UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA-I
DRA. EVANGELINA OLIVAS ENRÍQUEZ

PROGRAMA DE MEDICINA
ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

CD. JUÁREZ, CHIH. 2015

1
MANUAL DE PRÁCTICAS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA-I

Dr. Daniel Constandse Cortez

Director del Instituto de Ciencias Biomédicas

Dra. Beatriz Díaz Torres

Jefa del Departamento de Ciencias de la Salud

Dr. Jorge Camargo Nassar

Coordinador del Programa de Medicina

Dr. Alejandro Martínez Martínez

Jefe del Departamento Ciencias Químico Biológicas

M. en C. Bertha Alicia Borrego Ponce

Coordinadora de la Academia de Microbiología

2
AGRADECIMIENTOS:

A todos los profesores de la Academia de Microbiología y Parasitología, por sus

valiosas sugerencias en la elaboración de este manual.

3
 TABLA DE CONTENIDO
Pág.
CAPÍTULO-I BACTERIOLOGÍA 5
Reglamento del laboratorio y NOM 087. 6
Práctica 1. Microscopía 8
Práctica 2. Aislamiento de bacterias y medios de cultivo 13
Práctica 3. Estudio microscópico de las bacterias 22
Práctica 4. Microflora normal humana 28
Práctica 5. Control de los microorganismos 30
Práctica 6. Cocos Gram positivos 32
Práctica 7. Bacterias ácido-alcohol-resistentes 37
Práctica 8. Bacterias anaerobias estrictas 39
Práctica 9. Enterobacterias 42
CAPITULO-II PARASITOLOGÍA 47
Práctica 1. Manejo de muestras y coproparasitoscópico directo 48
Práctica 2. Concentración de parásitos intestinales por flotación 55
Práctica 3. Concentración de parásitos intestinales por sedimentación 58
Práctica 4. Tinciones permanentes de protozoarios. Observacion de laminillas 62
Práctica 5. Artrópodos de importancia médica 66
Bibliografía 69

4
 CAPITULO I

BACTERIOLOGÍA

5
 REGLAMENTO DEL LABORATORIO Y NOM 087.

REGLAMENTO DEL LABORATORIO

Este reglamento regirá la actitud, el comportamiento y el desempeño del

estudiante dentro de los laboratorios de Microbiología y tiene como finalidad evitar
riesgos al personal y estudiantes que laboran en él, ya que el laboratorio es un
área donde se manejan microorganismos patógenos, parásitos y algunos
compuestos químicos peligrosos. Asímismo, se debe cuidar el equipo valioso
como son los diferentes aparatos y el material delicado como la cristalería.

1. Todos los alumnos deberán asistir con bata blanca larga y el cabello
recogido.
2. La entrada al laboratorio quedará restringida exclusivamente a los alumnos
inscritos
3. Se prohibe introducir al laboratorio cualquier alimento o bebida, para evitar
el riesgo de contaminación con microorganismos ajenos.
4. Está estrictamente prohibido fumar dentro del laboratorio.
5. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debiéndose
colocar éstas en los casilleros de la entrada.
6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se
deberá comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de
contaminación con los microorganismos patógenos o parásitos manejados
en las prácticas.
7. Se nombrará un jefe de mesa quien será el responsable del cuidado del
material y equipo y de que la mesa quede aseada y desinfectada. También
vigilará que todos los integrantes de la mesa se laven las manos con
antiséptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibirá del profesor los
microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo de
las prácticas, y posteriormente los devolverá en las mismas condiciones
6
 que los recibió, a excepción de los materiales especiales indicados por el
profesor. (ejemplo cultivos). En caso de algún daño al material o aparatos,
los alumnos integrantes del equipo estarán obligados a reparar dicho daño
en la forma que indique el profesor.
8. Para tener derecho a la evaluación final en la teoría, el alumno deberá tener
el 80 % de asistencia.
9. Para poder tener derecho a la asistencia se darán 10 minutos como retardo.
10. La calificación final de la materia de Microbiología quedará constituída por
la puntación obtenida en la práctica y en la teoría, cuya suma se efectuará
en la forma siguiente:
a) La calificación final obtenida en el laboratorio tendrá un valor del 30 % de la
calificación final total.
b) La calificación total de la teoría corresponderá al 70 % de la calificación
final.
c) La suma de ambas calificaciones (teoría y práctica) será igual al 100 %.
d) El alumno no podrá acreditar la materia si obtiene calificación reprobatoria
en el laboratorio o en la teoría. Debe tener aprobadas ambas calificaciones
para promediarse.

CONOCIMIENTO DE LA NORMA OFICIAL MEXICANA - 087

La NOM-087 se refiere a la Separación, Tratamiento y Destino de los Residuos
Biológico- Infecciosos, manejados en los laboratorios. Esta Norma tiene por objeto
establecer los requisitos mínimos de infraestructura y de equipamiento para los
hospitales y consultorios que presten atención médica especializada. En esta
norma se presentan los requisitos mínimos de infraestructura y equipamiento para
hospitales y consultorios de atención médica especializada, incluyendo la
infraestructura y el equipamiento para ejercer actividades directivas y de formación
de personal de salud, establecido como obligatorio por la Ley General de Salud y
su Reglamento en materia de prestación de Servicios de Atención Médica.

7
 PRÁCTICA 1
MICROSCOPÍA

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Que el alumno se familiarice con las partes del microscopio de luz, con su manejo y
sus cuidados. Que conozca el fundamento de las diferentes clases de microscopios.

INTRODUCCIÓN
El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el más útil en el
laboratorio de microbiología, debido a que proporciona la amplificación o
agrandamiento aparente que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a
simple vista, con una amplificación desde cien a cientos de miles de veces. Las
dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios ópticos (de luz) y
los microscopios electrónicos.

I. EL MICROSCOPIO ÓPTICO (de luz):

Microscopio simple: presenta un solo lente.
Microscopio compuesto: utiliza un sistema de lentes ópticos que va amplificando la
imagen sucesivamente y comprende: Microscopio de campo claro, Microscopio de
campo oscuro, Microscopio de fluorescencia y Microscopio de contraste de fases
1. Microscopio de campo claro:
Es el instrumento más ampliamente utilizado para microscopía de rutina. Aquí el
área observada está brillantemente iluminada y los objetos en estudio aparecen
más oscuros. Generalmente producen un aumento útil de unos l000 diámetros.
La amplificación se logra mediante el uso de sistemas de lentes diseñados y
acomodados para proporcionar la amplificación en forma óptima. Presenta lentes
en el condensador, en los objetivos y en los oculares.
El lente del condensador enfoca un cono de luz sobre el campo donde se coloca la
muestra. Algunos de los rayos de luz de este cono pasan directamente al lente del
objetivo para formar el fondo de luz o campo claro.

8
Los rayos de luz que chocan con los objetos (microorganismos) que hay en la
muestra y se “curvan”, son conducidos al lente del objetivo para formar una
imagen del objeto. La imagen es amplificada por la lente ocular.
Comúnmente los microscopios están equipados con tres objetivos, y se
encuentran montados en una plataforma llamada revólver, que al hacerse girar
pone a uno de ellos en la línea del condensador. Cada objetivo proporciona
distinto grado de aumento.
El poder de resolución de un microscopio está determinado por la longitud de onda
de la luz y por una propiedad del objetivo y del lente del condensador.
Sistema mecánico:
Base, brazo, cuerpo del tubo, tubo intercambiable del microscopio, platina,
revólver, objetivos de 10, 40 y 100 X, tornillo macrométrico, tornillo micrométrico,
condensador y diafragma.
2. Microscopio de campo oscuro:
Es similar al de campo claro, excepto que va equipado con un condensador de
campo oscuro y una abertura numérica baja. Esta clase de condensador dirige los
rayos de luz dentro del campo de la muestra, formando un angulo tal, que sólo los
rayos que chocan contra el objeto que hay en el campo de la muestra son
refractados (curvados) y penetran en el objetivo. Así, el objeto queda
brillantemente iluminado y destaca sobre el fondo oscuro (campo oscuro)
3. Microscopio de fluorescencia:
Está equipado con una fuente de luz ultravioleta, varios filtros y un condensador
de campo oscuro. Se usa para examinar muestras teñidas con colorantes de
fluorocromo, denominados fluorescentes, los cuales absorben energía de
longitudes de ondas cortas invisibles, pero emiten ondas de longitudes de onda
mayores visibles y el fenómeno es denominado fluorescencia. Esta técnica
permite la identificación rápida de algunos microorgnismos.

4. Microscopio de contraste de fases:

Es un tipo de microscopio óptico que permite un mayor contraste entre sustancias
de diferente grosor o diferente índice de refracción, mediante el uso de un
9
condensador y un objetivo especiales que controlan la iluminación del objeto, de
manera que acentúa las ligeras diferencias en el espesor o en los índices de
refracción de las estructuras celulares. Las diferencias se revelan en forma de
distintos grados de brillo o de oscuridad (un mejor contraste), pudiendo localizarse
estructuras dentro de la célula sin teñir, que no son visibles en la microscopía de
campo claro.

II. EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Emplea haces de electrones en lugar de ondas de luz, para producir una imagen
amplificada. Un campo magnético sustituye a los lentes. Es posible lograr
amplificaciones de un millón de veces, las que posteriormente se logran ampliar
más en la imagen fotografiada. Esto hace posible la observación de
microorganismos tan pequeños que no se ven con el microscopio óptico, como los
virus.
1. Microscopio electrónico de transmisión:
Un haz de electrones finamente enfocados, pasa a través de un corte ultradelgado
del espécimen. Los electrones son enfocados a una pequeña área de la muestra
y la iluminan, apareciendo con áreas claras y oscuras. La resolución de es de 2.5
nm y la amplificación es de 10 000 a 100 000 X.
2. Microscopio electrónico de barrido:
Resuelve el problema de seccionar los especímenes, permitiendo observar células
completas. Unos electrones son dirigidos a la superficie de la muestra y otros
colectados para formar la imagen tridimensional.

MATERIALES Y MÉTODOS

I. EJERCICIO PARA EL TRANSPORTE Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

El transporte del microscopio de un lugar a otro debe ser muy cuidadoso. Con una
mano se debe sujetar del brazo, mientras se coloca la otra mano bajo la base para
sostenerlo, manteniéndolo en posición vertical. Esto evita para sostenerlo,

10
manteniéndolo en posición vertical. Esto evita el desprendimiento de algunas de
las partes que no son fijas.
2. Nunca deposite el microscopio en la orilla de la mesa, sino a unos cm de
distancia del borde.
3. No toque las lentes con los dedos.
4. No juegue con los componentes del instrumento. Si no funciona en forma
adecuada, notifíquelo al profesor y no intente arreglarlo usted mismo.
5. No permita que ningún reactivo químico entre en contacto con alguna parte del
microscopio, a excepción del aceite de inmersión usado con la lente de l00 X.
6. No permita que el microscopio se encuentre cerca de la flama del mechero.
7. Limpie las lentes solamente con papel especial para lentes (papel seda) sobre
todo al terminar de usarlo, para que no queden restos de aceite de inmersión.

II. EJERCICIO DE ENFOQUE

1. Con base en las indicaciones del profesor, vaya identificando las diferentes
partes que constituyen el microscopio.
2. El profesor le proporcionará una preparación fija de bacterias en un
portaobjetos para el ejercicio.
3. Encienda el microscopio.
4. Mueva cuidadosamente el revólver y coloque el objetivo de 10 X sobre la
platina.
5. Coloque en la platina un portaobjetos con un espécimen y ajústelo en el carro.
Haga coincidir el haz de luz del condensador con el espécimen.
6. Mueva el tornillo macrométrico para acercar el objetivo de 10 X a la platina,
totalmente hasta el tope.
7. Posteriormente, sin dejar de observar a través del ocular, mueva lentamente el
tornillo macrométrico para ir alejando el objetivo de 10 X, hasta detectar una
imagen o un color en la preparación; enseguida mueva lentamente el carro en la
platina. Si la imagen se mueve, indicará que está enfocando la preparación.

11
8. Mueva el tornillo micrométrico y afine el enfoque. Una vez logrado el enfoque,
ya no suba ni baje el tornillo macrométrico, sólo use el micrométrico. Si se
desenfoca, vuelva a repetir el proceso.
9. A continuación mueva el diafragma y determine la cantidad de luz más efectiva
para la observación.
10. Mueva el revólver lentamente para separar el objetivo de 10 X y cambie al
objetivo de 40 X. Ajuste el enfoque con el tornillo micrométrico. Con el diafragma
determine la cantidad de luz adecuada.
11. Mueva el revólver lentamente para separar el objetivo de 40 X y coloque una
gota de aceite de inmersión sobre la preparación. A continuación mueva de nuevo
el revólver con cuidado, dejando que el lente del objetivo de 100 X quede en
contacto con el aceite. Ajuste el enfoque con el micrométrico. Si no lo logra,
regrese directamente al objetivo de 10 X, sin pasar por el de 40 X para no
ensuciarlo con el aceite y vuelva a enfocar. El aceite aumenta la cantidad de luz
que pasa al lente del objetivo.
12. Al terminar, mueva el revólver a 10 X antes de sacar la preparación y
enseguida limpie el aceite del lente con papel seda. Puede usar un pañuelo
desechable por el lado que no suelta pelusa. No utilice algodón ni otros materiales.
13. Nunca olvide retirar la preparación de la platina al terminar, ni limpiar el aceite
del lente de 100 X.
14. Apague el microscopio y enrolle el cable. Haga dibujos de las observaciones a
diferentes amplificaciones. Explique con un dibujo la formación de la imagen que
se observa.
15. Comente su experiencia obtenida al hacer las observaciones y las dificultades
encontradas, así como las ventajas y desventajas que notó en la técnica.

Cuestionario
1. ¿Cómo se forma la imagen del microscopio de luz?
2. ¿Por qué se usa el aceite de inmersión con el objetivo de 100 X solamente?.
.
12
 PRÁCTICA 2
AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO
Que el alumno conozca los diferentes grupos de microorganismos y su
clasificación, así como los métodos de aislamiento y cultivo in vitro.

INTRODUCCIÓN
La Microbiología es la ciencia que se dedica al estudio de los microorganismos,
también conocidos como microbios, seres vivos cuya única característica en
común es su tamaño microscópico, es decir, que no son visibles a simple vista,
por lo que se requiere la ayuda de una lente de aumento, como la de un
microscopio. El nombre microbio proviene del griego «mikros "pequeño” y bios
“vida”». Los microorganismos tienen una gran sencillez en su estructura y
organización, los hay sin estructura celular, como los virus, pero la mayoría de
ellos son unicelulares, aunque algunos son pluricelulares formados por varias
células, las cuales apenas tienen diversidad funcional. A pesar de su sencillez
aparente, su importancia es tanta, que ha dado origen a una rama de la Biología
dedicada a su estudio, la Microbiología.
De acuerdo al Árbol de la Vida de Woese, microbiólogo creador de la nueva
taxonomía molecular basada en la comparación entre especies de la fracción 16s
del ARN ribosomal, se proponen 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en los
que se incluye a todos los seres vivos. El autor dividió el antiguo grupo
denominado Procariota, en dos grupos, Archaea y Bacteria, debido a que ninguno
de los dos es el ancestro de alguno de ellos y por otro lado, ambos comparten
muy pocas características en común.

DOMINIO BACTERIA (antes denominado Eubacteria):

Son células procariotas. Presentan una pared celular conteniendo peptidoglicano,
son sensibles a los antibióticos antibacterianos tradicionales, y tienen regiones del
RNAr y del RNAt claramente diferentes de las Archaea y Eukarya. Hay tantas
13
variedades de Bacteria que es casi imposible determinar cuantas especies existen
en el planeta.
DOMINIO ARCHAEA:
Este Dominio comprende a organismos unicelulares, los cuales son procariotes
semejantes a las bacterias. El material genético de los procariotas, o ADN, no
está encerrado en un compartimento celular central llamada núcleo. Las
Bacteria y las Archaea son los únicos procariotas. Al contrario de Bacteria y
Eukarya, tienen membranas compuestas de cadenas de carbono ramificadas
unidas a glicerol por uniones de éster y tienen una pared celular que no contiene
peptidoglicano. Mientras que no son sensibles a los antibióticos que afectan a los
Bacteria, son sensibles a los antibióticos que afectan a los Eukarya. Viven a
menudo en ambientes extremos ambientales.
DOMINIO EUKARIA:
Incluye los protistas (algas y protozoarios), los fungi (hongos), el reino Plantae
(plantas) y el reino animalia (animales), es decir los organismos cuyas células son
eucarióticas, con membrana similar a las de Bacteria. No todos los Eukarya
presentan pared celular y cuando la tienen no contiene peptidoglicano. Las
células están organizadas en tejidos, tanto en Plantae como en Animalia, pero la
presencia de pared solo se restringe a Plantae. Al tratar la microbiología sobre
todo los microorganismos patógenos para humanos, se relaciona con categorías
de la medicina como Patología, Inmunología y Epidemiología.

14
LAS BACTERIAS
Las bacterias (grupo conocido anteriormente como eubacterias) son células
procariota. Una célula bacteriana típica es de aproximadamente 1 micrómetro de
diámetro, mientras que la mayoría de las células eucarióticas miden de 10 a 100
micrómetros de diámetro. Los Procariota se encuentran en todos los hábitats
donde viven los eucariotas.
Las células bacterianas muestran tres regiones arquitectónicas: apéndices en
forma de flagelos y pili (proteínas unidas a la superficie celular); una envoltura
celular que consiste de una la membrana plasmática, pared celular y cápsula; y
una región citoplásmica que contiene el genoma de la célula (ADN) y ribosomas y
varios tipos de inclusiones. Una célula procariota típica es aproximadamente del
tamaño de una mitocondria de eucariota.

Estructura bacteriana

La clasificación de las bacterias se basa en el estudio de sus características

mediante técnicas que comprenden desde las más sencillas tinciones, hasta los
más complejos estudios moleculares. Una técnica útil y de bajo costo consiste en
la tinción de Gram y posterior observación de la muestra mediante el microscopio
de luz para estudiar su forma, tipo de agrupación y color, de acuerdo a la
composición de su pared celular. Algunas propiedades genéticas y fisiológicas
constituyen herramientas utilizadas para definir algunas características de las
cepas, como los serotipos y biotipos, la determinación de especies en algunos
grupos de bacterias y la producción de toxinas. Los métodos más sensibles se
basan en el análisis del material genético, se emplean en la identificación de
subgrupos de genes esenciales para el crecimiento, colonización, adhesión e

15
invasión bacterianos, tal es el ejemplo de métodos para seleccionar los genes
activos únicamente durante la infección.

morfología de bacterias

CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS

El crecimiento de los microorganismos no se puede estudiar individualmente debido

a su tamaño tan pequeño, por lo que es necesario recurrir a su cultivo en medios
nutritivos artificiales, donde se puedan desarrollar rápidamente y producir grandes
poblaciones. En estas condiciones se pueden manipular y efectuar las
investigaciones deseadas.
Los materiales nutritivos donde se desarrollan y multiplican los microorganismos
contienen los nutrientes necesarios para su crecimiento y se denominan medios de
cultivo, cuyos componentes son muy variados. La elección del medio se basa en el
propósito del estudio.
En general, los medios son ricos en proteínas no específicas, con el fin de estimular
el crecimiento de los microorganismos que se desean aislar. La mayor parte de los
microorganismos requieren un medio enriquecido o suplementado por substancias
como sangre, suero, vitaminas, etc.
Medios de cultivo sintéticos: son medios de composición química conocida.
16
Medios de cultivo complejos: en estos medios por lo menos hay un componente de
composición desconocida.
Medios líquidos y sólidos: cualquier medio líquido se pueden transformar en sólido,
mediante la adición de agar, lo que significa que conservan la misma fórmula
química nutritiva.
Medios selectivos: Los medios de cultivo además de nutrientes y agua pueden
contener sustancias inhibidoras de ciertos grupos microbianos, sin interferir con
otros, convirtiéndose en medios selectivos. Cuando la muestra procede de una parte
del cuerpo que contiene microorganismos de la flora normal, el desarrollo de éstos
es inconveniente y puede inhibir a los microorganismos patógenos, por lo que el
espécimen debe sembrarse en un medio que los inhiba y permita el desarrollo del
patógeno. Estos medios son complejos y altamente selectivos para ciertos
organismos, por ejemplo el medio de Shigella-Salmonella-agar (SS), el citrato-
desoxicolato-agar y el sulfito de bismuto-agar, inhiben el crecimiento de la mayoría
de los coliformes y permite el desarrollo de patógenos entéricos. El medio de agar-
sangre es selectivo para el aislamiento de cocos grampositivos positivos. Los
medios con telurito de potasio y con suero o sangre favorecen el aislamiento de
Corynebacterium, mientras que inhiben todos los cocos grampositivos comunes en
las muestras. En sal-manitol-agar las colonias de estafilococos patógenos crecen
con un halo amarillo.
Medios diferenciales: La adición de algunas sustancias indicadoras al medio, los
convierte en medios diferenciales, debido a que permiten el desarrollo de las
bacterias con una apariencia colonial distintiva, según la especie. En virtud de la
composición química de estos medios, se pueden caracterizar ciertos géneros
bacterianos por la apariencia colonial distintiva en el medio, por ejemplo el medio de
agar-eosina-azul de metileno (EMB) y el agar-MacConkey contienen lactosa y un
colorante o un indicador de pH. Las colonias fermentadoras de lactosa y
productoras de aldehído, producen colonias de un color especial.
Medios para identificación de bacterias: Los medios para la identificación de las
bacterias, contienen sustratos específicos de prueba, para diferenciar unas especies

17
de otras, en base a su capacidad enzimática. Cada especie se presenta un equipo
enzimático característico de su especie.
Medios con antibióticos: Los medios con antibióticos son inhibitorios para unos
organismos, permitiendo el aislamiento de otros, a partir de una población mixta. Por
ejemplo, el agar-Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol, permite el crecimiento
de hongos dermatofitos y de la mayoría de hongos patógenos, e inhibe a los hongos
saprófitos y a las bacterias.
Medios de mantenimiento: los medios de mantenimiento contienen los
requerimientos necesarios para conservar las cepas bacterianas puras en el
laboratorio, de acuerdo con las necesidades de cada especie, haciendo resiembras
periódicas.
Medios especiales: otros medios muy especiales, deben permitir el crecimiento de
grupos poco comunes de bacterias, como los anaerobios estrictos, las
mycobacterias, los mycoplasmas, otros.

Bacterias no cultivables: Como su nombre lo indica, las bacterias no cultivables no

se pueden cultivar en ninguno de los medios conocidos hasta ahora, tales como
Rickettsia, Chlamydia, Mycobacterium leprae y Treponema palidum.

Inóculo: El material bacteriano que se siembra en el medio de cultivo se denomina

inóculo.
Cultivo: Una vez que los microorganismos se desarrollan en el medio de cultivo, el
resultado es un cultivo.
Aislamiento de las bacterias en medio de cultivo sólido: Cuando las bacterias se
inoculan en un medio solidificado (adicionado de agar), contenido en una caja de
Petri (medio en placa ), las bacterias pueden esparcirse en la superficie, mediante
una técnica de rayado (estriado) con el asa bacteriológica (alambre con el extremo
en forma de anillo), en tal forma que las células queden separadas individualmente,
lejos unas de otras. Durante la incubación, cada célula bacteriana se reproduce tan
rápidamente, que en 18 a 24 hs se producen masas bacterianas visibles a simple
vista, denominadas colonias.
18
Colonia bacteriana: Las colonias bacterianas masas bacterianas generalmente son
observables a simple vista, excepto las del género Mycoplasma. Cada colonia
presumiblemente procede de una bacteria progenitora, cuyos individuos son de una
sola especie.
Cultivo puro: Una colonia que se desarrolló separada de las otras, al ser transferida a
un medio de cultivo nuevo, dará lugar a un cultivo puro, es decir con individuos de
una sola especie, de un solo progenitor.

MATERIALES Y MÉTODOS.

I. TÉCNICA PARA QUEMAR EL ASA BACTERIOLÓGICA, EN LA FLAMA.

1. Antes de iniciar la siembra de bacterias, se debe aprender a quemar el asa

bacteriológica con el fin de no contaminarse con las bacterias.

2. Para ello, introduzca el anillo del asa en el centro de la flama del mechero, donde
hay el mínimo calor, manteniendo el mango inclinado, para que se caliente el anillo
pero sin quemarse, mientras que se pone al rojo vivo solo el resto del alambre;
enseguida lentamente retire el anillo hacia la superficie de la flama, y queme,
esperando que se ponga al rojo vivo. En ese momento retire el anillo fuera de la
flama, pero manteniendo el asa dentro del círculo de esterilidad, creado durante la
combustión del aire; sienta el aire caliente con la mano, dentro de la zona estéril. No
agite el asa para no romper el área de esterilidad y espere un minuto para que se
enfríe el alambre.
3. Entre cada siembra de los diferentes medios, y las diferentes bacterias se debe
quemar el asa en la misma forma que se describió anteriormente, para prevenir el
chisporroteo a la cara, de las bacterias que aún quedaron en el asa, de la siembra
anterior. Esta técnica para quemar el asa, servirá de protección para evitar
contaminarse y debe hacerse un hábito antes y después de cada siembra.
4. Los recipientes que contienen las bacterias, solo deben abrirse dentro del área de
esterilidad, para evitar que se contaminen con las bacterias del ambiente

19
II. AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR ESTRÍA CRUZADA EN MEDIO SÓLIDO.
1. Para sembrar la bacterias, en el área de esterilidad del mechero destape el
recipiente que contiene las bacterias y con el asa previemente quemada, obtenga
una asada. Siembre placas por separado, de medio tripticasa-agar-soya y de agar-
nutritivo con cultivos puros de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Streptococcus
pyogenes. Para lograrlo, desarrolle el método de siembra de la estría cruzada en
placa, girando la caja al ir rayando hasta formar un pentágono, siguiendo las
indicaciones del profesor, con el fin de ir diluyendo el inóculo. Al final de la siembra
las bacterias quedarán separadas unas de otras. Invierta todas las placas, con la
tapa hacia abajo guárdelas en la incubadora a 37°C, durante 24 hs, con el fin de
permitir la formación de colonias.
2. Saque las placas de la incubadora y observe el crecimiento bacteriano.
3. Determine y anote los errores efectuados en la siembra, cuando no se obtuvo la
separación de las colonias.
4. Note las diferencias entre las colonias, según la especie bacteriana. Haga una
tabla de características morfológicas con los datos observados, para cada bacteria,
tomando en cuenta diámetro aproximado, color, transparencia, brillo, elevación
pigmentos, bordes regulares o irregulares.

Estría cruzada

20
III. CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO.
1. Siembre las mismas especies de bacterias bacterias, en tubos con medio
líquido de caldo-tripticasa-soya, inoculando una asada de la bacteria. Deje un tubo
control sin inocular.
2. Incube todos los tubos sembrados a 37 oC por 24 hs.
3. Sin agitar los tubos, con cuidado sáquelos de la incubadora. En cada uno, note
la aparición de turbidez, de sedimento, de una película superficial, o combinados.
4. Deduzca la causa por la que no se forman colonias en medio líquido y por qué
no se aíslan las bacterias. Anote detalladamente sus resultados en todos los
experimentos. Compare sus resultados personales con los de los otros equipos.

IV. CULTIVO EN AGAR INCLINADO

1. Siembre una asada de una bacteria en la superficie del agar inclinado en un
tubo, mediante rayado, iniciando en el fondo, siguiendo las indicaciones del
profesor.

Siembra agar en tubo

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.

21
 PRÁCTICA 3
ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LAS BACTERIAS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Desarrollar las técnicas microscópicas comunes para observar, teñir y medir a las
bacterias y sus estructuras.

INTRODUCCIÓN

El tamaño tan pequeño de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya

que su promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrómetros (µm) de diámetro. En cuanto
a su forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos,
curvos o helicoidales. Los extremos de los bacilos pueden ser redondos,
angulares o agudos y pueden ser móviles o inmóviles. Las bacterias esféricas
(cocos) pueden presentarse solas, en pares, en tetradas, en cadenas o en
racimos. Los bacilos también pueden agruparse en dos o en cadenas.
Las características morfológicas de las bacterias se pueden apreciar mediante
técnicas microscópicas, ya sea en su estado vivo o muerto. Las ventajas del
estudio directo al microscopio de células vivas en referencia a su forma,
disposición y tamaños naturales, han sido antagonizadas por el hecho de que, el
índice de refracción del protoplasma de los microbios se acerca al del agua y por
ello, las células y sus estructuras no pueden diferenciarse en forma neta entre sí,
ni del líquido en que están incluídas. El estudio microscópico de las bacterias se
facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes, apreciándose su forma y
tamaño.

Preparación en fresco: Permite observar en los microorganismos la movilidad, el

color, el tamaño, la forma y la agrupación en su forma natural viva y sin
alteraciones. Sin embargo, la observación es difícil debido al escaso contraste,
por la poca diferencia entre el índice de refracción del medio y de los
microorganismos. Este problema se resuelve utilizando el microscopio de campo
22
oscuro y el de contraste de fases. Una forma de preparación en fresco es el
montaje de una suspensión bacteriana en portaobjetos normal con cubreobjetos.
Otra forma es la Preparación en gota suspendida, para lo cual se utiliza un
portaobjetos excavado y un cubreobjetos.

TÉCNICAS DE TINCIÓN:
- Tinción simple o directa:
Tiñen homogéneamente la célula y solo utilizan un colorante, que puede ser azul
de metileno, safranina, cristal violeta, etc.
- Tinción compuesta o diferencial:
Algunas de estas técnicas permiten la demostración de estructuras específicas
como cápsula, flagelos, esporas, etc. Otras tiñen selectivamente bacterias de un
grupo específico. Requieren combinaciones de dos o más colorantes, como en la
técnica de Gram, la de Ziehl Neelsen, o para diferentes estructuras.
- Tinciones negativas:
En realidad no colorean los microorganismos, se limitan a depositarse en el campo
del rededor de los organismos, delimitando las células.

MATERIALES Y MÉTODOS

I. PREPARACIÓN EN FRESCO.
En este tipo de preparación se perderán varios detalles de las bacterias.
1. Para el montaje en gota suspendida, unte un poco de vaselina con un palillo,
alrededor de la concavidad de un portaobjetos excavados.
2. A continuación, coloque en el centro de un cubreobjetos una gota de
suspensión bacteriana en agua y coloque encima el portaobjetos excavado,
haciendo coincidir la excavación con la gota.
3. Permita la adhesión del portaobjetos con el cubreobjetos. Invierta el
portaobjetos con el cubreobjetos arriba y observe al microscopio a solo a 10 X y
posteriormente a 40 X.

23
4. Haga dibujos de lo observado. Detalle la forma, agrupación, color, movilidad,
etc.
5. Al terminar, haga una preparación en fresco entre porta y cubre, substituyendo
el portaobjetos excavados por uno normal y anote sus observaciones y los detalles
en las células, sobre todo la movilidad, comparando en las dos preparaciones en
donde se observó mejor. Diga si pudo observar la forma de las células y su
agrupación.
6. Compare los resultados en las dos técnicas.

II. ELABORACIÓN DE FROTIS BACTERIANOS (previo a la tinción)

1. Queme el asa al rojo vivo en la flama del mechero y déjela enfriar en el área de
esterilidad

2. Destape un cultivo bacteriano líquido junto a la flama del mechero y tome con el
asa una gotita del cultivo, depositándola en el centro de un portaobjetos limpio;
extienda con el asa para hacer un frote.

3. Si el cultivo no es líquido, coloque una gotita de agua destilada con el asa, en el

centro de un portaobjetos. Queme el asa y déjela enfriar, tomando a continuación
una poca de la masa bacteriana de la superficie del medio, para hacer una
suspensión de bacterias en la gotita del porta. Enseguida extienda con el asa para
hacer un frote.

4. Deje secar el frote al aire libre.

5. Fije la preparación con calor, pasándola tres veces sobre la flama del mechero
en forma rápida.

III. TINCIONES DIFERENCIALES

1. TINCIÓN DE GRAM.
Esta tinción separa las bacterias en dos grandes grupos, las gram positivas que
retienen el primer colorante usado (cristal violeta) y las gram negativas que se

24
tiñen con el segundo colorante (safranina). Estas diferencias están basadas en la
estructura y composición química de la pared celular. Las gram positivas tienen
una pared gruesa de péptidoglicano y además, muchas de estas especies
presentan ácidos teicoicos en la pared. Las gram negativas contienen menos
péptidoglicano y su capa es mucho más delgada, pero que está rodeada de una
bicapa más externa de lípidos, llamada membrana externa. Los mejores
resultados se obtienen utilizando cultivos jóvenes de bacterias, no mayores de 24-
48 hs, pues de lo contrario los resultados son ambiguos. La pared celular es
dañada en las células viejas.
a). Para el efecto, primeramente elabore un frote de cada una de las siguientes
bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus subtilis, en
cultivos de 24-48 hs.
b). Después de fijar los frotes, cúbralos con cristal violeta durante un minuto y
enjuague con agua.
c). Cubra con reactivo de Lugol durante un minuto y lave con agua.
d). Decolore con alcohol-acetona unos segundos y lave con agua.
e). Cubra con safranina medio minuto y lave con agua.
f). Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 X y después a100 X con
aceite de inmersión. Las bacterias teñidas de morado se consideran Gram
positivo, las de rojo se consideran Gram negativo.
g). Note las diferencias en la observación de bacterias teñidas con las no-teñidas.

25
2. TINCIÓN NEGATIVA PARA OBSERVACIÓN DE LA CÁPSULA.
La cápsula es una capa gruesa de polisacárido (ocasionalmente de polipéptido),
más externa a la pared celular, que rodea a la bacteria y está adherida a ella. Sus
dos funciones principales son favorecer su adhesión a las superficies y protegerla
de los predadores. Por ejemplo el Streptococcus mutans productor de una gran
cápsula, es uno de los iniciadores de la caries dental, debido a su capacidad para
adherirse a los dientes y sus ácidos que degradan el esmalte dental. El
Streptococcus pneumoniae ataca el pulmón, causando neumonía cuando es
capsulado y no causa enfermedad cuando pierde la cápsula, debido a que es
fácilmente fagocitado por los macrófagos. La cápsula es difícil de teñir con los
colorantes, por lo que se recurre a tinciones negativas. El campo de alrededor se
tiñe con un colorante ácido, mientras que la célula se tiñe con un colorante básico
de otro color. En estas condiciones se observa como un área brillante translúcida
alrededor de la célula.
a). Cerca del extremo de un portaobjetos coloque una gota de tinta china
b). Adicione una asada de suspensión bacteriana en agua de Klebsiella
pneumoniae (cultivo de 24-48 hs) y mezcle con el asa.
c). Con otro portaobjetos extienda la preparación a lo largo del portaobjetos, hasta
obtener una película delgada, como para realizar un frote sanguíneo. Deje secar al
aire libre la preparación. No se requiere fijar con calor.
d). Haga otra preparación igual con Escherichia coli.
e). Cubra cada preparación con safranina por un minuto y lave con agua
cuidadosamente, para no despegar la película. Deje secar al aire libre y observe
al microscopio a 10 y a 40 X. Anote detalladamente los resultados e interprete los
resultados, comparando las diferentes bacterias.

26
3. TINCIÓN DE ENDOSPORAS BACTERIANAS.
Ciertos géneros de bacterias como Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum,
Sporolactobacillus, Thermoactinomyces y Sporosarcina, producen endosporas,
estructuras no reproductivas, resistentes a las condiciones ambientales adversas,
así como al calor y a los compuestos químicos. Cada célula produce una espora y
cada espora una célula. En condiciones favorables, las bacterias se reproducen
normalmente por fisión binaria, y al volverse desfavorables esporulan. Se tiñen
pobremente, aunque pueden teñirse mejor usando colorantes calientes para que
penetren.
a). Prepare un frote con Bacillus sp. (un cultivo de Bacillus sp. de más de 48
horas). Deje secar al aire libre y fije con calor.
b). Coloque sobre el portaobjeto una tira de papel filtro de menor tamaño y cubra
con verde de malaquita en solución acuosa de fenol. Caliente a emisión de
vapores durante 5 minutos. No permita que ebulla. Si empieza a secar adicione
más colorante.
c). Deje enfriar, retire el papel y lave.
d). Tiña con safranina 60 segundos y lave con agua. Deje secar. Enfoque a 10 X y
después a 100 X.
e). Haga dibujos detallados de las esporas y los bacilos observados

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

27
 PRÁCTICA 4
MICROFLORA NORMAL HUMANA

OBJETIVO
Conocer la microflora normal de las diferentes partes del cuerpo y comprobar su
presencia en piel y cavidad bucal mediante técnicas de laboratorio.

INTRODUCCION.
Los microorganismos normalmente existen en diversas regiones del cuerpo y estas
poblaciones representan lo que se conoce como microflora nativa, pero su simple
presencia no debe interpretarse como indicación de enfermedad.
La contaminación microbiana del cuerpo se inicia durante el nacimiento y continúa al
respirar y al alimentarse. Abarca superficies de partes anatómicas, tales como el
tracto digestivo, el tracto respiratorio, el tracto genitourinario, la piel y oído externo.
Sin embargo, los microorganismos en todos estos lugares sólo están
superficialmente y nunca en el interior de los tejidos.

La flora normal se encuentra constante en un sitio dado, a una edad dada y está
compuesta por grupos relativamente fijos, permaneciendo sin alterarse. Si se le
trastorna, vuelve a restablecerse. Si la microflora normal sufre alteraciones o es
eliminada, los microorganismos patógenos pueden responder aprovechando la
situación y entonces proliferar, llegando a causar enfermedad. Las poblaciones de
esta microflora de varias regiones del cuerpo, pueden contribuir en varias funciones
útiles. Por ejemplo la flora intestinal sintetiza varias vitaminas y también ayuda en la
digestión de alimentos. Normalmente, ella tiende a desalojar formas que puedan ser
patógenas. En cualquier situación ecológica se puede lograr un equilibrio entre la
flora normal y los parásitos, sin evidencia de enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS
I. ESTUDIO DE LA FLORA NORMAL BUCAL
1. Con ayuda de un palillo estéril extraiga una pequeña cantidad del sarro existente
entre los dientes y con cuidado deposítelo en el extremo de una placa con tripticasa-
28
soya-agar; enseguida proceda a extender el inóculo en la superficie con un asa
bacteriológica, por estría cruzada.

2. Con otro palillo tome otra muestra de sarro y extiéndalo en un portaobjetos para
hacer un frote. Deje secar y fije con calor. Tiña con Gram. Observe a 100 X. Haga
dibujos.

3. Acerque a la boca una placa abierta de agar nutritivo y pronuncie cinco veces
cada una de las siguientes palabras: fantástico, pústula, satisfecho, chichimecas,
pusilánime, ferrocarril.

II. ESTUDIO DE LA FLORA NORMAL DE LA PIEL.

1. Con un hisopo estéril humedecido en solución salina fisiológica estéril, frote la

palma de la mano y deposite el inóculo en una placa de tripticasa-agar-soya,
extendiendo después con el asa por estría cruzada.
2. Lave con agua la misma mano y sin secar, nuevamente frótela con otro hisopo
estéril, depositando el inóculo en otra placa de agar nutritivo y extendiendo con el
asa por estría cruzada.
3. Incube todas las placas sembradas a 37⁰ C por 24 hs. y compare la abundancia
del crecimiento bacteriano, en los diferentes experimentos. Compare también los
diferentes tipos de crecimiento bacteriano, y determine si hay variaciones en las
diferentes cajas. Haga deducciones.

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

29
 PRÁCTICA 5
CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS

OBJETIVO
Desarrollo de técnicas de laboratorio para comprender la diferencia entre
esterilización y desinfección y determinar la sensibilidad microbiana a diferentes
agentes físicos y químicos.

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes
físicos, procesos físicos o agentes químicos. En los métodos de esterilización queda
implícita la destrucción total de todas las formas de vida. En la desinfección no se
logra la destrucción total.
Agente físico es una condición física o propiedad física que causa un cambio. La
temperatura, la presión y la radiación son ejemplos de agentes físicos que actúan
sobre los microorganismos. Los filtros los retienen. Mediante los procesos físicos se
causan cambios en los microorganismos, por ejemplo la esterilización y la
incineración que los conducen a la muerte. En la higienización, el lavado los
desprende de los materiales.

Un agente químico es una sustancia (sólida, líquida o gas) que se caracteriza por
una composición molecular definida y que causa una reacción en los
microorganismos, por ejemplo los compuestos fenólicos, los alcoholes, el cloro, el
yodo y el óxido de etileno. Dependiendo de la concentración y del tiempo de
exposición, los daña o los mata

MATERIALES Y MÉTODOS
I. FACTORES FÍSICOS:
1. EFECTO DEL CALOR SOBRE LA VIABILIDAD BACTERIANA.
a. Para iniciar el experimento se contará con un cultivo líquido de E. coli y uno de
Bacillus subtilis. Enseguida siembre con una bacteria la mitad de una placa de agar
30
nutritivo por estría contínua cerrada. En otra caja siembre la mitad con la segunda
bacteria.
b. A continuación caliente los frascos con los cultivos líquidos en un baño María a
70 oC por 10 minutos.
c. Con cada uno de los cultivos calentados siembre la otra mitad de cada placa,
con la respectiva bacteria.
d. Incube las placas sembradas a 37⁰C por 24 hs. Compare la abundancia del
crecimiento en las cajas sembradas, antes y después de calentar.

2. EFECTO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA.

Siembre toda la superficie de una placa de agar nutritivo con E. coli por estría y
exponga la caja abierta por 5 min a la luz ultravioleta. Incube igual que en el punto
anterior. Determine si hubo crecimiento bacteriano después de la exposición a la
luz UV.

II. FACTORES QUÍMICOS Y ACTIVIDAD BACTERIOSTÁTICA O BACTERICIDA

1. Siembre la superficie de una placa totalmente por medio de un hisopo
impregnado de una suspensión bacteriana de S.aureus. Haga lo mismo en otra caja
con E. coli.
2. Distribuya varios círculos de papel (5 círculos por caja) impregnados con
antisépticos, limpiadores comerciales y domésticos, colorantes, desinfectantes,
jabones, antibióticos, etc. Deben ser los mismos para las dos bacterias.
3. Incube a 37 C por 24 hs. mida el radio de inhibición alrededor de cada círculo de
papel para cada compuesto y compare entre las dos bacterias probadas. Determine
si hay diferencias en el efecto del mismo compuesto para las dos bacterias.
4. Forme una tabla con los datos y anote detalladamente los resultados.

RESULTADOS DISCUSION Y CONCLUSIONES

31
 PRÁCTICA 6
COCOS GRAMPOSITIVOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Aprender a aislar e identificar los cocos grampositivos.

INTRODUCCIÓN
El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de la flora normal,
incluyendo estreptococos, estafilococos, neisserias, difteroides, levaduras y bacilos
entéricos Gramnegativos. Los cocos grampositivos patógenos se aíslan en agar
enriquecido y suplementado con sangre de carnero. Algunas especies presentan
capacidad hemolítica, parcial (alfa hemólisis) o total (beta hemólisis)
El género Staphylococcus se separa de otros cocos grampositivos por sus
propiedades microscópicas, morfológicas coloniales y bioquímicas. S. aureus es el
único coagulasa positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con
pigmentación amarilla si se incuba a temperatura ambiente y es beta hemolítico. Es
muy resistente a la acción del calor, luz, desecación, temperaturas extremas,
agentes químicos, sobrevive semanas o meses en el polvo, pus o esputo. Es
altamente tolerante a altas concentraciones de sales, sobreviviendo en alimentos
preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de 3mm y vira el indicador
del pH a amarillo. Es resistente a la penicilina. A diferencia de aquél, S. epidermidis
es coagulasa negativo, no-hemolítico.

El género Streptococcus antigénicamente, presenta 13 grupos (clasificación de

Lancefield) en base al carbohidrato C de la pared celular y son denominados de la A
a la O. Los estreptococos del Grupo-A, también son denominados Streptococcus
pyogenes, forman colonias de 1-2 mm, sin color, muy transparentes, beta
hemolíticas y son los más virulentos. La proteína M es el principal antígeno en las
cepas virulentas. Son sensibles a la Bacitracina. Sobreviven semanas en esputo u
otras excretas y meses en sangre o pus.

32
Los estreptococos del Grupo-B incluyen a S. agalactiae y dan la prueba de CAMP
positiva: una hemólisis marcada en forma de punta de flecha en el punto de unión
de su crecimiento con S. aureus.

Streptococcus faecalis (gpo. D) es el único que crece en EMB.

Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) es conocido como

neumococo y desarrolla colonias de 1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolíticas en
condiciones aerobias y beta hemolíticas en anaerobiosis. Las cepas virulentas dan
colonias mucoides debido a que presentan una gran cápsula, lo que constituye su
factor de virulencia. Es difícil de mantener en las resiembras. Es sensible a la
Optoquina.

MATERIALES Y MÉTODOS

I. CEPAS PURAS DE COCOS GRAM POSITIVO

1. Siembre las cepas puras de Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp,
Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae en agar sangre. Incube
todas las placas a 37 oC por 24 hs.
2. Determine las características coloniales de todas las cepas sembradas; cuáles
produjeron hemólisis y de qué tipo.
3. Haga un Gram de las colonias desarrolladas de todas cepas y observe al
microscopio.

II. ESTUDIO DE UN EXUDADO FARINGEO

1. Tome un exudado faríngeo de un compañero con un hisopo estéril, en la forma
tradicional, siguiendo las instrucciones del profesor y deposite la muestra en el
extremo de una placa de agar sangre. Extienda el inóculo con un asa por estría
cruzada. Incube a 37 C por 24 hs.
2. El resto de la muestra que quedó en el hisopo deposítelo en un portaobjetos y
haga un frotis. Tiña con Gram.

33
3. Determine en todas las placas sembradas, cuáles colonias produjeron hemólisis y
de qué tipo.
4. Haga un Gram de las colonias diferentes desarrolladas a partir del exudado.
5. Para la identificación de las bacterias desarrolladas a partir del exudado, compare
las características coloniales y microscópicas de las bacterias desarrolladas, con las
de las cepas puras.

III. IDENTIFICACIÓN del Género Staphylococcus

Para la cepa pura de Staphylococcus aureus y las colonias semejantes a S. aureus
y/o a Staphylococcus sp. del exudado faríngeo, haga la siguientes pruebas:

1. Prueba de la catalasa: Tome una colonia bien aislada con el asa estéril y
sumérjala en una gota de agua oxigenada. Observe una efervescencia por
desprendimiento del O2.

2. Prueba de la coagulasa: Con el asa estéril obtenga una colonia beta hemolítica
bien aislada y mézclela con 0.5 ml de plasma. Incube a 37 oC por 30 min y lea el
resultado. Si hay coagulación del plasma, es coagulasa positivo.

3. Cultivo en medio de agar-sal-manitol: Elija con el asa estéril una colonia bien
aislada, Beta hemolítica y siémbrela en una placa de sal-manitol-agar por estría
cruzada. Incube a 37 oC durante 24 hs. Observe el desarrollo de colonias color
dorado, así como la aparición de color amarillo en el medio, debido a la
fermentación y acidificación del manitol.

IV. IDENTIFICACIÓN DEL GÉNERO STREPTOCOCOCCUS

1. Streptococcus pyogenes (estreptococos Grupo-A):

a. Prueba de sensibilidad a la Bacitracina.
Para el efecto elija una colonia sospechosa bien aislada a partir del exudado y
siémbrela por estría cerrada, en una placa de agar-sangre. A continuación, en la
mitad de la caja coloque un círculo de papel filtro impregnado con Bacitracina.
b. En el otro sector de la placa anterior, coloque un círculo impregnado con

34
Trimetroprim para determinar la resistencia bacteriana a este antibiótico del
Streptococcus pyogenes
c. Siembre en otra placa nueva, una cepa pura de S. pyogenes por estría cerrada y
realice las mismas pruebas con los dos antibióticos anteriores.
d. Incube todas las cajas a 37 oC por 24 hs. Determine el diámetro del halo de
inhibición alrededor de cada antibiótico para determinar la sensibilidad.
e. Deduzca si la bacteria aislada del exudado resultó ser S. pyogenes.

2. Streptococcus agalactiae (estreptococos Grupo-B):

Su identificación se realiza principalmente con la prueba de CAMP.
Para el efecto, tome una colonia beta hemolítica con el asa y siémbrela en una sola
línea, perpendicular a otra línea previamente sembrada con S. aureus. Incube a 37
C por 24 hs. Determine si hubo hemólisis en forma de punta de flecha, en el lugar
donde se unen las dos bacterias.

Prueba camp

3. Identificación de Streptococcus del grupo C:

En una caja petri inocule una colonia de estreptococo y coloque un círculo de
trimetroprim sulfametoxazol, para determinar su sensibilidad al antibiótico.

4. Identificación de Streptococcus grupo D.

Inocule un tubo con agar bilis esculina e incube por 24 hs. Y observe si hubo
crecimiento y cambio de color del medio de cultivo.

5. Identificación de Streptococcus pneumoniae:

Siembre la cepa pura de Streptococcus pneumoniae en una caja con agar sangre y

35
coloque un círculo de papel con el antibiótico Optoquina. En otra caja siembre una
colonia sospechosa y adicione también un disco con el mismo antibiótico. Incube a
37⁰ C por 24 hs. Mida el halo de inhibición para determinar la sensibilidad. Anote
detalladamente los resultados.
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES:

36
37
 PRÁCTICA 7
BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Desarrollo de las técnicas para el aislamiento e identificación de las bacterias ácido
alcohol resistentes, en especial Mycobacterium tuberculosis .

38
INTRODUCCIÓN

La característica más sobresaliente de las mycobacterias es la gran cantidad de

lípidos que poséen en su pared celular (aprox. el 40 % del peso seco total celular),
dando lugar a colonias hidrófobas de aspecto ceroso. Son difíciles de teñir, pero
una vez coloreados resisten a la decoloración, incluso con etanol de 95 %
conteniendo 3 % de HCl, por lo que se les conoce como bacterias ácido-alcohol
resistentes (BAAR) al teñirse con la técnica de Ziehl-Neelsen. Presentan esta
propiedad solo los géneros Mycobacterium y Nocardia. Las infecciones en humanos
por Mycobacterium son básicamente la tuberculosis y la lepra.
M. tuberculosis crece mejor a 37oC y desarrolla colonias en medio a base de huevo,
llamado medio de Lowenstein Jensen entre los 12-21 días de incubación, pero
nunca antes, son de crecimiento lento. No produce pigmento en la luz o en la
obscuridad (de color blanco), salvo un ligero color amarillento. Es niacina positivo,
son aerobias estrictas, reducen NO3 a NO2, es ureasa positivo. Más del 95 % de las
cepas aisladas son susceptibles a las drogas antituberculosas, ej. isoniacida,
estreptomicina, rifampicina, pirazinamida y el etambutol. Ocasionalmente otras
especies de Mycobacterium pueden causar enfermedades, como M. bovis, M.
ulcerans y M. scrofulaceum. La especie M. leprae, no crece en medios de cultivo.

Acido- alcohol resistencia es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia

a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción
del fenol y el calor. Una vez teñida tiene la capacidad de resistir la decoloración de
una combinación de alcohol-ácido, de donde viene el nombre de alcohol-ácido
resistente.

La alta concentración de ácido micolico en la pared es la causante de la baja

absorción y alta retención de la fucsina.

Tradicionalmente se habla, a la hora de clasificar a las especies de micobacterias

típicas de Mycobacterium tuberculosis o Bacilo de Koch y Micobacterium leprae o

39
bacilo de Hensen y las micobacterias atípicas a aquellas que producen patología
variada, generalmente en pacientes inmunodeprimidos..

Mycobacterium tuberculosis es un parásito intracelular que pervive dentro de los

macrofágos tras la fagocitosis. Debido a ello tiende a formar granulomas, por la
acumulación de sucesivas células gigantes multinuleadas para intentar fagocitar al
microorganismo. La activación enzimática de los macrófagos provoca, a largo plazo,
la llegada de nuevos tipos celulares a la región inflamada. Las células epiteliales
engloban a los macrofágos formando un tejido que puede necrosarse o calcificarse,
con un caseum central que caracteriza a los granulomas tuberculosas.

La tuberculosis primaria consiste en la formación de lesiones granulomatosas

calcificadas en el pulmón, principalmente en los lóbulos superiores. De ahí, la
infección puede extenderse a ganglios hiliares, que , si se calcifican, forman junto
con los granulomas, los llamados complejos de Gohn (foco neumónico +
adenopatía hiliar). Es típico el derrame pleural en la tuberculosis primaria.

En la tuberculosis postprimaria (60 %) se produce por reactivación y el 40 % por

reinfección. Son típicas las lesiones cavitarias en los lóbulos superiores y la
deseminación broncógena a campos inferiores. El derrame pleural no es
característico de la tuberculosis postprimaria. De ahí, la infección puede extenderse,
sobre todo en pacientes inmunodeprimidos, por la vía hematógena, formando la
llamada tuberculosis miliar (granulomas diminutos en múltiples órganos, sobre todo
en el hígado).

El diagnóstico de sospecha de tuberculosis es clínico y radiológico: la presencia de

clínica compatible junto con imágenes radiológicas que puedan sugerir granulomas
orienta hacia la tuberculosis. La confirmación se realiza por la prueba de tuberculina
(PPD: derivado proteíco purificado).

MATERIALES Y MÉTODOS.
40
I. TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN.
1. Obtenga del profesor preparaciones de esputo de pacientes tuberculosos,
previamente fijadas y teñidas con Ziehl-Neelsen. Haga observaciones al
microscopio a 100 X. Localice las bacterias BAAR.
2. Haga cultivos de Mycobacterium sp. saprófito, en medio de Lowenstein Jensen, e
incube más de una semana a 37oC, determinando los días requeridos para el
crecimiento. Compare el tiempo que necesita M. tuberculosis para crecer, con el de
la cepa sembrada.

II. TINCION CON INMUNOFLUORESCEÍNA.

A partir de un hospital obtenga frotis previamente fijados de M. tuberculosis o de
muestras de esputo de tuberculoso y desarrolle la técnica serológica con
anticuerpos marcados con fluoresceína. Observe al microscopio fluorescente.
Determine cómo se diferencian las BAAR en los frotis, debido a la fluorescencia.

CUESTIONARIO.

1. Investigue qué animales son susceptibles a M. leprae y cuáles pruebas se

efectúan en el diagnóstico de M. leprae, y por qué no se hace aislamiento.

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.

41
 PRÁCTICA 8
BACTERIAS ANAEROBIAS ESTRICTAS.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Desarrollar algunas técnicas especiales para el cultivo e identificación de bacterias

anaerobias estrictas como Clostridium. Comprender los mecanismos bioquímicos
del metabolismo anaeróbico y de las técnicas de cultivo en anaerobiosis.

INTRODUCCIÓN.

Las bacterias anaerobias obligadas (estrictas) son incapaces de utilizar oxígeno

molecular en las reacciones productoras de energía y de hecho, son dañadas por el
Oxígeno. El género Clostridium es el ejemplo común. Los radicales de superóxido
libres (O2− ) se forman en pequeñas cantidades durante la respiración normal de los
organismos que usan oxígeno como aceptor final de electrones, formando agua.
Los anaerobios obligados en presencia de oxígeno parecen formar algunos
radicales de peróxido libres, que eliminan o inhiben el crecimiento de estos. Estos
radicales también son tóxicos para los aerobios, los anaerobios facultativos y los
aerotolerantes, pero producen la enzima superóxido dismutasa para neutralizarlos,
formando O2 y peróxido de hidrógeno. Como el H 2O2 también es tóxico, los
aerobios lo neutralizan con la enzima catalasa que lo convierten en agua y O 2. Las
bacterias anaerobias están ampliamente distribuídas en la naturaleza.

El género Clostridium incluye bacilos grampositivos anaerobios estrictos,

esporulados; carecen de citocromo-oxidasa, no presentan catalasa ni peroxidasa y
algunos pueden digerir proteínas. Unos digieren la leche, otros la acidifican y un
grupo más la fermenta. Los clostridia se asocian en general a infecciones de
heridas y de tejidos blandos, intoxicaciones alimentarias y colitis
42
seudomembranosa. Su capacidad patógena se atribuye a la sobrevivencia en
condiciones adversas a través de la formación de esporas. El crecimiento es
rápido en medios enriquecidos y desprovistos de oxígeno y la producción de
numerosas toxinas enterotoxinas y neurotoxinas.

Los miembros del género Clostridium se detectan comúnmente en el suelo, en el

agua y como parte de la flora microbiana normal; en humanos y animales se
encuentran en la cavidad oral alrededor de los dientes y en el tracto
gastrointestinal. En los últimos años el diagnóstico de las infecciones por
anaerobios se ha incrementado, probablemente como consecuencia del progreso
en los métodos de aislamiento en el laboratorio y ya no pasan inadvertidas.
También hay una mayor proporción de pacientes que reciben drogas
inmunosupresoras, permitiendo el desarrollo de anaerobios. Estas bacterias
generalmente se establecen en áreas con daño tisular, tras lo cual puede
sobrevenir una sepsis, con formación de abscesos distantes y una cadena
progresiva de hechos hacia un desenlace fatal. La gangrena gaseosa es causada
por Clostridium perfringens,

EL género Clostridium está formado por un grupo heterogéneo de bacilos Gram

positivos, anaerobios , esporulados, la mayoría de ellos mó viles. Está ampliamente
distribuido en el ambiente y tracto gastrointestinal de muchas especies, incluido el
hombre.

El género Clostridium puede causar infecciones de origen exó geno y endó geno. Las
especies má s frecuentes son: C. botulinum, C. difficile, C. perfringes y C. tetani. Algunos
tienen capacidad de producir potentes exotoxinas que son las responsables de
ocasionar cuadros tó xicos graves.

La especie de C. tetani presenta una espora terminal en típica apariencia de raqueta

al observar el bacilo. Es un bacilo fino, esporulado mó vil, sin cá psula, no sacarolítico ni
proteolítico, no invasivo y posee flagelos perítricos. Sintetiza las tó xinas
tetanopasmina y tetanolisina.

C. botulinum produce el botulismo, puede ser protelítico o no.

El C. perfringes produce la gangrena gaseosa, celulitis y toxicoinfecciones

alimentarias, enteritis necrosante, diarreas enterotó xicas , es capsulado, sacarolítico y
produce gases CO2 y H2 y no suele ser esporulado. En tició n de Gram se observa
ausencia de polimorfonucleares, debido a que son destruidos por la tó xina alfa.

La toxina alfa es lecitinasa, la cual hidroliza a la lecitina de los fosfolípidos

(componente de la membrana celular) y se observa una zona opaca que representa el
diacilglicerido insoluble alrededor las colonias de C. perfringes.

43
El C.difficile produce una enterocolitis pseudomembranosa. Es un bacilo Gram
positivo, mó vil, capsulado. Sintetiza dos toxinas: A (enterotoxina) y B (citotó xina). Se
encuentra en heces de neonatos y lactantes (70 % ); los ancianos y pacientes con
administració n de antimicrobianos. Comienza de 4 a 10 días después del tratamiento
antimicrobiano pero un 25 % de los pacientes que la presentan luego de concluir este.
Es una infecció n endó gena.

MATERIALES Y MÉTODOS.

1. Siembre algunas especies diferentes de Clostridium a partir de tubos con medio

de tioglicolato. Siembre placas de agar sangre o de tripticasa agar soya por estría
cruzada y cultívelas en condiciones de anaerobiosis, ya sea en una jarra para
anaerobiosis o en una jarra bien cerrada, y deje una vela prendida adentro. Incube
a 37 C por 48 hs.

2. Determine el desarrollo de colonias secas, aplanadas, de bordes irregulares,

grisáceas, características de Clostridium. Determine si hubo hemólisis.

3. A partir de colonias bien aisladas haga un Gram para determinar si corresponden

a bacilos grampositivos esporulados. Determine el diámetro con respecto al bacilo y
la posición de la espora dentro del bacilo.

4. Siembre diferentes sustratos para la identificación bioquímica del clostridium

según la tabla anexa

LECHE GLUCOS LACT MAL SAC. RED. INDOL H2S LECITI MOV
A NITR.
OSA TOSA NASA

C. botulinum A + - + +-/- - - -

C. tetani C _ - _ - - + - +

C. perfringes ACGS + + + + + - + +

C. novyl CG(D) + - + - - - + + +

C. septicum ACG + + + - + - + - +

C. CD _ _ _ - - - + - -
histolyticum

44
C. tertium ACG + + + + + - - +

C. A + - - - - + +
hemolyticum

C. sporógenes D + - + - + - - +

C. difficile + - +

S=
tumultuosa

C = coagulo D=
digest.

G = gas A=
á cido

5. Identifique las especies de Clostridium sembradas, tomando en cuenta los datos

de la tinción, la forma de la espora, así como su posición dentro de la célula, y los
resultados de las pruebas bioquímicas. Compare con las tablas de datos de la
literatura.
6. Explique los mecanismos químicos que permitieron logar la anaerobiosis en
cada medio

RESULTADOS DICUSION Y CONCLUSIONES

45
 PRÁCTICA 9
ENTEROBACTERIAS

OBJETIVO. Desarrollar las técnicas de aislamiento e identificación de

enterobacterias, comprendiendo el significado de las pruebas bioquímicas.

INTRODUCCIÓN
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos,
anaerobios facultativos que fermentan la glucosa en anaerobiosis; citocromo
oxidasa negativos; reducen los nitratos a nitritos. Cuando son móviles son
flagelados peritricos. Son llamadas enterobacterias porque con frecuencia residen
en el aparato digestivo de animales y humanos, pero algunas especies también
viven en la tierra y en el agua. Incluye los géneros Escherichia, Shigella,
Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia,
Morganella, Proteus, Providencia, Yersinia, Erwinia y Pantoea. La mayoría
forman parte de la flora normal o son bacterias ambientales, a excepción de los
géneros Salmonella, Shigella y Yersinia, quienes son causantes de infecciones
gastrointestinales; es por eso que cuando se detectan en heces, es muy probable
que estén causando daño.

Cuando las enterobacterias se introducen a un sitio del cuerpo estéril, producen

enfermedades como neumonía, infecciones de vías urinarias, septicemia,
infecciones neonatales, infecciones de heridas y de cirugías. Se comportan como
patógenos oportunistas, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos.

A semejanza de las enterobacterias, los géneros Campylobacter y Helicobacter

causan enfermedades gastrointestinales. Campylobacter es un bacilo curvo
gramnegativo, microaerofílico, con un solo flagelo polar. Causa enteritis aguda.

46
Helicobacter es un bacilo curvo, microaerofílico, con flagelos polares múltiples.
Requiere medios específicos para cultivarse. Causa gastritis crónicas y úlceras
gástricas y duodenales, así como cáncer.

MATERIALES Y MÉTODOS.

I. AISLAMIENTO EN MEDIOS SELECTIVOS:

1. A partir de cepas puras de enterobacterias, siembre por estría cruzada

placas de SS, EMB y agar-verde-brillante, descargando la muestra con el
asa en un extremo de la caja y extendiendo después. Incube 24 hs a 37 o C.
2. En agar-verde brillante todas las salmonellas, excepto S. typhi, forman
colonias rojas o rosas a las 48 hs de incubación. El Proteus mirabilis forma
colonias amarillas o amarillo-verdosas con un halo amarillo verdoso.
Escherichia coli no crece.
3. En EMB Escherichia coli forma colonias negruzcas o moradas,
usualmente con brillo verde metálico. Las shigellas producen colonias sin
color
4. En Shigella Salmonella agar, las cepas de Enterobacter forma colonias
rojas o rosas a las 24 hs. Salmonella forma colonias sin color con centro
negro. E. coli crece poco.
5. Haga un Gram de las colonias obtenidas y compruebe que son de
bacterias gramnegativas.

II. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE

ENTEROBACTERIAS:

1. Medio agar-kligler
Este medio contiene doble azúcar, en tubo inclinado, es un medio de color
naranja, que permite determinar la fermentación de lactosa y glucosa. Con una
asa normal con anillo, se toma una colonia bien aislada y se siembra por estría en
la superficie de agar del tubo. Usando una asa recta sin anillo, con el extremo del

47
alambre tome otra colonia igual a la anterior de la misma cepa y siembre por
picadura en el centro del tubo, sin tocar el fondo, cuidando que no le tiemble la
mano (aguantando la respiración). Incube 24 hs a 37 oC. Al cabo de este término,
la fermentación de la glucosa ocurre en anaerobiosis hasta ácido en el fondo del
tubo, lo cual se manifiesta por un cambio de color del indicador de pH en el
medio, de rojo a amarillo, y la degradación de la lactosa es en aerobiosis,
indicada por la aparición de un color amarillo en la superficie del agar, además se
produce H2S que proviene del tiosulfato de sodio. El H2S reacciona con Fe y se
produce sulfuro de hierro (color negro).

2. Medio de SIM
Es un medio color beige. A partir de una colonia siembre un tubo por picadura en
el centro, sin tocar el fondo, e incube 24 hs a 37 oC.
a) La producción de sulfuros (H2S) toma lugar a partir de aminoácidos con azufre
y es indicada por la aparición de un color negro
b) La movilidad positiva es demostrada al crecer la bacteria homogéneamente en
todo el medio, observándose una turbidez.
c) La producción del metabolito indol por hidrólisis del aminoácido triptófano, es
indicada por un anillo de color rojo que se forma después de adicionar unas 2 o 3
gotas del reactivo de Kovacs.

3. Medio MIO
Es un medio de color morado. Siembre una colonia por picadura en el centro del
tubo e incube igual. El indicador de pH en el medio cambia de color, de café a
color violeta al alcalinizarse, lo que indica la descarboxilación de la ornitina por la
enzima ornitina-descarboxilasa. Tiene tripteina y clorhidrato de L-ornitina y el
indicador púrpura de bromocresol (pH 6.5). El triptófano presente es sustrato de la
enzima trptofanasa que lo convierte en indol. La descarboxilación de la ornitina
permite se alcalinice el medio provocando el vire del indicador de pH azul de
bromotimol a un color púrpura.

48
4. Prueba de Citrato
Esta prueba permite determinar la capacidad de la bacteria de utilizar el citrato
como única fuente de carbono (color verde) en tubo inclinado. Para el efecto
siembre una colonia por estría en la superficie del agar e incube igual. El
crecimiento y el cambio de color del indicador de pH a azul en condiciones
alcalinas, es indicativo de la utilización del citrato (positiva). El indicador es azul
de bromotimol (a Ph 7.6).

5. Prueba de hidrólisis de la Urea.

El medio con urea en tubo con agar inclinado presenta un color rosa pálido a
beige. La siembra se efectúa por estría y se incuba igual. La aparición de un color
rosa brillante (rosa mexicano) en el medio, indica la acción de la ureasa
hidrolizando la urea y alcalinización del medio. El indicador de pH es el rojo fenol
y se torna rosa en condiciones alcalinas. Se liberan NH3, CO2 y agua. El
amoniaco en solución forma carbonato de amonio que alcaliniza el medio y
permite que el rojo fenol vire a una coloración rosa mexicano.

Urea + H20 ---------------------------------------------CO2 + NH3

6. Prueba de Fenil alanina

Este medio en tubo con agar inclinado de color blanco transparente se siembra en
la superficie y por picadura. Después de la incubación se agrega cloruro férrico,
interpretándose como positivo si aparece una coloración verdosa, que indica la
desaminación oxidativa de la fenil alanina que liberó ácido fenilpirúvico. Después
se añade cloruro férrico que reacciona con el ácido fenilpirúvico y se forma una
coloración verde.

7. Prueba de lisina-iron-agar (LIA)

Esta prueba en tubo con agar inclinado de color morado y se siembra por estría
en la superficie y por picadura. Permite diferenciar microorganismos,
especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la
lisina. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de
49
la producción de ácido sulfhídrico. El púrpura de bromocresol, es el indicador de
pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH
igual o mayor a 6.8. La desaminación produce ácido carboxílico y NH3 dando
lugar a un color rojo intenso y ácido sulfhídrico. La descarboxilación libera aminas
que alcalinizan el medio (violeta). El H2S precipita como sulfuro ferroso
(precipitado negro).

8. Prueba de Voges Proskawer

Esta prueba en medio líquido en tubo, se realiza para determinar la capacidad de
un microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía
ácido-mixta o con producción de acetoína por la vía butanodiólica. Después de la
incubación, el cultivo se divide en dos tubos y se adicionan los reactivos
diferentes por separado.
1. Prueba del rojo de metilo: Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo
al 0.04%, observar el color del medio. El rojo de metilo, es un indicador, permite
revelar la presencia de productos ácidos.
Positivo: color rojo. Negativo: color amarillo.
2. Prueba del Voges Proskauer: Añadir 0.6 ml de alfa-naftol al 5% en alcohol
etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar
vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
Observar el color de la superficie del medio. La adición de alfa naftol e hidróxido
de potasio permite evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa
agitación del tubo. Negativo: ausencia de color rojo.
La prueba de VP permite determinar la presencia de de diacetlico que se forma de
la acetoina que constituyen intermediarios de la síntesis de 2-3 butanodiol, un
producto resultante de la fermentación de la glucosa.

9. Prueba del indol. El indol es producido a partir de triptófano por la actividad de

la enzima triftofanasa. Se le agrega unas gotas de reactivo de Kova.s y se forma
un anillo rojo en la superficie de los medios SIM y MIO. La bacteria Escherichia

50
coli da positivo.

Haga una tabla de resultados y compare con los datos de la literatura. La

identificación de las bacterias encontradas puede efectuarse hasta género o hasta
especie, según el número de datos. Una vez identificada la bacteria, investigue las
enfermedades que ocasiona.

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.

51
52
 CAPITULO-II

PARASITOLOGÍA

53
 PRÁCTICA 1
MANEJO DE MUESTRAS Y COPROPARASITOSCÓPICO DIRECTO

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Conocer brevemente los parásitos humanos así como los métodos manejo de
muestras fecales y observación directa al microscopio.

INTRODUCCIÓN

Los parásitos se definen como organismos que viven a expensas de otro

organismo (el huésped) y que dependen de él para realizar todas sus funciones.
Las asociaciones biológicas entre los seres vivos se iniciaron con la aparición de
la vida misma sobre el planeta Tierra, al competir éstos por el espacio y ponerse
en contacto íntimo. Las enfermedades parasitarias han producido a través de los
tiempos más muertes y daño económico a la humanidad que todas las guerras
juntas. En la República Mexicana y generalmente en los países en desarrollo, es
donde las enfermedades parasitarias se presentan con mayor frecuencia,
viéndose favorecidas por las condiciones climáticas cálidas o templadas y por la
falta de cultura médica en el pueblo. La mortalidad por enfermedades parasitarias
es un problema común a los diferentes grupos etáreos, pero su magnitud destaca
en la niñez, evaluándose en términos de muerte prematura y que repercute en
años de vida potencial perdidos.

Las enfermedades por parásitos conforman un gran grupo heterogéneo de

trastornos que pueden afectar a todos los órganos, aparatos y sistemas. El

54
diagnóstico de las enfermedades parasitarias se confirma mediante el hallazgo en
forma objetiva del agente etiológico, ya que en la parasitología los diagnósticos
deben ser etiológicos de certeza y no presuncionales.

Para tales fines existen diversos métodos denominados parasitoscópicos.

Dependiendo de la parasitosis que se sospeche, será la indicación de cada uno de
ellos. Los exámenes parasitoscópicos se pueden dividir en cualitativos y
cuantitativos. Los cualitativos indican el tipo de estructuras parasitarias presentes
en la muestra, los cuantitativos informan la magnitud de la parasitosis.

Los parásitos pertenecen a grupos de organismos muy diversos. De acuerdo con

la clasificación propuesta por Woese en 1990, los parásitos quedan incluidos en el
el Dominio Eukaria, los Protozoarios se ubican dentro del Reino Protista, mientras
que los Helmintos (gusanos) y los Artrópodos se incluyen dentro del Reino
Animalia.

Protozoarios: Son un grupo de organismos unicelulares, eukariotas, y carecen de

pared celular. Dentro de este grupo se conocen varios parásitos de importancia
médica, considerados dentro de los philum Sarcomastigophora (amibas y
flagelados), Apicomplexa, Ciliophora y Microspora.
Hemintos (gusanos): presentan los philum, Platyhelminthes (gusanos planos, la
mayoría hermafroditas), Nematoda (gusanos cilíndricos, con sexos separados) .
Algunos parásitos presentan más de una fase en su ciclo vital, siendo posible que
todas las fases sean parásitas, o solo algunas de ellas. Para completar su ciclo
vital, algunos requieren solo un huésped (monoxeno), otros necesitan más de un
huésped (heteroxeno), mientras que ciertas especies requieren pasar una etapa
de su vida en la tierra, tal es el caso de los geohelmintos.
Algunos parásitos humanos también tienen la capacidad de infectar especies
animales causándoles la misma enfermedad (parásitos zoonóticos)

MANEJO DE MUESTRAS FECALES Y EXAMEN MACROSCÓPICO.

55
En el manejo de los productos biológicos es donde va a radicar el éxito o el
fracaso de un diagnóstico en enfermedades parasitarias. Es necesario seguir
ciertos lineamientos pre-establecidos para cada producto.

Recolección de las muestras:

Las muestras fecales son seriadas con un mínimo de tres días consecutivos, salvo
otras indicaciones. La obtención de las muestras fecales se puede hacer de
diferentes maneras; la más frecuente es por la expulsión natural. La segunda se
puede obtener con purgantes y la otra es de qué se toma por medio de la
cucharilla rectal. La que se utiliza con mayor frecuencia es la primera, la
segunda se utiliza en casos muy especiales como en amebosis intestinal crónica
y en estrongiloidosis; Finalmente, la toma con cucharilla rectal se utiliza en los
lactantes.

Manejo de los especímenes:

Se deben utilizar frascos estériles de boca ancha y se evitará la contaminación con
tierra, agua u orina. Es necesario guardar los frascos con las muestras en lugares
frescos, pues el calor acelera los fenómenos de fermentación y con el frío se pueden
destruir los quistes y trofozoítos de protozoos (Goldman y Johnson, 1950; Chang,
1955); deberán etiquetarse con el nombre de la persona, edad, sexo, fecha y hora
de expulsión de las heces.

Conservación:
Los conservadores pueden ser físicos o químicos. Los medios físicos, son las
temperaturas bajas, de 10º C que es la temperatura del refrigerador; se utilizan
sobre todo para heces formadas, las cuales incluso pueden llegar a examinarse 24 y
hasta 48 horas después de evacuadas, lo que no sucede con las heces diarreicas,
que deben examinarse en un plazo no mayor de una hora y no deberán refrigerarse.
Los métodos químicos permiten la conservación durante un tiempo más prolongado,
sin correr el riesgo de que los parásitos se deformen o se destruyan.

Conservadores y preservadores químicos:

 Solución de formalina al 10 %.
56
  Solución de formalina al 5%.
 Solución de merthiolate-yodo-formaldehído (MIF).
 Fijador de fenol-alcohol-formol (PAF)

La mayoría de los Nemátodos puede fijarse en alcohol 70° caliente o en alcohol

acético (1 parte de ácido acético y 3 partes de alcohol 95°). Los Nematodos se
almacenan en alcohol 70°. Se agregan unas pocas gotas de glicerina a fin de
impedir la desecación en caso de evaporarse el alcohol durante ese tiempo.

Tamizado de heces:
En ocasiones el paciente elimina por vía digestiva, estructuras que se pueden
visualizar a simple vista, por ser relativamente grandes y que se identifican
fácilmente. Tal es el caso de Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis,
Trchuris trichiura y progótidos de Taenia sp. Algunos helmintos como Taenia spp.
no liberan en forma habitual huevos en el intestino, por lo que no es común
encontrarlos en los exámenes coproparasitoscópicos convencionales, realizados
microscópicamente. Sin embargo, se eliminan proglótidos (segmentos del
parásito) que son macroscópicos y se pueden identificar mediante el tamizado de
heces. Estes deben realizarse por lo menos en 3 ocasiones, en evacuaciones de
24 hs. Igualmente, a las 72 hs después del tratamiento, se repite el tamizado para
la búsqueda de escólex.

En las heces se puede determinar a simple vista la consistencia, es decir acuosa ó

líquida, blanda, pastosa o semiformada, formada y dura. En heces líquidas es
común encontrar trofozoítos de protozoarios, a diferencia de las sólidas donde se
encuentran quistes.
El olor fecal característico, se hace fétido en muchas infecciones, por la acción de
microorganismos fermentativos o de putrefacción que actúan sobre carbohidratos
y proteínas como el indol y el escatol.

En algunas infecciones es característica la presencia de moco y/o sangre roja, que

coincide con el síndrome disentérico, común por Entamoeba histolytica, con daño
a nivel del colon. Cuando los daños son a nivel de intestino delgado, como en el
57
caso de Necator americanus se relaciona con la sangre oscura, por causar
sangrado en el duodeno.

MATERIALES Y MÉTODOS

DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE COPROPARASITOSCÓPICO DIRECTO

Precaución: Las heces son potencialmente infectantes, debido a la presencia de
parásitos viables. Se deben extremar las precauciones durante todo el procedimiento
de manejo.
Este examen en fresco solo consiste en tomar la muestra y hacer su observación al
microscopio. Es sencillo, rápido y económico, pues requiere poco material. Una
desventaja es que la muestra utilizada es muy pequeña y poco representativa.
Está especialmente indicado en la búsqueda de trofozoítos y quistes de protozoarios,
así como de huevos y larvas de helmintos. Es de gran utilidad para la detección de
trofozoítos y quistes de protozoarios como Entamoeba histolytica, Giardia lamblia,
Balantidium coli, Trichomonas hominis y Blastocytis hominis.
Los montajes en solución salina tienen la ventaja de que retienen la movilidad de los
trofozoitos, sin embargo, es difícil la observación de las estructuras internas, pues
con frecuencia son poco definidas. El Lugol (Yodo-KI) se emplea para destacar las
estructuras internas de los parásitos presentes y se pueden identificar con facilidad
quistes de protozoarios, pero inmoviliza los trofozoítos.

1. Cada alumno debe trabajar una muestra control positiva proporcionada por el
profesor. Además, debe observar una muestra propia del mismo alumno,
recolectada de manera correcta como se mencionó anteriormente. En un frasco
estéril una muestra de heces equivalente al tamaño de una nuez.

58
 2. Observar cuidadosamente las características macroscópicas de la muestra,
con la finalidad de determinar su consistencia, olor, presencia de moco, sangre y/o
parásitos macroscópicos.

3. Con un aplicador se toma una muestra de heces (lo que se quede adherido solo
en la punta), eligiendo de preferencia una parte que contenga moco y/o sangre y se
deposita en una gota de solución salina fisiológica, colocada previamente en un
portaobjetos, haciendo una suspensión uniforme (no se hace frote) y se retiran los
detritos macroscópicos. Se monta con un cubreobjetos, cuidando que no queden
burbujas. Si le falta reactivo, se le adiciona por una de las orillas del cubreobjetos.

4. Observe al microscopio, a 10 X y después a 40 X.

5. Con ayuda de los libros de parasitología, identifique los diferentes tipos de

residuos fecales (artefactos), así como los posibles parásitos y compárelos, para
llegar hasta género.

6. Realice dibujos detallados de los protozoarios encontrados en las heces

estudiadas. Hay posibilidad de que encuentre Giardia, E. histolytica, Balantitdium y
Cryptosporidium principalmente.

7. Se repite la operación en otro portaobjetos con una gota de lugol, y se observa al

microscopio, para buscar los parásitos. Con el lugol se observaran estructuras
internas teñidas de los parásitos.

5. Al terminar la observación, igualmente haga otra preparación, pero ahora con una
gota de rojo de metilo, otra con una gota de tinta china y finalmente en una gota de
solución de Noland.

6. Es importante que se vaya elaborando la preparación de una en una, con cada

reactivo diferente, manteniéndola sin burbujas y observándola enseguida al
microscopio, ya que de lo contrario, al secarse el reactivo no es posible la
observación de los parásitos.

59
7. Con el rojo de metilo se observaran vacuolas ácidas, con una coloración roja,
mientras que las vacuolas alcalinas se observan amarillas.

8. Con tinta china diluída se observaran partículas incluidas por pinocitosis

9. Con la solución de Noland se observa la presencia de flagelos.

10. Anote detalladamente las características microscópicas de los parásitos

observados y haga dibujos. Comparando con la literatura, determine el Género y si
es posible la especie del parásito, fase del ciclo vital observada, estructuras
observadas, y la amplificación utilizada en el microscopio.

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN.

60
 PRÁCTICA 2
CONCENTRACION DE PARÁSITOS INTESTINALES POR
FLOTACIÓN

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA.
Que el alumno desarrolle y comprenda el fundamento de la técnica de concentración
de parásitos por flotación, para el diagnóstico de parásitos intestinales.

INTRODUCCIÓN.
Al estudiar muestras fecales, la presencia de los parásitos puede ser escasa o
nula, por lo que no se detectan en el coproparasitoscópico directo, motivo por el
cual se debe cambiar el método, con el fin de concentrar los parásitos en la
superficie de una fase líquida, por centrifugación y flotación, como en la técnica de
Faust, o por el método de Willis (flotación en salmuera) o el método de Sheater
(flotación en sacarosa). Del concentrado se toma la muestra para la observación al
microscopio.

La concentración de parásitos por flotación en muestras fecales permite comprobar

la existencia de quistes de protozoos, huevos o larvas de helmintos, aún cuando
estén presentes en pequeñas cantidades. Esta técnica se basa en la propiedad que
tienen las soluciones de densidad mayor, para hacer flotar objetos menos densos,
como los huevos y quistes de parásitos, los cuales son colectados en la superficie
del líquido y observados al microscopio. La técnica de concentración con sulfato de
61
zinc proporciona una suspensión de parásitos muy limpia y es útil para la
recuperación de quistes de protozoarios y de la mayoría de los huevos de helmintos.
El método de Faust, con ZnSO4, es uno de los más utilizados y es recomendado
para infecciones parasitarias intestinales, pudiéndose detectar quistes de
protozoarios y huevos de helmintos, aunque es poco eficaz para huevos pesados
como los de Tremátodos o como los huevos no fértiles de Ascaris. Tampoco es muy
efectivo para muestras de heces ricas en grasas. Este método puede realizarse en
muestras recientes, refrigeradas o fijadas con formol (5% ó 10%).

MATERIALES Y MÉTODOS

MÉTODO DE FAUST, CON ZNSO4.

1. Cada alumno examinará una muestra fecal positiva con parásitos, proporcionada
por el profesor.
2. Cada alumno, también observará su muestra personal, dicha muestra debe ser
reciente. Si es de la noche anterior debe ser refrigerada mientras se lleva al
laboratorio. La muestra fecal es del tamaño equivalente al de una nuez y se coloca
en un frasco estéril.
Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones
durante todo el procedimiento.
3. Con un abatelenguas se toma aproximadamente 1 g de heces (el tamaño de un
cacahuate) y se deposita en un vasito que contenga de 10 a 15 ml de agua de la
llave y se mezclan con un aplicador de madera.
4. La suspensión se filtra a través de una coladera o malla y se transfiere el filtrado
en un tubo de centrífuga de 14 ml. Se tapa con un tapón de hule y se agita
vigorosamente. Se adiciona agua hasta que la muestra quede por 1 cm debajo del
bordo superior del tubo.
5. Se centrifuga por 45 segundos a 2500 rpm. Debe romperse cualquier acúmulo
que pudiera haberse formado en la parte superior y se decanta el sobrenadante.
6. Se Añaden 2 a 3 ml de agua de la llave y se agita para resuspender el sedimento.
Se resuspende nuevamente el sedimento, adicionando agua de la llave poco a poco,
62
hasta que quede la muestra a 1 cm del borde superior del tubo. Se centrifuga de
nuevo.
7. Se decanta el sobrenadante y se agregan al sedimento 2 a 3 ml de sulfato de zinc
(densidad 1.180. Lo cual equivale a 330 g de sulfato de zinc en 1 litro de agua),
moviendo con un aplicador para resuspender. Se agrega más sulfato de zinc hasta
que llegue a unos 0.5 cm del borde superior del tubo.
8. Se centrifuga a 2300 rpm durante 2 min y cuide de no sacar el tubo de la
centrífuga.
9. Sin sacar el tubo de la centrífuga, se recogen algunas gotas del material que flota
en la superficie con una asa de platino (se debe cuidar que el asa no penetre
demasiado bajo la superficie) o con una pipeta Pasteur.
10. Se depositan las gotas en un portaobjetos y se agrega una gota de lugol.
Enseguida se completa la preparación con un cubreobjetos.
11. Se observa al microscopio, a 10X y 40X. Es posible el hallazgo de protozoarios y
huevos de helmintos.

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.

Describa sus observaciones y resultados. Dibuje los organismos observados

63
64
 PRÁCTICA 3

CONCENTRACIÓN DE PARÁSITOS INTESTINALES

POR SEDIMENTACIÓN

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Desarrollo y comprensión de la técnica para aprender a concentrar por
sedimentación e identificar parásitos intestinales en heces.

INTRODUCCIÓN.
La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por centrifugación
ligera o por gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación quistes de
protozoarios, así como de huevos y larvas de helmintos, especialmente huevos de
tremátodos. El método concentra bien estas formas y elimina bastantes detritus
orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los protozoarios, se mantiene
la integridad de los organismos. Es efectivo aún en heces con cantidades excesivas
de grasas y pueden observarse la mayoría de los quistes de protozoarios, así como
huevos y larvas de helmintos, incluyendo los huevos con opérculo.
La técnica incluye tamizar primeramente las heces para separar los residuos
grandes, tratar con formol para matar y preservar los organismos, y adicionar un
solvente como éter o acetato de etilo para disolver las grasas. Sin embargo, durante
la sedimentación, aparte de concentrarse los parásitos, se quedan reunidos también
algunos otros materiales, abundando los artefactos durante la observación. Debido a
que se usan varios reactivos resulta poco económico, no obstante su eficacia.
En el caso de los Helmintos, se puede recordar que incluyen los phylum de los
Platyhelminthes (gusanos planos) y de los Aschelminthes (gusanos cilíndricos).

65
El phylum de los Platyhelminthes o gusanos planos incluye animales pluricelulares
que se caracterizan por tener el cuerpo aplanado con simetría bilateral. La mayoría
son hermafroditas. Los adultos pueden tener menos de 1 mm de longitud o alcanzar
varios metros. Los miembros de la clase Cestoda tienen cuerpo alargado en forma
de cinta segmentada, que lleva en el extremo anterior un órgano especial de fijación:
el escólex. No poseen aparato digestivo. Los céstodos adultos o tenias, viven en el
intestino delgado humano y sus huevos contenidos en los proglótidos desprendidos,
alcanzan el exterior, donde quedan libres.
En el caso de Taenia solium los huevos son ingeridos por cerdos, desarrollando
larvas en los músculos, pero si son ingeridos por humanos, afectan también sistema
nervioso central, causando cisticercosis severas; Otro ejemplo es Echinococcus
granulosus cuyo adulto parasita el intestino de cánidos, mientras que en su etapa
larvaria parasita las vísceras de humanos y herbívoros, causando el quiste hidatídico
(hidátide) al ingerir alimentos o agua contaminados con heces caninas.
La clase Trematoda o "duelas" presenta organismos con forma de hoja alargada,
delgados, con órganos de fijación consistentes en ganchos o en depresiones
musculares en forma de copa terminada en ventosas. Las especies más comunes
son Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski y Paragonimus westermani.
Los Aschelmintos parásitos humanos quedan incluidos en la Clase Nematoda. Los
nemátodos o gusanos cilíndricos, alargados, generalmente con los extremos
adelgazados, con sexos separados y aparato digestivo. Las especies humanas
tisulares humanas más importantes son Ascaris lumbricoides, Necator americanus,
Trichuris trichiura Strongyloides, Trichinella spirallis, Enterobius vermicularis
Onchocerca. Los adultos de algunas especies son intestinales en humanos, mientras
que las fases larvarias son tisulares, como en los casos de Ascaris, Necator y
Strongyloides.

MATERIALES Y MÉTODOS.

MÉTODO DE RITCHIE (SEDIMENTACIÓN CON FORMOL-ÉTER)

1. Cada alumno debe obtener de su profesor una muestra fecal positiva con
66
parásitos.
2. Cada alumno debe trabajar una muestra fecal propia, equivalente al tamaño de
una nuez, obtenida en un frasco estéril. La muestra debe ser reciente. Si es de la
noche anterior debe ser refrigerada mientras se lleva al laboratorio.
3. Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones
durante todo el procedimiento.
4. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamaño de un cacahuate)
mediante la ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 mL de solución salina
fisiológica. Mezcle con un aplicador de madera y homogenice.
5. Filtre la suspensión a través de un colador o malla y reciba el filtrado en un tubo
de centrífuga de vidrio de 14 mL
6. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m. Elimine el sobrenadante y resuspenda en
solución salina.
7. Repita el paso anterior, dos o tres veces para lavar, resuspendiendo el
sedimento en solución salina y homogenizando con un aplicador, para obtener un
sedimento más limpio.
8. Agregue al sedimento 3 mL de formol al 5% en solución salina, mezcle y deje
en reposo durante 5 min.
9. Añada 3 mL de éter y agite vigorosamente 30 segundos.
10. Centrifugue 2 min a 1500 r.p.m.
11. Después de centrifugar, se observan 4 capas en orden descendente.
a) éter y lípidos en la superficie
b) un tapón de restos fecales
c) formaldehido
d) sedimento en el fondo del tubo conteniendo los parásitos.
12. Se decanta la muestra y se conserva el sedimento. Enseguida se le adicionan
unas gotitas de lugol y se homogeniza. Se toma una gotita con una pipeta Pasteur
y se monta entre porta y cubre. Se observa a 10 y a 40 X.
13. Fuentes comunes de error: una suspensión fecal demasiado cargada,
suspensión fecal pobre, centrífuga mal equilibrada, tiempo y velocidad de
centrifugación inadecuados.
67
14. Haga dibujos detallados de los parásitos encontrados e identifíquelos mediante
la comparación de su morfología con los manuales y libros.
15. Fuentes comunes de error: Una suspensión fecal demasiado cargada,
suspensión fecal pobre, centrifuga mal equilibrada, tiempo y velocidad de
centrifugación inadecuados.

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 Técnica de Ritchie
1.- Agregar aproximadamente 2 g de material fecal en un tubo 13x100
2.- Agregar aproximadamente 3 ml de SSF y homogenizar vigorosamente
3.-Centrifugar a 1500 rpm por 2 min, pasado el tiempo de centrifugación retirar el
sobrenadante
4.-Repetir los pasos 2,3 y 4 nuevamente
6.-Agregar 2 ml de formol al 10%, homogenizar vigorosamente y dejar reposar por
5 min
7.-Agregar 2 mil de éter etílico, homogenizar vigorosamente y centrifugar a 1500
rpm durante 2 min
8.-Retirar el tubo de la centrifuga y observar los tres gradientes de densidad

9.-Retirar las tres primeras soluciones con cuidado de no lavar el sedimento

10.-A Agregar 500 µl de formol al 5%
11. Realizar tinciones temporales y observar a 400 aumentos

OBSERVACIÓN DE EJEMPLARES DE HELMINTOS

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1. Observe huevos, larvas o adultos, de Platelmintos, como Taenia solium, Taenia
saginata, Fasciola hepática, al microscopio o a simple vista, según se requiera.
2. Igualmente observe huevos, larvas y adultos de nemátodos, como Ascaris
lumbricoides, Necator americanus, Trichuris, Enterobius, Trichinella, Onchocerca.
3. Note las diferencias morfológicas para su identificación. Haga dibujos
detallados, anotando el nombre de sus estructuras y el nombre científico
correspondiente de cada parásito. Anote el estadio observado, midas su tamaño.
5. Haga un esquema con dibujos del ciclo vital completo para cada uno de los
parásitos observados.

CUESTIONARIO
1. Discuta el fundamento de las técnicas serológicas utilizadas en el
inmunodiagnóstico para cisticercos de Taenia solium ofrecidas en el mercado
2. Investigue como se diagnostica la cisticercosis en cerdos en el rastro.
3. Haga un esquema con dibujos del ciclo vital completo para cada uno de los
parásitos observados, con los nombres de la fase de cada uno.
4. Consulte la literatura y diga cuales son los animales que actúan como
huéspedes intermediarios de Fasciola hepatica. Haga dibujos
5. Discuta las dificultades y las facilidades de la técnica de Ritchie, con respecto a
las anteriores.

70
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.

71
 PRÁCTICA 4
TINCIONES PERMANENTES DE PROTOZOARIOS Y
OBSERVACIÓN DE LAMINILLAS FIJAS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Que el alumno se familiarice con diferentes técnicas de tinción permanente de
parásitos y utilizarlas en diagnóstico. Identificar los protozoarios intestinales y
tisulares de importancia medica mediante su observación en preparaciones fijas.

INTRODUCCIÓN.

En la mayoría de los casos, los protozoarios intestinales se pueden observar bien

con tinciones temporales, como es el caso de los exámenes directos, en los cuales
se puede utilizar lugol, solución salina o sudán. Otras veces estas tinciones son
necesarias porque se necesita distinguir algunas de sus estructuras celulares,
usando tinciones especiales permanentes. Igualmente, el inmunodiagnóstico puede
realizarse recurriendo a la tinción con anticuerpos marcados con colorantes
fluorescentes, facilitando la identificación. En algunas ocasiones es necesario teñir
los parásitos en forma permanente, para obtener preparaciones duraderas.
Los colorantes de Romanowsky (Wrigth, Giemsa, Leishman, May Grünwald) son
mezclas de 2 colorantes primarios, el Azul de metileno y la eosina.
La tinción de Giemsa es una de las más comunes. El colorante de Giemsa puede ser
usado para frotes de heces no-formadas, exudados fecales y aspirados duodenales.
Una tinción permanente de Romanowsky como la tinción Giemsa o tinción rápida de
Field debe ser usada para diarrea sanguinolenta y para heces semi-formadas con
sangre y/o moco. Proporcionan información sobre el exudado presente, presencia de
trofozoítos de flagelados como Giardia lamblia. Permiten determinar la presencia de
protozoarios que son difíciles de detectar o no son detectados en preparaciones en
fresco, como Blastocystis hominis.

72
Las preparaciones permanentes son hechas por diferentes razones:
- Proporcionan información sobre el material estudiado, como la tinción de
Romanowsky
- Son útiles en la identificación exacta de flagelados, como la tinción de
Romanowsky, tinción de Fierro-hematoxilina
- Cuando el parásito no puede ser detectado en preparaciones en fresco o por
técnicas de concentración, la tinción permanente de material fecal fresco puede
revelar la presencia de parásitos intestinales. Como la tinción de Romanowsky,
tinción Tricromo, Tinción de Ziehl Neelsen modificada.

- Son útiles en la demostración de patrones nucleares de quistes, facilitando la

identificación: tinción de fierro-hematoxilina, tinción Tricromo.

MATERIALES Y MÉTODOS.

TINCIÓN CON GIEMSA:

Preparación del colorante de Giemsa:
Giemsa 1 g + 66 mL de glicerina calentado a 50 grados durante 2 hs, más 66mL
de metanol absoluto. Dejar reposar a temperatura ambiente 7-14 días
(maduración). Filtrar antes de la tinción.
1. A partir de una muestra de heces positiva con parásitos, en un portaobjetos
extienda un frote fecal delgado. Deje secar al aire libre
2. Fije en metanol por 1 min.
3. Escurra y deje secar.
4. Cubra el frote con colorante Giemsa diluido 1:10 con agua destilada. Cada vez
debe diluirse el colorante. Deje colorear por 20-25 minutos.
5. Lave con agua de la llave y no deje precipitar el colorante en el frote. Deje secar al
aire libre.
6. Examine el frote a 100 X.
7. Los Flagelos, cilios y núcleos se tiñen de rojo y el citoplasma azul.

TINCIÓN DE KINYOUN

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Preparación de reactivos para tinción de Kinyoun:
Metanol Absoluto
Alcohol-ácido (10 mL de H2SO4 + 90 ml de etanol Absoluto)
Carbol fucsina
Verde de Malaquita al 3% en agua.
Almacene a temperatura ambiente.
La tinción de Kinyoun es la de Ziehl-Neelsen (alcoho-ácido-resistente) modificada,
misma que permite identificar a Mycobacterium tuberculosis y M. leprae. Esta técnica
es útil también en la identificación de ooquistes de coccidios intestinales como
Cryptosporidium, Isospora, y Cyclospora, que normalmente no se detectan con
colorantes rutinarios. Esta tinción no requiere el calentamiento de los reactivos al
teñir. Puede utilizarse el sedimento concentrado, de heces frescas o preservadas en
formalina.
1. Preparar un frote con 1 a 2 gotas de heces positivas a parásitos, sobre un
portaobjetos y secar en una platina caliente a 60°C. Los frotes no deben quedar
demasiado gruesos.
2. Fijar con metanol absoluto durante 30 segundos.
3. Teñir con carbol Fucsina de Kinyoun por 8 minutos.
4. Lavar con agua destilada brevemente y escurrir.
5. Decolorar con alcohol- ácido durante 2 minutos. Enjuagar con agua destilada y
escurrir.
6. Teñir con el colorante de contraste, verde de malaquita durante 2 minutos.
7. Lavar brevemente con agua destilada y escurra.
8. Secar la preparación a temperatura ambiente o sobre una platina caliente a 60 °C
durante 5 minutos.
9. Examinar usando el objetivo seco fuerte 40X. Los ooquistes se observan de color
rojo. El resto de la materia fecal es verde.

OBSERVACION DE LAMINILLAS FIJAS DE PROTOZOARIOS

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Haga dibujos detallados y note las diferencias morfológicas entre los protozoarios
observados, así como sus estructuras y haga dibujos. Anote en cada uno su
nombre, la fase del ciclo observada y enfermedad causada.

PROTOZOARIOS: Son un grupo de organismos unicelulares, eukariotas, y

carecen de pared celular. Dentro de este grupo se conocen varios parásitos de
importancia médica, considerados dentro de los philum Sarcomastigophora
(amibas y flagelados), Apicomplexa, Ciliophora y Microspora.
Philum Sarcomastigophora
Subphylum Sarcodina: Incluye protozoarios os que se desplazan por medio de
extensiones citoplásmicas denominadas pseudópodos. Las especies patógenas
importantes son la intestinal Entamoeba histolytica, y las tisulares Naegleria y
Acanthamoeba amibas de vida libre, causantes de infecciones cerebrales y de ojos.
Subphylum Mastigophora: Se mueven mediante apéndices largos, denominados
flagelos. De número variable. Algunos son parásitos hemáticos o tisulares y otros
son intestinales. Los principales patógenos son Giardia lamblia, Trichomonas
vaginalis, Leishmania spp. y Trypanosoma cruzi.

Phylum Apicomplexa
Los miembros de este phylum (antes Sporozoa), son parásitos estrictos, tisulares,
con ciclo de vida complejo, alternando reproducción sexual y asexual. Los géneros
patógenos más importantes son Plasmodium, Toxoplasma, Isospora, Cryptosporium,
Pneumocystis y Sarcocystis.

Phylum Ciliophora.
En estos organismos la locomoción se lleva a cabo por medio de cilios, que son
apéndices cortos en toda la célula. El único parásito es Balantidium, en el intestino.

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN.

PRÁCTICA 5

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 ARTRÓPODOS DE IMPORTANCIA MÉDICA

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA:

Observar las diferencias morfológicas de los artrópodos más comunes, para

aprender a identificarlos.
Importancia medica como parásitos, animales venenosos y transmisores de
patógenos o de otros parásitos

INTRODUCCIÓN

Los animales de este phylum son segmentados, con simetría bilateral, el cuerpo
incluído en una cubierta quitinosa rígida o exoesqueleto, con apéndices pares,
articulados. Su aparato digestivo está bien desarrollado y tienen sexos separados.
Los de interés médico incluyen los parásitos, los venenosos, los transmisores de
organismos patógenos y los que actúan como huéspedes intermediarios de
parásitos humanos.

CLASE CRUSTACEA:
Incluye formas acuáticas, como cangrejos, langostas, copépodos, gambas. Algunos
son huéspedes intermediarios de parásitos humanos.

CLASE QUILOPODA:
Incluye a los ciempies, caracterizados por tener un par de patas en cada segmento
corporal. El primer par de apéndices está transformado en uñas venenosas.

CLASE ARACHNIDA:
Tienen el cuerpo dividido en dos partes, llamadas cefalotorax y abdomen. Los
adultos tienen cuatro pares de patas. Ejemplo, los escorpiones (alacranes), arañas,
garrapatas y ácaros. Algunos producen veneno tóxico en diferente grado. Otros
pueden transmitir patógenos.

CLASE INSECTA:

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Incluye los artrópodos más importantes de importancia médica. Tienen el cuerpo
dividido en tres partes: cabeza, tórax y abdomen. Poseen tres pares de patas.

Orden Diptera:
Con un par de alas auténticas, incluye moscas y mosquitos. Algunas larvas de
moscas son parásitas del hombre y de animales y los mosquitos transmiten
diferentes patógenos.
Orden Anoplura:
Son piojos chupadores, aplastados dorsoventralmente, ápteros.
Orden Hemiptera:
Chinches verdaderas, ej: chinches de cama. Pueden ser ápteras o aladas. Los
redúvidos (de nariz cónica) son vectores de Trypanosomas.
Orden Coleoptera:
Son los escarabajos. Algunos son huéspedes intermediarios de céstodos. Tienen
alas endurecidas.
Orden Hymenoptera:
Incluyen hormigas, abejas, avispas. Son importantes por el veneno de sus aguijones.
Algunas hormigas son huéspedes intermediarios de un céstodo.

CLASE PENTASTOMIDA:
Incluye solo endoparásitos llamados gusanos lengua. Carecen de apéndices
externos y poseen dos pares de ganchos cerca de la boca. Los adultos viven en el
aparato respiratorio de vertebrados. En el hombre pueden formarse fases larvarias
enquistadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Haga observaciones macroscópicas (a simple vista) de artrópodos montados en

preparaciones permanentes. A continuación véalos con el microscopio
estereoscópico. Los más pequeños puede observarlos bajo el microscopio
compuesto. Haga dibujos detallados anotando los nombres de las partes del cuerpo

77
y el nombre científico correspondiente de cada ejemplar, acompañado del nombre
popular.

Compare y discuta las similitudes y diferencias.

2. Improvise una red para cazar artrópodos en la forma siguiente: con un gancho de
alambre (de los usados para colgar ropa) forme un círculo y sujételo a un palo de
escoba o similar. Con un pedazo de manta de cielo cosa un cono y amárrelo al
círculo de alambre. Haga una excursión al campo y colecte artrópodos con la red
fabricada. Llévelos al laboratorio y clasifíquelos.

CUESTIONARIO.

Investigue en la biblioteca los datos sobre los artrópodos más comunes de

importancia médica en México, tomando en cuenta su nombre científico y su nombre
común en cada caso:

1. Haga una lista de los artrópodos venenosos

2. Haga una lista de los artrópodos parásitos humanos
3. Haga una lista de los artrópodos transmisores de bacterias y de virus patógenos
humanos.
4. Haga una lista de los artrópodos transmisores de organismos parásitos humanos.

RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

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BIBLIOGRAFÍA

Ash L., Orihel T. 2010. Atlas de parasitología humana. Editorial Médica

Panamericana.
Brooks G.F., Carroll K.C., Butel J.S., Morse S.A., Mietzner T.A. 2011. Jawetz,
Melnick y Adelberg. Microbiología médica. 25ª edición. Edit. McGrawHill
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Castro A.M. 2014. Bacteriología Medica basada en problemas. 2ª edición. Ed.
Manual Moderno

Gilligan P.H., Shapiro D.S., Miller M.B. 2014. Cases in Medical Microbiology and
Infectious Diseases, 4th Edition. Washington, DC. ASM. PRESS

Forbes B.A., Sahm D., Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott. Diagnóstico
Microbiológico. 12a edición. Editorial Médica Panamericana.

Jorgensen, J.H., Pfaller, M.A., Carroll, K.C., Funke G., Landry M.L., Richter,
Warnock D.W.(Editors). 2015. Manual of Clinical Microbiology, 11th Edition.
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Murray P.R., Rosenthal K.S, Pfaller M.A. 2013. Microbiología Médica. 7a Edición.
Elsevier Ed.

Prats G. 2013. Microbiologia y parasitología médicas. Editorial Panamericana.

Romero-Cabello R. 2007. Microbiología y parasitología humana. Editorial Médica

Panamericana.
Tay J., Gutiérrez M, López R., Molina José., Manjarrez M.E. 2012. Microbiología y
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Washington C. Winn, Stephen D. Allen, William M. Janda, Elmer W. Koneman,
Gary W. Procop, Paul C. Schrenckenberger, Gail L. Woods. 2008.
Koneman. Diagnóstico microbiológico. Texto y atlas en color. 6ª edición.
Editorial Médica Panamericana.
Wallace P., Pasvol G. 2007. Atlas de medicina tropical y parasitología. 6ª edición.
Ed. Elsevier España.

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