-citrato-bilis-sucrosa
sucrosa (TCBS)
3- Agar tripticasa de soja (TSA)
4- Cloruro de sodio
5- Agar de hierro Kligler inclinados (KIA)
6- Caldo triptona sin NaCl(T1N0)
7- Caldo triptona más 3% de NaCl(T1N3)
8- Caldo triptona más 6% de NaCl (T1N6)
1. cajas de Petri
2. Matraz de 500 mL o frasco de vidrio de 500 mL de capaci
capacidad
3. tubos 13 x 100
4. discos para prueba de oxidasa.
5. discos para prueba de ONPG
8. Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón
9. Asa de inoculación redonda
10. Asa de inoculación en punta
2. Horno para esterilizar material de vidrio.
3. Autoclave
4. Incubadora a 35 ± 2°C

Enriquecimiento y siembra
1. Pesar 25 g de muestra en una funda estéril o frasco tarado (capacidad de aproximadamente
500 ml). Los productos tales como mariscos o verduras se pueden mezclar o cortar en
trozos pequeños con tijeras estériles.
2. Añadir 225 ml de APA al frasco. Mezclar bien la muestra o mezclar 2 min a alta velocidad.
3. Incubar APA a 35 ± 2 ° C durante 6 a 8 h. Vuelva a incubar el frasco durante la noche si la
muestra es de alimento procesado.
Para el análisis de ostras crudas, se incluye un segundo matraz tarado con 25 g de
producto más 2475 ml de APA. Este matraz se debe incubar de 18 a 21 h a 42 ± 0,2 ° C en
un baño de agua. .
4. Preparar las placas secas de agar TCBS. Transferir con ayuda de un asa de 3 mm el
inóculo de la película superficial del cultivo de APA a la superficie de una placa de TCBS
secada y sembrar por agotaientode manera que produzca colonias aisladas.
5. Incubar las cajas de agar TCBS durante la noche (18 a 24 h) a 35 ° ± 2 ° C.
6. Las colonias típicas de V. cholerae en agar TCBS son grandes (2 a 3 mm), lisas, amarillas y
ligeramente aplanadas con centros opacos y periferias translúcidas.
7. Para la identificación bioquímica, las colonias aisladas de las placas deben ser sembradas
en un agar no selectivo (agar TSA-2% NaCl) para purificar la cepa.
8. Incubar durante la noche a 35 ± 2 ° C y proceder a la identificación utilizando una única
colonia aislada.
Confirmación
La fórmula para todos los medios de pruebas bioquímicas deberán contener por lo menos
un 2% de NaCl.
Se recomiendan los siguientes medios porque las reacciones permiten efectuar una
diferenciación presuntiva entre la mayoría de las especies de Vibrio, Aeromonas,
Plesiomonas y otras bacterias. La diferenciación de las colonias sospechosas se realiza por
duplicado en:
Prueba de oxidasa.
1. Colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de
reactivo de oxidasa. Alternativamente se puedeutilizar un disco reactivo comercial.
2. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en agar soya tripticasa con NaCl al
2%, u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables y depositarlo en el papel filtro
anterior.
3. Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscuro o azul en
pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V.
metschnnikovii).
Agar triple azúcar hierro (TSI) y Agar Kligler hierro (KIA)

1. Registrar las características del medio TSI y KIA antes de la inoculación (color del medio).
2. Tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica recta y
estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) y agar de
Kligler (KIA) inclinado.
3. Incubar el medio TSI y KIA a 35 2 C durante 18 a 24 h.
Prueba de halofilia.
1. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI con asa bacteriológica
estéril y suspender el inóculo en un tubo con los siguientes medios:
Caldo triptona con NaCl al 0% (T1N0)

Caldo triptona con NaCl al 3% (T1N3)
Caldo triptona con NaCl al 6% (T1N6).
2. Incubar los medios a 35 ± 2 °C durante 18 a 24 h.

NOTAS
El V. choleraey el V. mimicus crecerán en T1N0 y T1N3 y no crecen en T1N6.
Algunos géneros de bacterias que no son Vibrio y que presentan reacciones similares a las
de V. cholerae en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayoría de las especies de
Vibriospp. que incluyen algunos V. cholerae no O1, crecen únicamente en T1N3 y no crecen
en T1N6 ni en concentraciones mayores de sal.
Prueba de oxidación-fermentación.
1. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en KIA o TSI con asa bacteriológica
estéril e inocular por picadura en un tubo con el medio HughLeifson.
2. Añadir una capa de aceite mineral estéril a uno de los tubos para incubación en
anaerobiosis.
3. Incubar ambos tubos a 35-37ºC durante 18 a 24 h.
NOTA
Las especies de Vibriospp utilizan la glucosa tanto para la oxidación como para la
fermentación. Las especies de Pseudomonas, que comúnmente se aíslan del pescado y los
mariscos con métodos de enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio, utilizan
sólo la glucosa para la oxidación.
Identificación y confirmación de V.chloreae O1, V.cholerae no O1 y V. mimicusa través de

pruebas bioquímicas complementarias.
Leer los resultados de las prueba bioquímicas de TSI, KIA, T1N0, T1N3, T1N6 además del
caldo glucosa de Hugh-Leifson. También se sugiere realizar una tinción de Gram a un
cultivo de 18 a 24 h. de incubación.
La interpretación de las pruebas bioquímicas para identificación de V. cholerae y otras

especies bacterianas afines figuran en los cuadros
Pruebaserológica de aglutinación.
1. Inocular los cultivos sospechosos presuntivos en agar tripticasa soya (TSA) e incubar a 35-
37°C durante 16 a 24 h.
2. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril (NaCl
0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación.
3. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSA.
4. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Inaba
(factor AC) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
5. Agitar inclinando la lámina hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto.
6. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción.
7. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.
8. Realizar el mismo procedimiento con el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo
Ogawa (factor AB).
NOTAS
La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1
subgrupo Inaba (factor AC) o el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Ogawa
(factor AB) se considerará como el control negativo para poder interpretar el resultado.
Existe la posibilidad que los antígenos anti Vibrio cholerae estén relacionados entre sí, por
lo que se considera pertinente realizar pruebas bioquímicas para confirmar que el cultivo
puro sea de V. cholerae O1 o no O1.
Es conveniente incluir cultivos positivos y negativos, además de los controles salinos para
cada antisuero usado.
Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo O1) y con los sueros Inaba y
Ogawa, tienen los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima.
Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente, pero no aglutinan con sueros Inaba y
Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros.
Los cultivos de V. cholerae cuya identidad se haya confirmado con métodos bioquímicos y
que no aglutinen con el suero del grupo O1 se deben considerar como V. cholerae O1.
CUADRO 1. Reacciones de algunas especies de Vibriospp. y microorganismos relacionados en
medios sólidos diferenciales.
Agar hierro- Agar hierro-tres Agar arginina glucosa

Microorganismo Kligler (KIA) azúcares (TSI) (AAG)
Pico de Fondo Pico de Fondo Pico de Fondo
flauta de tubo flauta de flauta de tubo
tubo
V. cholerae Lac - Gluc + Lac + Gluc + Arg. Dihid. Gluclig. +
(- raro) -
V. mimicus Lac - Gluc + Lac – Gluc + Arg. Dihid. Gluc +
(+ raro) -
V. parahaemolyticus Lac - Gluc + Lac - Gluc + Arg. Dihid. Gluc +
-
V. alginolyticus Lac - Gluc + Lac + Gluc + Arg. Dihid. Gluc +
-
V. vulnificus Lac – o Gluc + Lac – Gluc + Arg. Dihid. Gluc +
+ (+ raro) -
A. hydrophila Lac – o Gluc + Lac – o Gluc + Arg. Dihid. Gluc -
+ + -
P. shigelloides Lac – o Gluc + Lac – o Gluc + Neutro Neutro
+ +
Ninguna de las especies de Vibrio spp. aquí enlistadas producen ácido sulfhídrico en KIA, TSI o AAG, o gas de la
glucosa en cantidades detectables en KIA, TSI o AAG. Algunas especies de Aeromonasspp.
pueden producir gas a partir de la glucosa en estos medios.

CUADRO 2. Características mínimas para la identificación de Vibrio cholerae
Vibrio cholerae
Característica
Morfología Bacilo Gram-negativo (pueden ser curvos)
TSI Lac + (- raro)

Gluc + gas -
H 2S -
Prueba de oxidación-fermentación Fermentación + oxidación +
Citocromooxidasa +
Dihidrolasaarginina -
Lisinadescarboxilasa +
VogesProskauer El Tor + TipoClásico -
Crecimiento a 42ºC +
Prueba de halofilia con NaCl 0% +
3% +
6% usualmente -
8% - 10% -
Fermentación de la sacarosa +
ONPG +
Fermentación de la arabinosa -
CUADRO 3. Características diferenciales de especies y biotipos del género Vibrio
V. V. V. V. V. V. V. V.
cholerae alginolyticus fluvialis parahaemolyticus vulnificus mimicus hollisae furnissii
Crecimientoen A A V V V V NC A
TCBS
Agar mCPC P NC NC NC A NC NC NC
Medio AAG Ka KA KK KA KA KA Ka KK
Crecimiento con:
0% NaCl + - -/d - - + - -
3% NaCl + + + + + + + +d
8% NaCl - + d + - - - -
10% NaCl - + d - - - -
Crecimiento a:
4ºC - - - - - ND ND ND
30ºC + + + + + ND ND ND
35ºC + + + + + ND ND ND
40ºC + + + + + ND ND ND
Oxidasa + + + + + + + +
OF/glucosa OF OF OF OF OF OF OF OF
ONPG + - + - + + - +
Voges- d + - - - - - -
Proskauer
Rojo de Metilo + NC - NC NC d - +
Indol + d - + d + + -
Movilidad + + d - + + - +
Citrato + - + d d + - +
Argininadihidrolas - - + - - - - +
a
Descarboxilación + + - + + + - -
de lisina
Descarboxilación + + - + + + - -
de: Ornitina
Gelatinasa + + + + + d - +
Ureasa - - - D - - - -
Producción de: + + + + + ND ND ND
amilasa
H2S (SIM) - - - - - - - -
Utilización de: D- + + + + + - + +
glucosa
Gas a partir de - - - - - - - +
glucosa
D-Xilosa - - - - - -
L-Arabinosa - - + d - - + +
D-Galactosa + d + + + + + +
Sacarosa + + + - - - - +
Celobiosa - - d - + - - -
Lactosa - - - - + d - -
Salicina - - - - + - - -
D-Gluconato + + + + +
Putrescina - d d + -
SÍMBOLOS: TCBS, tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa; mCPC, agar celobiosa-polimixina B-colistina; modificado;
AAG, agar arginina-glucosa A, amarillo; V, verde; P púrpura; OF, metabolismo oxidativo/fermentativo; N, no crece; K,
alcalino; a, ligeramente ácido; V, reacción variable dependiendo de las especies o biotipos; S, sensible; R, resistente; d,
resultados diferentes; +, la mayoría de las cepas +, usualmente 90% o más; -, casi ninguna cepa positiva, usualmente
positivas; ND, no hay datos
Conclusiones
1-
2-
3-
Recomendaciones
1-
2-
3-
Bibliografía
1- https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm
2- Técnicas para el análisis Microbiológico de Alimentos. Segunda Edición. Universidad
Nacional Autónoma de México. Facultad de Química, Departamento de Biología.
MÉTODO………………….. FECHA……………………..
RESULTADO……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES………………………………………………………………
CONCLUSIONES…………………………………………………………………
………………………………………………………
Práctica N: Análisis de superficies

15
1. Realizar el análisis de superficies para diversos grupos microbianos de importancia en

alimentos.
2. Interpretar los resultados delanálisis de superficies y sus importancia en la verificación de la
correcta aplicación de los protocolos de higiene de las plantas procesadoras de alimentos.
Los Controles de superficies se realizan para asegurar la higiene de los elementos y superficies en
contacto con los alimentos procesados.
Los Controles de manipuladores de alimentos se realizan para asegurar la higiene de los
manipuladores en contacto con los alimentos procesados.
La higiene de las superficies, equipos y utensilios, es uno de los pilares donde se asientan las
buenas prácticas de manufactura y si se considera que entre el 6 y 15 % de los alimentos
producidos poseen algún tipo de contaminación, cifra que podría dispararse de manera
imprevisible en un mercado de producción a escala macro como lo hacen las industrias
alimenticias en la actualidad, la respuesta a estos grados de contaminación son varias, pero una
de ellas se basa en la comprobación de que existen microorganismos capaces de resistir los
tratamientos habituales de limpieza(Forte, L.M.yRebagliati, J.E.,2000).
Los microorganismos patógenos pueden pasar de un alimento a otro por contacto directo o bien a
través de quienes los manipulan, de las superficies de contacto del aire (CAC/RCP 1, 1997).
Una correcta higiene de los alimentos está determinada por una multitud de factores: condiciones
de obtención de los mismos, características de los medios empleados para su transporte,
temperaturas y condiciones de conservación, estructura de los locales donde se manipulan,
destacando entre todos ellos la higiene de las prácticas de los manipuladores de alimentos (Pérez
Silva García, M.; Belmonte Cortés, S. y Martínez Corral, J.; 1998).
Entre los agentes etiológicos productores de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA)
predominan los biológicos (Gomez, D.; Cotella, O.; Fernandez Pascua, C. y Ameztoy, A.M., 1997);
entre los cuales se destaca el género Salmonella.
En la industria de los alimentos Escherichiacoli es un organismo de particular importancia por su
impacto en salud, y se considera que, conociéndose el papel de los reservorios, la prevalencia del
organismo en las plantas procesadoras y en los alimentos,sería fundamental establecer el
significado de éstos (Rodríguez; H.R.1995),. También se deberían conocer cuáles serían las
operaciones o procedimientos en las etapas de producción y en las posteriores de procesamiento
que facilitan o producen contaminación microbiana, la investigación sobre estos organismos
aportaría la información científica necesaria para sustentar programas de control de estos
emergentes.
Asimismo, la intoxicación estafilocócica es una de las ETA más frecuentes, con
especialpreponderancia en la región latinoamericana, y su presentación ocurre por las
enterotoxinas producidas por numerosas cepas de Staphilococcusaureus que proliferan en los
alimentos, los estafilococos abundan en el medio y el origen de la contaminación por lo regular
está relacionada con heridas de la piel, la nariz, la boca o la garganta de los manipuladores,
cuando se procesan aún estando ya cocidos y calientes (INPPAZ / OPS / OMS, 1997). La
contaminación cruzada entre materias primas crudas o entre productos crudos y los ya cocidos a
través de manos,
1. Agua de peptona
2. Hisopos de algodón
3. Medios de cultivos selectivos de acuerdo al microorganismo que se investiga
2. cajas de Petri
4. Tubos de 13 x 100 mm
5. Hisopos de algodón
1- Balanza de precisión
2- Horno para esterilizar material de vidrio.
3- Autoclave
4- Incubadora a 35 ± 2°C

Técnica de frotación con hisopo de algodón.
Si el muestreo es en una planta de alimentos, se considerará sectores bien definidos de la planta,
que se correspondan con las áreas de elaboración de alimentos, teniendo en cuenta las etapas de
producción pre operacionales y operacionales, que al tratarse de superficies en contacto con
productos terminados para consumo directo, conllevan un alto riesgo sanitario.
Para la toma de la muestra se utiliza la técnica de frotación con hisopo de algodón humedecido en
caldo peptona al 0.1 %, sobre superficies de utensilios, mesones, equipos y manos de operarios.
Los hisopos se transportaran en tubos individuales con 10 ml de la solución referida, refrigerados y
en un lapso no mayor a 2 horas de obtenidas las muestras, se procederá a su procesamiento en el
laboratorio.
Cada uno de los tubos conteniendo los hisopos se agitan manualmente, mediante 50 movimientos
de rotación en un diámetro de 15 cm en un tiempo de aproximadamente 10", posteriormente se
procede a efectuar el aislamiento
iento y tipificación de especies patógenas con especial referencia a
Salmonella Spp,, Coliformes totales, Escherichiacoli y Staphilococcusaureus.
Conclusiones
1-
2-
3-
Recomendaciones
1-
2-
3-
Bibliografía
1-https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm
MÉTODO………………….. FECHA……………………..
RESULTADO……………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………….
OBSERVACIONES………………………………………………………………
CONCLUSIONES…………………………………………………………………
Cargo Fecha Firma
Q.F Ma. Auxiliadora Alarcón Nombramiento

Perasso.Mgs Tiempo
Completo
Elaborado
por:
Dra.Ma. del Carmen Villacrés Contratado.
C, PhD Tiempo
Completo
Dra. Celeste Carrillo Tomalà

Contratado.
Tiempo
Completo
.
Revisado Q.F María José Morales E, M Gestor
por: Sc Pedagógico
Curricular
Aprobado Q:F.Marianita Rendón M. MSc Vicedecano

por:
Secretaría Ing.Alexandra Zambrano Silva Asistente

de la administrativo
carrera

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Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Químicas

Campo de PRAXIS PROFESIONAL

Unidad 1. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Unidad 2. INFECCIONES E INTOXICACIONES. MICROBIOLOGÌA PREDICTIVA-ETAS

Unidad 3. MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA ALIMENTICIA

Unidad 4. MICROORGANISMOS PATÒGENOS DE IMPORTANCIA EN LOS DIFERENTES

Objetivos de la práctica de laboratorio

Instrucciones o consideraciones previas

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

Instrucciones o consideraciones previas

El estudiante deberá investigar los diferentes medios de cultivos, su formulación, su uso y su

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimiento

Guía de Prácticas de Laboratorio

Instrucciones o consideraciones previas

Medio de cultivo PlateCount

Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón

Los resultados obtenidos, serán de acuerdo a la calidad microbiológica de la muestra

Las conclusiones serán de acuerdo a la calidad microbiológica de las muestras y de acuerdo a lo

AOAC Official Methods of Analysis (Laboratorio de Microbiología)

PRACTICA COLIFORMES TOTALES. NMP

Objetivos de la práctica de laboratorio

Instrucciones o consideraciones previas

Los microorganismos indicadores son microorganismos que generalmente se encuentran en la

El microorganismo utilizado como indicador es Escherichia coli y su detección se puede hacer

Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.

Actividades por desarrollar/ técnica operatoria o procedimientos

Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de

PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:

1. Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo

PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:

1. Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, Si se

Se puede hacer uso de la tabla de NMP, para obtención de los resultados.

Instrucciones o consideraciones previas

Práctica Determinación De Staphilococcusaureus en alimentos

Objetivos de la práctica de laboratorio

1- Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este

Los estafilococos son

MÉTODO DE RECUENTO DE PLACA DIRECTA

Prueba de la enzima termonucleasa.

Práctica N: Determinación de Hongos y Levaduras

1- Obtener mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y levaduras

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden

1. Agua de peptona al 0.1% o, solución amortig

1. Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón

Práctica N: Determinación de Salmonella spp

Objetivos de la práctica de laboratorio

1. Describir la metodología llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la

Salmonella spp.. es un bacilo Gram Gram-negativo

FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un

4.1. Agar triple azúcar hierro

4.2. Agar lisinahierro.

5.1. Caldo urea (convencional)

1. Con asa bacteriológica

5.2. Agar citrato de Simmons

5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad)

1. Para la prueba de Voges

En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioq

Medio a Color antes de Color después de

TSI: -c Naranja Pico de flauta naranja.

TSI: Producción de H2S + Naranja Ennegrecimiento Crecimiento

Agar LIA: Lisin- + Púrpura tenue Púrpura intenso Crecimiento