Manual Bacter

Instituto Tecnológico De Sonora
Dirección de Recursos Naturales

Depto. de Ciencias Agronómicas y Veterinarias
Manual de Prácticas del

Laboratorio de
Bacteriología y Patogenia Bacteriana
M.C. Ana Laura Miranda Romero

M.A.D.N. Maribel Castro Urrea
M.C. Jorge Alberto Robles Mascareño
DIRECTORIO
Rector
Dr. Javier Vales Garcia
Vicerrector académico
Dr. Jaime Garatuza Payán
Vicerrector administrativo
Dra. María Mercedes Meza Baldenebro
Director académico
Dirección de recursos naturales
Dr. Javier Rolando Reyna Granados
Jefe de departamento
Ciencias agronómicas y veterinarias
MC Ana Laura Miranda Romero
ÍNDICE
Página
1
Introducción
Lineamientos internos del laboratorio de bacteriología y patogenia bacteriana 2
Práctica 1. Medidas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología 4
Práctica 2. Morfología microscópica y tinciones simples 8
Práctica 3. Morfología colonial y aislamiento por estría cruzada 15
Práctica 4. Tinción de Gram 23
Práctica 5. Tinción de Ziehl-Nielsen 29
Práctica 6. Tinciones selectivas 35
Práctica 7. Cultivo de anaerobios 70
Práctica 8. Uso de medios selectivos 44
Práctica 9. Uso de pruebas bioquímicas 51
Práctica 10. Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos 62
Práctica 11. Aislamiento de Hongos y morfología colonial 78
Práctica 12. Colección y envío de muestras al laboratorio 87
Práctica 13. Análisis bacteriológico de procesos piogénicos 96
Práctica 14. Análisis bacteriológico de heces y orina 105
Práctica 15. Análisis bacteriológico de órganos 116
Práctica 16. Mecanismos de patogenicidad 127
Anexo 1. Riesgo biológico 140

Anexo 2. Lineamientos generales de laboratorios de ITSON 142
Anexo 3. Cuidados y manejo del microscopio 144
Anexo 4. Procedimientos para el lavado, esterilización y desinfección de materiales 145
utilizados en el laboratorio
Anexo 5. Métodos empleados en la identificación y/o diagnostico bacteriano 151
Anexo 6. Formatos de registros de casos clínicos para estudio bacteriológico 158
i
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Estructura química del colorante safrina 9

Figura 2. Forma y agrupación de bacterias 11
Figura 3. Morfología colonial 16
Figura 4. Técnica de aislamiento por estría cruzada 19
Figura 5. Esquema para practicar la técnica de estría cruzada 19
Figura 6. Estructura bacteriana 37
Figura 7. Observación microscópica de capsula 37
Figura 8. Esporas bacterianas: A) subterminales B) y C) centrales D) terminal 39
Figura 9. Esporas bacterianas observada con tinción Gram 39
Figura 10. Prueba bioquímicas para bacteria Gram (+) 55
Figura 11. Prueba bioquímicas para bacteria Gram (-) 56
Figura 12. Siembra de antibiogramas 65
Figura 13. Tipos de esporas asexuales y estructuras reproductoras de hongos 82
Figura 14. Tipos de hifas 82
ii
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1. Interpretación del antibiograma 65

Tabla 2. Características a evaluar de la morfología colonial de los hongos 81
Tabla 3. Morfología microscópica de hongos 81
Tabla 4. Agentes desinfectantes (oxidantes y catiónicos) 148
Tabla 5. Agentes desinfectantes (alcoholes, aldehídos y fenoles) 149
Tabla 6. Agentes desinfectantes (halogenados) 150
iii
INTRODUCCIÓN
La adquisición de habilidades y conocimientos que implican el aprendizaje de la

Bacteriología y Patogenia Bacteriana, tiene implícito para el facilitador del curso y el
estudiante, el manejo de microorganismos potencialmente patógenos o patógenos para
su salud. De ahí que resulta indispensable la comunicación clara y la participación
responsable de cada uno de los integrantes del grupo con la finalidad de minimizar y
controlar los riesgos biológicos, físicos y químicos que se presentan en la realización de
cada una de las prácticas que se describen en este manual.
El Manual de Bacteriología y Patogenia Bacteriana del Instituto Tecnológico de Sonora

tiene como objetivo ser una guía para el alumno y el facilitador del curso en el proceso de
aprendizaje, da inicio con la presentación de los lineamientos del Laboratorio de
Bacteriología y Patógena Bacteriana y se desarrolla de tal forma que permite al alumno
construir su propio conocimiento a través de la adquisición de habilidades manuales, de
observación minuciosa y del conocimiento a un nivel descriptivo, por lo que al inicio las
prácticas de laboratorio son muy sencillas y permiten la integración gradual del
conocimiento, hasta la participación del alumno en actividades de campo como la toma de
muestras, la integración de la historia clínica, que implican el manejo y contacto con las
diferentes especies animales, así como la interacción con los productores para recabar la
información necesaria, culminando en la aplicación e integración del conocimiento para
llegar a un diagnóstico definitivo. Se incluyen además en las últimas sesiones el manejo
de pruebas semi automatizadas con principios biotecnológicos, que tienen gran demanda
por su precisión y rapidez, con esto se pretende brindar al alumno herramientas
actualizadas y conocimientos de vanguardia para su posterior aplicación en el área
médica.
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 1

M.C. Ana Laura Miranda Romero - M.C. Jorge A. Robles Mascareño - MADN. Maribel Castro Urrea
LINEAMIENTOS INTERNOS
DEL
LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y PATOGENIA BACTERIANA
Este documento tiene como objetivo evitar los riesgos de exposición y accidentes de
contaminación con microorganismos en el laboratorio.
1. Los maestros, alumnos de servicio social y estudiantes usarán siempre bata blanca,
limpia, abotonada y de manga larga.
2. La tolerancia máxima para permitir el acceso de los alumnos al laboratorio es de 10

minutos.
3. Usar el cabello recogido, calzado cerrado. No se permitirá el acceso con pantalón corto
por riesgo de quemaduras y contaminación.
4. Los alumnos deben tener las uñas cortas, sin alhajas (anillos, reloj, pulsera, etc.)
5. No se permite el uso de sombrero y gorras.
6. El alumno guardará sus objetos personales en las gavetas.
7. Está prohibido introducir alimentos, comer, beber, fumar y masticar chicle en el

laboratorio.
8. Apagar el teléfono celular al ingresar al laboratorio, no se permitirá su uso interno.
9. Evitar llevarse objetos a la boca, tocarse la cara, cabello, ojos, etc.
10. Mantener limpia la mesa de trabajo, desinfectarla al inicio y al término de la práctica.
11. Las cajas de petri y materiales de laboratorio contaminados se les retirará la cinta
adhesiva y etiquetas y se colocarán en el área sucia para su posterior esterilización y
lavado.
12. Los portaobjetos y pipetas contaminados, se colocarán en recipientes con

desinfectante, en el área sucia, para su posterior lavado.
13. Es requisito indispensable para el ingreso al laboratorio que el alumno lleve el manual
de prácticas correspondiente.
14. En caso de heridas o erosiones en la superficie corporal, el alumno dará aviso al

maestro, quien evaluará la magnitud de la lesión y aplicará las medidas de seguridad
necesarias para el caso.
15. El alumno dará aviso inmediato al maestro en caso de derramarse un cultivo viable o
romperse una caja de petri.

16. Antes de salir verifique que las llaves de gas y agua estén bien cerradas.
17. Lavar perfectamente sus manos con agua y jabón y aplicarse el antiséptico a
disposición antes de salir del laboratorio.
18. Los reportes de cada práctica se entregarán una semana después de concluida, sin
excepción.
19. Los exámenes se aplicarán al inicio de cada práctica.
20. Es obligatorio que el alumno entregue el diagrama de flujo previo a la realización de la

práctica.
21. Todos los alumnos están obligados a participar en el día asignado para la
esterilización y limpieza de los materiales. En caso de no cumplirlo en el tiempo asignado,
será eliminado el porcentaje correspondiente a actitudes, valores y desempeño de la
calificación de la práctica, hasta que cumpla responsablemente con la actividad asignada.
22. Para ingresar al laboratorio de horario extra clase, todo alumno debe cumplir con las
medidas de seguridad obligatorias (uso de bata, zapato cerrado, etc.) así como
registrarse en la bitácora de control de ingreso del almacén.
22. Todos los alumnos deben recurrir a asesoría con su maestro en caso de dudas en la
elaboración de su reporte de práctica.
ATENTAMENTE
Academia de Bacteriología y Patogenia Bacteriana

PRÁCTICA 1
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
Ante los múltiples casos que se han presentado de infecciones asociadas al laboratorio
en los últimos años, organismos internacionales como la Organización Mundial de la
Salud (OMS), han recomendado tomar medidas preventivas para proteger la salud de los
investigadores, técnicos laboratoristas y estudiantes. Si se consideran estas medidas de
seguridad, el personal que trabaja en laboratorios de microbiología puede minimizar el
riesgo de infección.
Las medidas de seguridad deben ser adecuadas para el tipo de microorganismo en

estudio, pues estos varían en su capacidad de producir infecciones. Algunos pueden ser
inofensivos, otros pueden causar síntomas leves; otros más pueden ser graves para la
salud y los menos pueden tener una amplia capacidad de difundirse y causar brotes
epidémicos. Esta gama ha permitido a los investigadores clasificar a los microorganismos
en cuatro grupos de riesgo. Estos se han publicado en las Medidas de seguridad del
programa de Microbiología de la Organización Mundial de la Salud.
COMPETENCIA: El alumno aplicará las medidas de seguridad que se han implementado

en el laboratorio de Bacteriología y Patogenia Bacteriana para la protección de la salud y
se comprometerá a seguir los lineamientos marcados en el Manual de Laboratorios del
ITSON.
MATERIALES
Equipo de bioseguridad
Extintor
Materiales para bioseguridad
Guantes de asbesto Guantes de látex
Cubre bocas Lentes antisalpicaduras
Bata Desinfectantes y antisépticos
Cofia Depósitos de material punzocortante
Bolsas de residuos biológico infecciosos

MÉTODO
1. Procese la lectura señalada por el maestro en relación al Riesgo Biológico (ver anexo
1), así como la clasificación de los microorganismos, las barreras de protección y el tipo
de laboratorio. Se sugiere la lectura del Capítulo I del libro Métodos microbiológicos de
Collins (1989).
2. Lea los lineamientos generales de los laboratorios del ITSON, apartado VII alumnos
(ver anexo 2).
3. Identifique en el laboratorio las áreas de trabajo, área sucia y de lavado; además del
equipo y los materiales de bioseguridad, así como su uso.
Realice el reporte de práctica 1 y siga lo indicado en el mismo.
BIBLIOGRAFÍA BÁSICA
 Forbes, B. A., Trevino, E. A., Weissfeld, A. S., & Sahn, D. F. (2009). Bailey y Scott
diagnóstico microbiológico. México : Editorial Médica Panamericana, 2009.
 Prescott, L.M.; Harley, J. P.; Klein, D. A. (2002). Microbiology. The McGraw-Hill

Companies. 5th edition 1139 p. Spain.
 Quinn, P. J. (2011). Veterinary microbiology and microbial diseases. Estados

Unidos: Wiley-Blackwell, 2011.
 Quinn, P. J., III. García Sánchez, J., II. Maguire, D., & I. Markey, B. K. (n.d).
Elementos de microbiología veterinaria. España: Acribia, 2005 2003.
 Rosa fraile, M. L. (n.d). Microbiología en ciencias de la salud; conceptos y
aplicaciones. España ELSEVIER España, S. A. 2003.
 Songer, J. G., & I. Post W., K. (n.d). Veterinary microbiology: bacterial and fungal
agents of animal disease. China. ELSEVIER INC., 2005.
 Tortora, G.J., Funke, B.R. and Case, C.L.(2007). Introducción a la microbiología.
9na. edición. Ed. Médica Panaméricana, S.A. Buenos Aires, Argentina. Consultado
en:https://books.google.com.mx/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PR7&lpg=PR7&dq
=introduccion+a+la+microbiologia+9+edicion+web&source=bl&ots=z94mqM3-
jA&sig=cQKG6qcrqt-VOYpnbfyHQ_jJk-
I&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwid5cG_8KnRAhVCzWMKHeIdAO8Q6AEIHzAB#v=o
nepage&q=introduccion%20a%20la%20microbiologia%209%20edicion%20web&f
=false
 OMS (2005). Manual de Bioseguridad en el laboratorio. 3ra edición. OMS.
Ginebra, Suiza. 2005. Consultado en:
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11
SP.pdf?ua=1
BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA
 Biberstein, E. L. (n.d). Tratado de microbiología veterinaria. España: ACRIBIA, S.
A. 1994.
 Collins, C.H. & Lyne, P.M. (n.d). Métodos microbiológicos. España ACRIBIA, S. A.
1989.
 Cottral. G. E. (1989). Microbiología Veterinaria. La Prensa Medica Mexicana, S. A.
1ª Edicion. México, D. F.
 Cottral, G. E. (n.d). Manual de métodos estandarizados en microbiología
veterinaria. México: Ediciones Científicas, c1986.
 Duerden, B. I., & Duerden, B. I. (n.d). Microbiología de enfermedades infecciosas.
Mexico LIMUSA 1993.
 Ikram, M., (n.d). Microbiology for veterinary technicians. Estados Unidos.
AMERICAN VETERINARY PUBLICATION.1991.
 Pérez, M.J, Miranda, M.R, Vázquez, M.J, Nader, G.E, Rodríguez, S.M. (1989).
Procedimientos de laboratorio para bacteriología y micología veterinarias. Editorial
UNAM. 2ª Edición. México.

REPORTE DE PRÁCTICA 1
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
I. RESULTADOS
Se espera que el alumno aplique durante todo el curso las medidas de bioseguridad
dentro del laboratorio.
II. ASIGNACIÓN
Elaborar un mapa conceptual sobre la importancia de la bioseguridad en la prevención de
enfermedades y accidentes dentro del laboratorio de microbiología. Del capítulo I medidas
de seguridad en laboratorio de Collins (1989).
III. BIBLIOGRAFÍA
Usar el formato APA. Se deben reportar al menos tres autores, y deben estar
referenciados en el texto de la discusión.

PRÁCTICA 2
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Y TINCIONES SIMPLES
INTRODUCCIÓN
El microscopio es un instrumento que seguramente ha sido utilizado por los estudiantes
en otros cursos, sin embargo se ha incluido en este curso para recordar su manejo y
desarrollar la habilidad para trabajar con el objetivo de inmersión cuyo uso es obligado en
la observación de microorganismos y sus estructuras.
El microscopio compuesto es un instrumento de precisión que consiste en una serie de

lentes diseñadas y acomodadas para proveer las máximas amplificaciones posibles del
espécimen que se va a observar. El aumento total que se puede alcanzar en un
microscopio compuesto depende de la combinación del ocular con el objetivo y se obtiene
multiplicando el número de aumento del ocular por el número de aumento del objetivo. En
el anexo 2, se pueden ver los cuidados y manejo del microscopio.
Tratar de observar a los microorganismos con un microscopio óptico sin un contraste

adecuado es casi imposible, ya que como los microorganismos están compuestos sobre
todo de agua, que es el medio en el que normalmente están suspendidos, es como tratar
de ver un objeto blanco sobre un fondo blanco. Las tinciones que se usan en
microbiología se desarrollaron para incrementar el contraste entre el espécimen y el fondo
que lo rodea, ante la necesidad de poner de manifiesto la forma, tamaño y agrupación de
las bacterias, así como sus estructuras. Fue Roberto Koch quien introdujo en
microbiología el uso de preparaciones fijas o permanentes (frotas), al dejar secar al aire
las preparaciones en fresco y sin teñir, para fijarlas químicamente y teñirlas después con
colorantes derivados de la anilina. En la actualidad, la mayoría de las técnicas de tinción
usan frotis fijos que consisten en colocar sobre un portaobjetos, una suspensión de
bacterias que se deja secar. A la preparación así obtenida, se le pasa rápidamente sobre
una flama para que el calor fije las células al portaobjetos. La acción desnaturalizante del
calor deshidrata la suspensión y mata a la mayoría de las bacterias, dejándolas en
posibilidad de ser teñidas posteriormente, así mismo, evita que las bacterias se
desprendan del portaobjetos durante los diferentes procesos de tinción. Es importante

saber que algunas bacterias pueden sobrevivir a la fijación del calor, por lo que
todo frotis fijo debe considerarse potencialmente infeccioso.
En el procedimiento de tinción se emplea un sólo colorante. Una vez fija la preparación,

se le agrega la solución colorante y se deja actuar aproximadamente un minuto, se
enjuaga con agua para quitar el exceso de colorante, se deja secar y se procede a
observar al microscopio.
Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de la anilina y que

químicamente están constituidos por uno o más anillos aromáticos. Estos anillos
aromáticos presentan sustituyentes llamados cromóforos que son responsables del color,
formando los compuestos cromógenos. Estos cromógenos presentan además, grupos
ionizables llamados auxocromos que permiten unir el colorante a estructuras de carga
contraria de células y tejidos. Sin estos grupos las soluciones coloridas no podrían teñir.
Figura 1. Estructura química del colorante safranina
Fuente: http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v10n3/larez.html
COMPETENCIA: El alumno diferenciará la forma y agrupación microscópica de los

microorganismos mediante el uso de tinciones simples y el microscopio compuesto.
MATERIALES
Microscopio de campo luminoso Tela suave y papel seda
Aceite de inmersión Lápices de colores
Portaobjetos Asa bacteriológica
Mechero de Bunsen Puente de coloración
Soluciones de cristal violeta, azul de metileno,

Verde de malaquita, safranina y fucsina básica.
Cultivo de bacterias
MÉTODO
Antes de iniciar con los procedimientos de la práctica leer el ANEXO 3.
A) Elaboración de frotis a partir de un medio sólido
1. Marca en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados
2. Con el asa bacteriológica o un gotero, coloca una pequeña gota de agua en el
centro del portaobjetos.
3. Con el asa estéril toma una pequeña cantidad de crecimiento y con movimientos
giratorios haz una suspensión homogénea en la gota de agua, extendiéndola para
formar una película delgada.
4. Esteriliza nuevamente el asa.
5. Deja secar al aire el frotis
6. Fija el frotis al calor pasando la parte posterior del portaobjetos dos o tres veces
por la flama del mechero, hasta alcanzar una temperatura que sea soportable en
el dorso de la mano. Es importante que la laminilla no se caliente demasiado pues
podrías calcinar a las bacterias modificando así sus características morfológicas y
tintoriales.
7. Coloca el frotis en el puente de tinción y cubrirlo con el colorante seleccionado
durante un minuto
8. Lava con chorro de agua suave y escurrir
9. Deja secar al aire y observa al microscopio con todos los objetivos 10X, 40X y
100X.
B) Elaboración de frotis a partir de medio líquido
1. Marca en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados.
2. Sin poner agua, coloca con el asa estéril dos o tres gotas del cultivo en el centro
del portaobjetos y extiéndelas para formar una película delgada y homogénea.
3. Deja secar al aire los frotis.
4. Fija los frotis al calor como se explicó en el caso anterior.
5. Coloca el frotis en el puente de tinción y cúbrelo con el colorante seleccionado
durante un minuto.
6. Lava con chorro de agua suave y escurrir.

7. Deja secar al aire y observa al microscopio con todos los objetivos 10X, 40X y
100X.
8. Realiza los dibujos correspondientes de cada una de las observaciones realizadas,
indicando formas y agrupaciones. Compara tus observaciones con la figura 2.
Figura. 2. Forma y agrupación de las bacterias.
Fuente: http://es.slideshare.net
Registra todos los resultados de manera gráfica y descrita en el reporte de práctica

2, sigue lo indicado en el mismo para la elaboración de tu reporte.
 Base de datos: © 2017 EBSCO Industries, Inc. https://help.ebsco.com/medicina
 Ciencia y desarrollo: CONACYT, revista de divulgación científica. (2015). México:
Conacyt, 2015.

en:https://books.google.com.mx/books
 WINN, W. C. (n.d). Koneman’s color atlas and textbook of diagnostic microbiology.
USA. LIPPINCOTT COMPANY 2006.
 http://es.slideshare.net/YessiPalacios8/morfologa-y-agrupacin-bacteriana
 http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v10n3/larez.html
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Y TINCIONES SIMPLES
I. RESULTADOS
A) Frotis a partir de un medio sólido:
Cuadro1. Resultados de la morfología microscópica

Esquemas del microorganismo1 con el objetivo 10 X.
FORMA: _________________________________
AGRUPACIÓN:____________________________
FORMA: _________________________________
AGRUPACIÓN:____________________________
Esquemas del microorganismo 1 con el objetivo 100X.
FORMA:_________________________________
AGRUPACIÓN:___________________________
B) Frotis a partir de un medio líquido:
Cuadro 2. Resultados de la morfología microscópica.

FORMA: _________________________________
AGRUPACIÓN:____________________________
FORMA: _________________________________
AGRUPACIÓN:____________________________
Esquemas del microorganismo 1 con el objetivo 100X.
FORMA:_________________________________
AGRUPACIÓN:___________________________

II. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Dirigirla hacia la importancia de las formas y agrupaciones bacterianas en el proceso de

identificación, importancia de las tinciones y comparar los resultados obtenidos con lo
reportado en bibliografía.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
III. ASIGNACIÓN
1. Investiga quién fue Roberto Koch y haz una reseña de sus principales aportaciones a
la microbiología.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2. Investiga la forma y las características generales de los microorganismos que

investigaste.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
Concluye mencionando con tus palabras de manera concisa que competencia adquiriste
con esta práctica, que aprendiste y la importancia de su realización. Párrafo de máximo 5
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 3
MORFOLOGÍA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRÍA CRUZADA
INTRODUCCIÓN
Además del método de las diluciones para aislar microorganismos, existen otros que son
cualitativos, siendo el de la estría cruzada el más común. Este consiste en tomar
directamente de la muestra que nos interesa, una pequeña cantidad con ayuda del asa
bacteriológica que se deposita en la superficie del medio de cultivo sólido; luego se hacen
estrías con movimientos sucesivos del asa hacia un lado y otro, a la vez que se recorre de
una orilla hacia el centro de la placa. Este procedimiento es equivalente a las diluciones ya
que cada vez que se va extendiendo el contenido microbiano a lo largo de la estría, llegará el
momento en que aún cuando se tenga en un principio una gran cantidad de organismos, se
obtendrán colonias aisladas en algún punto a lo largo de la serie de estrías. Un buen
aislamiento en placa se dará cuando se obtengan colonias aisladas de
microorganismos, con una distancia que nos permita distinguir y describir su
morfología colonial. La observación cuidadosa de las colonias ha mostrado que las
características morfológicas suelen ser constantes el medio de cultivo usado y que éstas
varían en apariencia dependiendo del grupo microbiano. Esto ha permitido iniciar el
reconocimiento de los principales grupos de microorganismos sin llegar a ser una
identificación definitiva.
Las características que se toman en cuenta para describir la morfología colonial

son las descritas a continuación y que se observan en la figura 3.
Tamaño: Medir el diámetro en milímetros
Color: Coloración de la colonia y del medio de cultivo
Forma: Pueden ser puntiformes, circulares o irregulares
Elevación: Puede ser plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada, umbilicada o
crateriforme.
Bordes: Pueden ser enteros, lobulados, ramificados, filamentosos, dentados o irregulares.
Superficie: Puede ser lisa, rugosa o granular.
Luz reflejada: Puede ser brillante o mate.
Luz transmitida: Puede ser opaca, transparente o translúcida.
Consistencia: Puede ser dura o suave, esta última puede ser butirosa, mucoide o friable.

Figura 3. Morfología colonial
Fuente: Prescott y col. (2002).
COMPETENCIA: Adquirir los conocimientos necesarios para diferenciar las formas

coloniales bacterianas y desarrollar las habilidades para poder llevar a cabo el aislamiento
de bacterias por medio de la técnica de estría cruzada.
MATERIALES
Asa bacteriológica Portaobjetos
Mechero de Bunsen Cubreobjetos
Chispa Regla
Gradilla Bolsa de plástico transparente
Puente para tinción
Cajas petri con medios de cultivo:
1. Generales (Agar Nutritivo)
2. Diferenciales (Agar Sal Manitol, Verde Brillante y TCBS)
3. Caldo tripticaseina de soya (medio líquido en tubo).
4. Agar Nutritivo inclinado (en tubo).
Cultivos bacteriológicos varios:
1. Bacillus, 3. Escherichia coli, 5. Klebsiella pneumoniae
2. Pseudomonas 4. Staphylococcus .
Cultivos de levaduras:
1. Torula sp, 2. Sacharomyces.
MÉTODO
Descripción de la morfología colonial.
1. Escoger 2 medios de cultivo diferentes y seleccionar una colonia aislada.
2. Medir cada una de las colonias (usar regla) y expresarlo en mm.
3. Describir el color de cada colonia.
4. Describir la forma, borde, elevación y superficie de acuerdo a la guía anexa.
5. Observar la luz reflejada y transmitida a contraluz, sin abrir la caja de Petri.
6. Apreciar la consistencia tocando la colonia con el asa previamente flameada y
enfriada.
A) Siembra por método de estría cruzada en medio solido en placa.
NOTA IMPORTANTE: Sembrar y manipular los cultivos en un área aproximada de 20
cm alrededor del mechero de Bunsen, No abrir la caja fuera de esta área, No hablar
mientras siembres y manipules los cultivos.
1. Flamear y enfriar el asa bacteriológica.
2. Tomar una pequeña porción de una colonia aislada.
3. Tocar el agar suavemente y deslizar el asa sin rasgarlo a manera de zigzag.
(Observar el esquema anexo en la parte marcada con el número 1 (”primer
cuadrante”).
4. Flamear al rojo el asa, enfriar y extender las últimas líneas de siembra del primer
cuadrante (Observar el esquema anexo en la parte marcada con el No.2.
(“segundo cuadrante”).
5. Repetir el mismo procedimiento según se indica en el esquema, en el “tercero y
cuarto cuadrante”.
6. Practica este procedimiento en las circunferencias anexas al final de esta práctica
(figura 5) usando un lápiz conforme se indica en la figura 4.

7. Identifica las cajas con los siguientes datos:
Número de equipo.
Horario de laboratorio
Nombre del cultivo bacteriano.
8. Incubar las cajas hasta las 24 horas a 37°C. (El maestro indicará el área a usar de
la incubadora).
9. Describir la morfología colonial de una colonia aislada de cada una de las cepas
bacteriológicas que se proporcionaron.
10. Introducir las cajas de Petri en una bolsa de plástico (solicitarla en el almacén) y
colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificación.
B) Siembra en medios sólidos en tubo con agar inclinado

1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada y enfriada.
2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la tapadera.
3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo.
4. Arrastrar el asa haciendo zigzag sobre la superficie del agar.
5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37ºC (el maestro indicará el área a usar de la
incubadora).
6. Introducir los tubos en una bolsa de plástico y colocarlas en el refrigerador con su
respectiva identificación.
7. Describir el crecimiento.
C) Siembra en medio líquido

1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada y enfriada.
2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la tapadera.
3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo.
4. Agitar el asa vigorosamente dentro del medio de cultivo.
5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37ºC (el maestro indicará el área a usar de la
incubadora).
6. Introducir los tubos en una bolsa de plástico y colocarlas en el refrigerador con su
respectiva identificación.
7. Describir el crecimiento.

Figura 4. Técnica de aislamiento por estría cruzada
Figura 5. Esquema para practicar la técnica de estría cruzada.



=false
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.
UNAM. 2ª Edición. México

MORFOLOGÍA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRÍA CRUZADA
I. RESULTADOS
A) A partir de la siembra en un medio sólido en placa:
Cuadro1. Resultados de la descripción de morfología colonial ó macroscópica.

Especie microbiana:
Agar:
Tamaño:
Color:
Forma:
Elevación:
Bordes:
Superficie:
Luz reflejada:
Luz transmitida:
Consistencia:
B) A partir de la siembra en un medio sólido en tubo inclinado:
Cuadro 3. Descripción de la morfología colonial o macroscópica.

Especie microbiana:
Agar:
Tamaño:
Color:
Elevación:
Bordes:
Superficie:
Consistencia:
C) A partir de un medio líquido:
Cuadro 2. Descripción de la morfología colonial o macroscópica.

Especie microbiana:
Tipo de medio líquido:
Turbidez:
Formación de película en superficie del tubo:
Formación de sedimento o precipitado en el fondo

del tubo:

Dirigirla hacia la importancia de las características morfológicas en el proceso de

identificación bacteriana, y comparar tus observaciones con las reportadas en bibliografía
para ver si coinciden con las bacterias.
________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
III. ASIGNACIÓN
1. Investiga al menos otros 2 métodos de aislamiento de cultivos bacterianos.

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2. Compara el método desarrollado en la práctica con los métodos que investigaste,

señala además las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 4
TINCIÓN DE GRAM
INTRODUCCIÓN
En 1884 un médico danés, Hans Cristian Gram, desarrolló y publicó un método de tinción
que lleva su nombre y que es de enorme utilidad en cualquier laboratorio de bacteriología.
La técnica además de revelar detalles referentes a la forma y agrupación bacteriana,
como cualquier otra técnica de tinción, permite clasificar a las bacterias en dos grandes
grupos Gram positivas y Gram negativas.
La diferenciación de Gram se tiene en el color que adquieren las bacterias cuando se

tratan con el colorante cristal violeta seguido por una solución yodurada de potasio (lugol),
como mordiente o mordente. Ciertas bacterias pierden la coloración violeta rápidamente
cuando se decoloran con alcohol etílico, en tanto que otras la pierden con más lentitud.
Después de la decoloración se usa un colorante de contraste que casi siempre es
safranina. Las bacterias resistentes a la decoloración conservan una tonalidad azul o
morada clasificándose como Gram positivas. Las bacterias que no pueden retener la
tinción con cristal violeta, toman la coloración de contraste presentando una coloración
rosa o roja; a estas bacterias se les denomina Gram negativas. Es importante observar
que la base de esta diferenciación es más bien la velocidad de decoloración que una
característica absoluta de las bacterias, por lo que el procedimiento se debe realizar con
mucho cuidado.
La afinidad tintorial mostrada por las bacterias Gram positivas y Gram negativas, se debe
a las diferencias en la estructura de la pared celular. Las bacterias Gram negativas tienen
una capa delgada de peptidoglicano (PDG) rodeada de una membrana externa construida
de fosfolípidos y lipopolisacáridos, mientras que las Gram positivas contienen una capa
densa de PDG y no poseen membrana externa pero contiene ácidos teicoicos localizados
en la superficie unido al PDG y ácidos lipoteicoicos embebidos en la capa de PDG pero
unidos a la membrana citoplasmática.

La tinción de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificación
de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales
la tinción de Gram no es de utilidad taxonómica, por ejemplo: las espiroquetas,
micobacterias, clamidias, Rickettsias y micoplasmas.
El método de la tinción de Gram ha sufrido varías modificaciones y algunas de éstas son

incluso mejores que el método original. Los objetivos principales para modificar la tinción
han sido: 1) Obtener un colorante primario más estable que el original, ya que éste se
deteriora rápidamente y 2) Reducir el tiempo requerido para completar la técnica.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos necesarios para aplicar la

técnica de tinción de Gram en especies bacterianas conocidas y poder determinar si
pertenecen al grupo Gram positivo o Gram negativo.
MATERIALES
Portaobjetos Asa bacteriológica
Mechero Bunsen Puente para tinción
Microscopio
Aceite de inmersión
Solución de cristal violeta
Solución de lugol
Solución de alcohol-acetona
Solución de safranina
Cepas de Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus y Escherichia coli.

MÉTODO
Tinción de Gram
1. Haga frotis de cada bacteria y fíjelos a la flama del mechero, tome en cuenta el
procedimiento a seguir si los hace a partir de medio sólido o líquido.
2. Cubra los frotis con la solución de cristal violeta (colorante primario).
3. Deje actuar esta mezcla por 1 minuto.
4. Escurra el exceso de colorante y lave con un chorro suave de agua.
5. Sacuda la laminilla para evitar gotas gruesas de agua y aplique la solución de
lugol (mordente). Deje actuar por 1 minuto.
6. Escurra el exceso de lugol y lave con un chorro suave de agua.
7. Sacuda la laminilla y aplique el alcohol-acetona (agente decolarante) durante 3 a 5
segundos. Corte el proceso de decoloración lavando con agua.
8. Sacuda el frotis y aplique safranina (colorante de contraste) y déjelo actuar por 10
a 20 segundos.
9. Lave por último con un chorro de agua suave y deje secar el frotis al aire y use un
papel absorbente presionando ligeramente sin tallar.
10. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión.



=false
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

TINCIÓN DE GRAM
I. RESULTADOS
Cuadro1. Descripción de la morfología bacteriana

Género especie: ___________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Género especie: ___________________________

Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Género especie: ___________________________

Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Dirigirla hacia la importancia de la tinción de Gram en el proceso de identificación

bacteriana, comparar tus resultados con bibliografía e incluir la función que tiene la pared
celular en el proceso de tinción.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
III. ASIGNACIÓN
1. Explique cuál es el paso crítico de la tinción de Gram.

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2. Indique al menos dos factores que pueden alterar los resultados en la tinción de Gram.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

3. Anote cinco géneros bacterianos de importancia veterinaria que sean Gram positivos y
cinco Gram negativos
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
Usar el formato APA. Se deben reportar al menos tres autores y deben estar
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 5
TINCIÓN DE ZIEHL-NIELSEN
INTRODUCCIÓN
Además de la tinción de Gram, hay otra tinción diferencial empleada en bacteriología que
es la tinción de Ziehl-Nielsen o ácidorresistente. Esta tinción se fundamenta en que la
mayoría de las bacterias son decoloradas por una mezcla de alcohol-ácido siendo la
excepción las de los géneros Mycobacterium y Nocardia. Estos géneros bacterianos
forman un grupo de microorganismos que se definen, con base en sus propiedades
tintoriales, como bacilos ácido alcohol resistente (BAAR). Son relativamente
impermeables a los colorantes básicos, pero una vez teñidos, retienen fuertemente el
colorante y resisten la decoloración con solventes orgánicos acidificados. La propiedad de
ser ácido-alcohol resistente está determinada por la composición de la pared celular, la
cual además de la capa de peptidoglicano, está constituida por un alto porcentaje de
glicolípidos hidrofóbicos (ceras), como el ácido micólico en Mycobacterium y el ácido
nocárdico en el género Nocardia. La presencia de estas ceras hidrofóbicas previene la
penetración de soluciones acuosas, siendo la causa de que estos microorganismos no
puedan ser teñidos por los métodos convencionales como la técnica de Gram.
En la actualidad la tinción de Ziehl-Nielsen tiene gran importancia como una de las

pruebas en el diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis agente causal de tuberculosis,
enfermedad granulomatosa crónica tanto del hombre como de los animales y cuya
incidencia ha aumentado recientemente.
Es importante mencionar que en el análisis de un frotis de material clínico sospechoso de

contener bacilos tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo ácido-alcohol resistente tiene
valor diagnóstico ya que en la mayoría de los casos no son abundantes. Sin embargo la
interpretación del hallazgo debe hacerse con cautela y con base en la historia clínica y
otras pruebas de laboratorio, debido a la existencia de especies saprofitas de
Mycobacterium y que podrían conducir a un diagnóstico falso. Por otra parte, existen
algunas especies de Corynebacterium que ocasionalmente pueden comportarse como
bacterias ácido-alcohol resistente.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos para llevar a cabo la tinción
de Ziehl-Nielsen sobre células bacterianas conocidas, para poner de manifiesto las
diferencias entre las bacterias ácido alcohol-resistentes y las que no lo son.
MATERIALES
Puente de coloración Portaobjetos
Mechero de Bunsen Asa bacteriológica
Microscopio
Solución fucsina fenicada
Solución de alcohol ácido
Solución de azul de metileno
Cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus y Klebsiella
Montajes de Mycobacterium tuberculosis teñidos con Zielh-Nielsen
MÉTODO
Técnica de Ziehl-Nielsen.
1. Haga dos frotis con las cepas asignadas.
2. Deje secar los frotis al aire y fíjelos con calor.
3. Colocar papel filtro sobre el frotis
4. Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada.
5. Caliente suavemente con la flama del mechero hasta la emisión de vapores y
mantenga la emisión durante cinco minutos.
NOTA: El colorante no debe hervir ni secarse, por lo que puede continuar

agregando colorante conforme sea necesario.
6. Dejar enfriar.
7. Escurra el exceso de colorante y retire suavemente el papel.
8. Lave con un chorro de agua suave.
9. Decolore exhaustivamente con alcohol ácido, realizando dos decoloraciones de un
minuto cada una.
10. Lave con un chorro suave de agua.

11. Cubra el frotis con azul de metileno y déjelo actuar durante un minuto.
12. Lave por último con un chorro suave de agua y deje secar la preparación.
13. Observe los frotis con objetivo de inmersión.
14. Describa la morfología microscópica de las cepas a las que realizó la tinción y al
montaje de Mycobacterium tuberculosis y realice esquemas de c/u de los frotis.
NOTA: Las bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR +) se tiñen de color rojo y las no
ácido-alcohol resistentes (BAAR -) de color azul.

 McVeyt, D. S. (2013). Veterinary microbiology. Estados Unidos : Wiley-Blackwell,

2013.

 Tortora, G.J., Funke, B.R. and Case, C.L. (2007). Introducción a la microbiología.

=false
 Black, J. (1996). Microbiology, principles and applications. Prentice Hall. 3rd ed.
USA
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

TINCIÓN DE ZIEHL-NIELSEN
I. RESULTADOS
Cuadro1. Descripción de la morfología bacteriana o microscópica.

Esquema del microorganismo 1 con el objetivo 100 X.
Género especie: ____________________________
Forma:____________________________________
Agrupación: ________________________________
BAAR: ___________________________________
Género especie: ____________________________
Forma:____________________________________
Agrupación: ________________________________
BAAR: ________________________________
Género especie: ____________________________
Forma:____________________________________
Agrupación: ________________________________
BAAR: ____________________________________
Dirigirla a la composición química de la pared celular de las bacterias acido-alcohol

resistentes, además comparar los resultados obtenidos con lo reportado en bibliografía.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

III. ASIGNACIÓN
1. Investigar ¿por qué es necesario calentar el colorante primario en esta técnica?

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2. Investigar a qué se debe la propiedad de algunas bacterias de ser ácido-alcohol

resistente.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 6
TINCIONES SELECTIVAS
INTRODUCCIÓN
Muchas estructuras bacterianas se pueden observar en condiciones adecuadas, sobre

todo cuando se aplican ciertas técnicas de tinción. Aunque algunos constituyentes
celulares son comunes en todas las células, otros solo los poseen ciertas especies. Las
tinciones selectivas se utilizan para poner de manifiesto estructuras celulares o bien para
obtener información acerca de sus componentes a través de su reacción con los
colorantes. En general las técnicas de tinción se basan en el hecho de que la estructura
celular que se desea poner de manifiesto tiene mayor grado de afinidad por los colorantes
utilizados, que el resto de la célula. Así se puede teñir o poner de manifiesto estructuras
como la cápsula, pared celular, material genético, fimbrias o pilis, flagelos, endoesporas e
inclusiones citoplasmáticas.
Los colorantes ácidos, que no tiñen a la célula, son a veces útiles para revelar las capas
superficiales con bajo índice de refracción, como la cápsula, que se encuentra sobre la
pared celular envolviendo a las bacterias. La mayoría de las cápsulas bacterianas están
compuestas por polisacáridos mientras que otras son de naturaleza polipeptídica. La
cápsula desempeña un papel importante en la virulencia de algunas bacterias patógenas,
ya que les confieren propiedades antifagocíticas que interfieren con los mecanismos de
defensa de los organismos infectados. Las cápsulas no pueden observarse en frotis
teñidos con las técnicas usuales, porque son incapaces de retener el colorante y porque
los procesos de fijación al calor y el lavado las disuelven; por lo tanto, las tinciones
negativas como la de rojo congo y la de tinta china o nigrosina donde no se tiñe la
bacteria pero sí su alrededor y no se usa el calor, ni sustancias químicas fuertes, resultan
ser la mejor opción.

Las esporas bacterianas o endoesporas son estructuras producidas durante el ciclo de
vital de ciertos géneros, que presentan una gran resistencia a agentes físicos y químicos
debido al número y estructura química de sus cubiertas. Por ésta misma razón, las
endoesporas son impermeables a los colorantes y en una tinción normal, se observan
como estructuras altamente refringentes y sin teñir. Sin embargo cuando se aplica calor a
un frotis cubierto de verde malaquita como en el caso de la técnica de Schaeffer y Fulton,
se facilita la penetración del colorante. El lavado y teñido posterior con safranina como
colorante de contraste, permite ver a las endoesporas de color verde dentro de células
rojas.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán y aplicarán los conocimientos para realizar

algunas técnicas de tinción selectivas y observar algunas estructuras bacterianas
(cápsulas y endoesporas).
MATERIALES
Portaobjetos Pinzas de disección sin dientes
Puente de tinción Mechero de Bunsen
Asa bacteriológica Pizeta
Microscópio Papel filtro
Solución de cristal violeta
Solución de lugol
Solución de alcohol-acetona
Solución de verde malaquita
Solución de safranina
Solución de rojo congo
Solución mordente de cápsula
Agua destilada
Cepas de Klebsiella pneumoniae, Bacillus sp y Staphylococcus aureus

MÉTODO
I. Observación de cápsula
Técnica del rojo congo
1. Coloque una pequeña gota de rojo congo en el centro del portaobjetos.
2. Tome un poco de cultivo de Klebsiella pneumoniae y suspéndala en la gota de
rojo congo, extiéndala hasta formar una película delgada.
3. Deje secar al aire y NO FIJE EL FROTIS AL CALOR.
4. Cubre el frotis con mordente de cápsula y déjelo actuar por un minuto.
5. Lave el frotis con agua destilada y deje secar al aire.
6. Observe el portaobjetos con lente de inmersión.
7. Repita el mismo procedimiento con la cepa de Staphylococcus aureus.
8. Realice los esquemas de sus observaciones.
9. Al terminar la observación, deseche la preparación en un frasco con desinfectante.
NOTA: La cápsula se observará como una zona clara o transparente alrededor de

la bacteria, que se observa de color rojo en un campo color azul oscuro.
Figura 6. Estructura bacteriana Figura 7. Observación microscópica de cápsula
Fuente: www.alaquarium.com/bacterias Fuente: ASM MicrobeLlibrary.org

II. Observación de esporas
A) Técnica de tinción de Gram.
1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus.
2. Tiña el frotis por la técnica de Gram.
3. Observe el frotis con lente de inmersión.
4. Repita el mismo procedimiento con el cultivo de K.pneumoniae.
5. Realice los esquemas de sus observaciones.
6. Al terminar la observación, deseche la preparación en un frasco con desinfectante.
NOTA: Las bacterias Gram positivas se verán de color azul o morado, y las esporas
se observaran como zonas claras sin teñir. Las bacterias Gram negativas se verán de
color rosa o rojo, observe la ausencia de las esporas.
B) Técnica de Schaeffer y Fulton.

1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus.
2. Cubra el frotis con un papel filtro e imprégnelo con verde malaquita.
3. Caliente el frotis con el mechero hasta la emisión de vapores.
4. Mantenga la emisión por cinco minutos. Evite que el colorante hierva o se seque el
frotis.
5. Deje enfriar y desprenda suavemente el papel filtro.
6. Lave el frotis exhaustivamente con un chorro de agua suave y sacúdalo para
eliminar el exceso de agua.
7. Cubra el frotis con safranina y déjela actuar por un minuto.
8. Lave con un chorro de agua suave.
9. Deje secar al aire la preparación o con ligera presión con toallas absorbentes.
10. Observe con lente de inmersión.
NOTA: Las esporas se observarán de color verde y las bacterias de color rojo.

Figura 8. Esporas bacterianas. A) subterminales B y C) centrales D) terminales
Fuente: Johnson T. And Case C (1992).
Figura 9. Esporas bacterianas observadas con tinción Gram
Fuente: ASM MicrobeLlibrary.org

 Hughes R. y Smith A. 2013. American Society for Microbiology (ASM).

Microbelibrary.org consultado en: http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-
test/3041-capsule-stain-protocols

=false
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.
 Johnson T. And Case C. (1992). Laboratory experiments in Microbiology. Benjamin
Cummings. 3rd edition. USA
 www.alaquarium.com/bacterias

TINCIONES SELECTIVAS
I. RESULTADOS
1. Observación de la cápsula con la tinción de rojo congo.
Cuadro1. Resultados de la morfología bacteriana ó microscópica.

Descripción:
Genero especie:
Forma:
Agrupación:
Cápsula
Descripción:
Genero especie:
Forma:
Agrupación:
Cápsula
2. Resultados de la observación de esporas
A) Resultados de esporas con la tinción de Gram.
Cuadro 2. Resultados de la morfología bacteriana y presencia de esporas.

Género especie: ___________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Espora: __________________________________

Género especie: ___________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Espora: __________________________________

B) Resultados de esporas con tinción de Scheafer y Fulton.
Cuadro 3. Resultados de morfología bacteriana (microscópica)

Descripción:
Género especie: ___________________________

Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Célula vegetativa:___________________________
Resaltar la importancia de las tinciones selectivas en la diferenciación bacteriana, y la

función que cumple la composición química de capsula y espora en los procesos de
teñido, además comparar los resultados obtenidos con lo reportado en bibliografía.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
III. ASIGNACIÓN
1. Investigue 5 ejemplos de géneros bacterianos de importancia en veterinaria que tengan

cápsula.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2. Investigue que compuestos químicos pueden formar las capsulas.

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3. Investigue dos ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que pueden formar

esporas.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
4. Investigar cuales son las partes que forman a una espora bacteriana.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 7
USO DE MEDIOS SELECTIVOS
INTRODUCCIÓN
Los requerimientos nutricionales de las bacterias son muy variados, lo cual hace
necesario contar con una amplia gama de medios de cultivo. La selección de éstos
depende de la cantidad y variedad de microorganismos en la muestra a estudiar, del tipo
de microorganismo que se prefiere aislar y los que se quiere eliminar para que su
abundancia no los encubra o dificulte el aislamiento.
Basados en la utilidad diagnóstica de los medios de cultivo, es posible hacer la siguiente

clasificación:
Medios simples: Son medios que promueven el desarrollo de microorganismos

nutricionalmente poco exigentes. Estos medios reciben también el nombre de medios
básicos o generales. Se utilizan principalmente para muestreos de medio ambiente o
superficies, análisis cuantitativos y conservación de cepas.
Medios enriquecidos: Son medios que han sido suplementados con nutrientes que
proporcionan factores de crecimiento para promover el desarrollo de microorganismos de
requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios contienen generalmente uno o más
de los siguientes ingredientes: sangre, suero, plasma líquido ascítico, huevo carne
vitaminas, aminoácidos específicos, NAD o hemina, entre otros.
Medios selectivos: Estos medios contienen sustancias inhibidoras para suprimir parcial o
totalmente el desarrollo de microorganismos no deseados. Las sustancias utilizadas con
mayor frecuencia son colorantes, sales inorgánicas, sales biliares, antibióticos y
detergentes. Los medios selectivos tienen una gran utilidad para el aislamiento de
gérmenes patógenos a partir de muestras clínicas que contengan bacterias de la
microflora normal.
Medios diferenciales: Estos medios contienen indicadores que permiten diferenciar
algunos géneros o especies bacterianas por el aspecto característico de sus colonias. La
mayoría de los medios selectivos son también diferenciales. Ejemplos: agar verde
brillante, agar ENDO, agar eosina azul de metileno, agar Salmonella-Shigella, agar

McConkey. Estos permiten diferenciar enterobacterias fermentadoras de lactosa
(coliformes).
Medios de enriquecimiento: Estos medios son líquidos y poseen efecto inhibitorio sobre
ciertos géneros bacterianos, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de otros que se
encuentran en menor proporción en la muestra. Son medios muy utilizados en la
bacteriología del tracto intestinal, principalmente para el enriquecimiento de Salmonella
sp. a partir de muestras de heces en las cuales el número de salmonelas puede ser muy
pequeño en comparación al elevado número de bacterias que normalmente habitan el
tracto intestinal. Estos medios se inoculan mediante un hisopo o bien depositando la
muestra en el medio a una proporción de 1:10, ejemplo, un gramo de muestra en 10 ml
de medio, el período de incubación de estos medios debe ser de 12-18 horas y es
necesario resembrar a partir de ellos, en medios selectivos y diferenciales para identificar
colonias características. Ejemplos de éstos medios son el caldo selenito y el caldo
tetrationato, medios de enriquecimiento para Salmonella sp.
Medios de transporte: Son medios utilizados para el transporte de las muestras clínicas
desde el lugar de su colección hasta el laboratorio. Su finalidad es preservar la viabilidad
de los microorganismos cuyo aislamiento va a intentarse posteriormente. La composición
de este tipo de medios varía considerablemente de acuerdo al microorganismo cuya
viabilidad se desea preservar. Estos medios pueden ser desde una simple solución
fisiológica amortiguada, hasta medios más complejos que contengan sustancias
inhibidoras, agentes reductores, sustancias osmóticamente activas (sacarosa), suero, etc.
Algunos ejemplos de estos medios son: medio de Stuart, medio de Carry-Blair, utilizados
como medios de transporte de uso general para un gran número de bacterias aerobias y
anaerobias. Medio Campy-thio y medio Clark-Dufty, diseñados para preservar la viabilidad
de Campylobacter sp. y la solución amortiguadora de Bovarnyk, para preservar la
viabilidad de Chlamidias y Rickettsias.
Medios especiales: Son medios que no pueden ser fácilmente agrupados en alguno de
los grupos de medios descritos anteriormente y la mayoría son utilizados para comprobar
una o más características bioquímicas de los microorganismos.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán las habilidades para poder identificar diferentes
tipos de medios de cultivo y su utilidad en el aislamiento e identificación de bacterias.

MATERIALES
Caja petri con agar Mac Conkey
Caja petri con agar eosina azul de metileno
Caja petri con agar Staphylococcus
Caja de petri con agar Sal y manitol
Tubo de 13X100 con caldo glucosado
Tubo de 13 X 100 con medio Stuart
Tubo de 16 X150 con Caldo bilis verde brillante al 2%
Cepas de Escherichia coli, Salmonella cholerae suis, Proteus sp y Staphylococcus

aureus, Bacillus sp.
MÉTODO
Medios de cultivo selectivos
1. Sembrar por estría cruzada la mezcla de bacterias (Gram + y -) proporcionada
por el profesor en el Agar Sal y manitol y el Agar Verde brillante.
2. Sembrar los cultivos puros en los medios de cultivos restantes según la técnica
correspondiente (estría cruzada, picadura o por asada), conforme lo indica las
tablas 1 y 2 anexas.
3. Identificar las cajas de petri y los tubos con el nombre del cultivo.
4. Formar un paquete con las cajas y los tubos sembrados para incubar a 37ºC
durante 24-48 horas.
5. Observar el cambio de color que se da en los medios de cultivo, la morfología
colonial de los cultivos.
6. Interpretar los resultados, de acuerdo al tipo de medio de cultivo y el
microorganismo sembrado, registra conforme se te pide en los cuadros 3 y 4.
7. Investiga y llena los cuadros restantes de las tablas 1, 2, 3 y 4, según
corresponda.
Registra todos los resultados de manera gráfica y descrita en las tablas del reporte
de práctica 8, sigue lo indicado en el mismo para la elaboración de tu reporte.

 Madigan, M.T. (2004). Brock. Biología De Los Microorganismos. Editorial Pearson
Education, Inc. 10ª Edicion. España
en:https://books.google.com.mx/books
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

REPORTE DE LA PRÁCTICA 7
USO DE MEDIOS SELECTIVOS
I. RESULTADOS
Complete las tablas anexas con sus observaciones de laboratorio e investiga las
columnas en blanco.
Medio de Color del Indicador Tipo de Cepa Forma de

cultivo medio de que contiene medio de bacteriana siembra en el
cultivo el medio cultivo medio de
cultivo
Caldo E. coli ó
glucosado Salmonella
Caldo bilis
verde brillante E. coli
Medio Stuart en S. aureus

tubo
A. Mac Conkey Salmonella

en placa
Verde brillante Mezcla de

en placa bacterias
Eosina Azul de Proteus

metileno en
placa
Agar S. aureus
Estafilococcus
110 en placa
Sal y manitol en Mezcla de

placa bacterias
Agar nutritivo Bacillus

en placa o tubo
inclinado

Medio de Cepa Morfología colonial Forma y Modificación en el
cultivo bacteriana agrupación medio a las 24 hrs
bacteriana y de cultivo
tinción de
Gram
Caldo E. coli ó
glucosado Salmonella
Caldo bilis verde

brillante E. coli
Medio Stuart en S. aureus

tubo
A. Mac Conkey Salmonella

en placa
A. Verde Mezcla de
brillante en bacterias
placa
A. Eosina Azul Proteus

de metileno en
placa
A.Estafilococcus S. aureus
110 en placa
A. Sal y manitol Mezcla de

en placa bacterias
Agar nutritivo en Bacillus

placa o tubo
inclinado

II. ASIGNACIÓN:
Investiga y explica a que se atribuyen los cambios que se producen en los medios de
cultivo conforme al metabolismo bacteriano de dos cepas seleccionadas.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
III. DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
Dirigida hacia los factores de crecimiento y nutricionales necesarios para las diferentes
bacterias, y las ventajas de la utilización de diferentes tipos de medios de cultivo. Se
deben reportar al menos dos autores, y además deben estar referenciados en el texto de
la discusión.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFIA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 8
USO DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
INTRODUCCIÓN
La identificación de una bacteria a partir de una muestra clínica exige su aislamiento en

cultivo puro, de ahí que es muy importante la técnica de siembra y el uso de diferentes
medios de cultivo. Sin embargo el crecimiento de las bacterias implica necesidades de
ciertos nutrientes para llevar a cabo su metabolismo, el cual puede variar según el tipo de
bacteria de que se trate, de ahí el uso de una gran variedad de pruebas bioquímicas que
miden la presencia o ausencia de enzimas que participan en el catabolismo del sustrato
que se añade al medio diferencial.
Muchas de estas pruebas se leen mediante los cambios de color que se producen en los
medios de cultivo por la presencia de indicadores de pH. Así se usan medios diferenciales
como por ejemplo: el caldo rojo de fenol, al cual se le adicionan carbohidratos (glucosa,
trehalosa, maltosa, fructosa) para valorar la fermentación de azúcares mediante la
observación de burbujas de gas de hidrógeno o dióxido de carbono atrapadas en un vial
invertido y la acidificación del medio original se hará evidente por el viraje de color rojo
original a amarillo.
Existe una gran variedad de pruebas bioquímicas que auxilian al médico clínico o al
microbiólogo en la identificación del género y la especie del agente patógeno presente en
una muestra clínica, esto es de gran importancia, pues con la correcta interpretación de
estos hallazgos podrá confirmarse el diagnóstico del agente causal de la enfermedad y
con ello podrán adoptarse las medidas terapéuticas y preventivas idóneas según el caso.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos y habilidades para identificar,

inocular e interpretar las diferentes pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación
bacteriana.

MATERIALES
Asa bacteriológica Cronómetro
Portaobjetos Puente de tinción
Microscopio
Tubos de 13x100 con medio SIM
Tubos de 13x100 con citrato de Simmons
Tubos de 13x100 con caldo glucosado
Tubos de 13x100 con medio TSI
Tubos de 13x100 con agar urea
Solución de rojo de metilo
Solución de alfa-naftol
Solución de KOH creatinina o KOH al 40 %
Solución de KOH al 3%
Solución de H2O2 al 3%
Plasma de conejo hidratado
Reactivo de Kovac`s
Cepas bacterianas de: E. coli, Salmonella sp, Klebsiella sp, Proteus sp, Streptococcus sp
y Staphylococcus aureus
MÉTODO
PRIMERA SESIÓN
A) Prueba para confirmación de la tinción de Gram o de KOH al 3%

1. Esta prueba consiste en colocar sobre un portaobjetos una gota de KOH al 3% y
con el asa hacer una suspensión de la colonia de bacterias a probar.
2. Mezclar con movimientos giratorios de 1 a 3 minutos.
3. Separar el asa de la mezcla, si se forma una hebra o hilo viscoso, indica que
se trata de bacterias Gram negativas, si esto no sucede, se tratará de
bacterias Gram positivas.
4. Realiza esta prueba con los diferentes cultivos y confirma si es Gram (+) o Gram
(–).

B) Pruebas bioquímicas para bacterias Gram negativas
Realiza la siembra de pruebas bioquímicas siguiendo el orden de la figura 11 y las
indicaciones siguientes:
1. Medio TSI
- Sembrar por picadura y estría en la superficie de los tubos de TSI cada una de las
cepas proporcionadas.
- Incubar los tubos a 37º C durante 24 horas.
- Observar e interpretar los resultados como sigue:
a) Fermentación de glucosa: color amarillo en el fondo del tubo.
b) Fermentación de lactosa: color amarillo en la superficie del medio.
c) Producción de gas: burbujas en el fondo del tubo.
d) Producción de ácido sulfhídrico: precipitado de color negro en el fondo del
tubo.
2. Prueba de rojo de metilo y Vogues-Proskauer

- Sembrar en dos tubos de caldo glucosado o medio RM-VP las cepas
proporcionadas.
- Incubar a 37º C durante 24-48 hrs.
- Observar e interpretar los resultados como sigue:
a) Prueba de rojo de metilo: Añada al tubo 5 gotas del reactivo rojo de metilo y
sin agitar observe la presencia de un anillo de color rojo en la superficie
del medio; la prueba será negativa cuando no exista el color rojo.
b) Prueba de Vogues-Proskauer: Añada al tubo 6 gotas de alfa-naftol y dos
gotas de KOH creatina, agitar suavemente y dejar reposar el tubo de 10 a 15
min. La prueba positiva será la aparición de color rojo en la superficie del
tubo y en la negativa no hay coloración roja.
3. Utilización de citrato
- Sembrar un tubo de citrato de Simmons por estría en la superficie, para cada cepa
proporcionada.

- Incubar los tubos a 37º C durante 24-48 hrs.
- Observar e interpretar el resultado como sigue: El crecimiento y vire del
indicador de verde a azul, significan que el microorganismo dio la prueba a
la utilización del citrato.
4. Medio SIM
- Sembrar por picadura utilizando el asa recta, un tubo con medio SIM para cada
cepa proporcionada.
- Incubar los tubos a 37º C durante 24-48 hrs.
- Observe e intérprete los resultados como sigue:
a) Producción de ácido sulfhídrico: precipitado de color negro.
b) Movilidad: positivo si hay turbiedad, e inmóvil si solo hay crecimiento en la
picadura.
c) Producción de Indol: Añada 5 gotas de reactivo de Kovacs, la coloración roja
indica que la prueba es positiva.
5. Producción de ureasa
– Siembre el agar inclinado una asada de cultivo abundante sobre la superficie
– Incube a 37º C de 1 a 7 días.
– La reacción positiva se observa al virar el medio a un color rosa intenso.
– Si no hay cambios en el medio de cultivo, es negativo.
C) Pruebas bioquímicas para bacterias Gram positivas

Realiza la siembra de pruebas bioquímicas siguiendo el orden de la figura 10 y las
indicaciones siguientes:
1. Prueba de catalasa: Esta prueba es muy útil para la diferenciación de los

estreptococos de los estafilococos y micrococos.
- Sobre un portaobjetos coloca una gota de peróxido de hidrógeno al 3%, y con el
asa tomar una de las colonias.
- Mezcla la colonia con la gota con movimientos giratorios.
- Interpreta resultado de prueba. La lectura se hace inmediatamente, si aparece un
burbujeo la prueba es positiva.

NOTA: Pueden presentarse falsos positivos si la colonia se toma de un medio
adicionado con sangre.
2. Prueba de coagulasa
- Toma con el asa aproximadamente 5 colonias del medio de Baird Parker e
introducirlas en el vial que contiene el plasma hidratado e incubar a 37ºC de 1 a 3
hrs.
- Evita agitar el tubo para observar la formación del coagulo, se considera la
prueba positiva si el contenido del tubo en más de tres cuartas partes
presenta la formación de un coagulo compacto.
SEGUNDA SESIÓN
1. Revela las reacciones bioquímicas e Interpreta según la prueba realizada a través de

los cambios en los medios de cultivo utilizados.
2. Identifica el género y especie de las bacterias estudiadas.


Figura 10. Pruebas Bioquímicas para bacterias Gram (+)
Tinción de Gram
Bacilo largo (+) Bacilo grueso (+)

Cocos (+) Bacilos corto (+) Con esporas con esporas forma
Centrales de huso
Bacillus spp Clostridium spp

Catalasa Catalasa
(+) (-)
Catalasa (+) Listeria spp Erysipelothrix spp
Corynbacterium spp Actinomyces pyogenes
Coagulasa
Staphylococcus
Staphylococcus aureus epidermidis
(+) (-)
Catalasa (-)
Streptococcus spp

Figura 11. Pruebas Bioquímicas para bacterias Gram (-)
Bacilos Gram (-)
Oxidasa
Positivo (+) Negativo (-)
Pasteurella spp
Hemophilus spp Enterobacteriaceae
Bordetella spp
Actinobacillus spp
Pseudomonas spp TSI, UREA, SIM,

Aeromonas spp CITRATO
Moraxella spp
TSI, UREA, SIM,

CITRATO, LITMUS, Interpretar resultados
MILK, SUGARS
y consultar referencia.
Interpretar resultados
y consultar
referencia.

=false
A. 1994.
1989.

USO DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
I. RESULTADOS
a) Morfología bacteriana de las cepas asignadas.

CEPA 1:____________________________________
Forma: _____________________________________
Agrupación: _________________________________
T. Gram: ___________________________________
Cápsula, espora:_____________________________

CEPA 2:____________________________________
Forma: _____________________________________
Agrupación: _________________________________
T. Gram: ___________________________________
Cápsula, espora:_____________________________
b) Prueba de confirmación de Tinción de Gram con KOH al 3%
CEPA 1:
Formación de hebra en forma de rosario:
POSITIVA ( ) NEGATIVA ( )
CEPA 2:
Formación de hebra en forma de rosario:
POSITIVA ( ) NEGATIVA ( )

C) Morfología colonial.
CARACTERÍSTICA CEPA 1 CEPA 2

Tamaño
Color
Forma
Elevación
Bordes
Superficie
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
Tinción de Gram
Confirmación de Gram
d) Pruebas bioquímicas para bacterias Gram negativas y Gram positivas
REACCIÓN BIOQUIMICA CEPA 1 CEPA 2

T. Gram
Tubo de TSI
Fermentación de lactosa
Fermentación de glucosa
Producción de gas
Tubo de SIM
Producción de ácido sulfhídrico
Producción de indol
Movilidad
Utilización de Citrato de Simmons

Prueba de ureasa
Prueba de rojo de metilo
Prueba de Vogues-Proskauer
Prueba de oxidasa
Prueba de catalasa
Prueba de coagulasa
Género y especie

II. ASIGNACIÓN
Investiga las reacciones bioquímicas de las cepas bacterianas que utilizaste en la
práctica.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
III. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Dirigirla hacia la interpretación de las reacciones bioquímicas para la identificación
bacteriana. Se deben reportar al menos dos autores y deben estar citados en el texto de
la discusión.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

PRÁCTICA 9
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS
INTRODUCCIÓN
La observación del afecto inhibidor de algunos microorganismos sobre otros data desde
1874. Pasteur y otros investigadores observaron que infectando a un animal con
Pseudomonas aeruginosa, lo protegía contra Bacillus anthrasis.
Posteriormente se usó el término antibiosis para explicar el efecto de inhibición sobre

otros microorganismos y el término de antibiótico para la sustancia que causa tal efecto.
Este fenómeno puede apreciarse al realizar pruebas de sensibilidad a antimicrobianos.
Las pruebas de uso más común y comercial son las de difusión en agar, en las que se
aplica una fuente de antibiótico a una superficie de medio sólido: el agente difunde a
través del medio inhibiendo el crecimiento del microorganismo sensible. Sin embargo, en
la actualidad se conocen varios factores que pueden influir en el tamaño de la zona de
inhibición.
1) Los componentes del medio de cultivo: Ingredientes como la peptona, triptona y

extracto de levadura, pueden variar en su contenido mineral, y minerales como el calcio,
magnesio y el hierro, disminuyen la actividad de los amino glucósidos y aumentan el
efecto del ácido fusídico. Otro ejemplo es el efecto de los carbohidratos sobre la
ampicilina y la furantoína.
2) Efecto del pH: La actividad de los aminoglucósidos se ve aumentada en medio
alcalino; así como la presencia de dióxido de carbono en la estufa y carbohidratos
fermentables en los medios de cultivo, pueden inducir condiciones ácidas.
3) Tamaño del inóculo: Se ha observado que las siembras densas disminuyen en algún
grado las zonas de inhibición, por lo que los cultivos en caldo y las suspensiones en
medio sólido se pueden diluir para obtener el inóculo idóneo.
Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el método de difusión en agar, son
pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel filtro impregnado con
concentraciones conocidas de los diferentes agentes quimioterapéuticos (sensidiscos).

Estos discos se colocan sobre la superficie del agar previamente sembrado con la cepa
problema. Después de la incubación, se observan zonas o halos de inhibición del
desarrollo bacteriano alrededor de los discos con los quimioterapéuticos, a los cuales el
microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la cepa bacteriana es resistente, se
presenta crecimiento alrededor del disco.
El uso indiscriminado de los antimicrobianos ha originado la selección de cepas

bacterianas multirresistentes, por lo que resulta difícil predecir la susceptibilidad con base
a la experiencia clínica. Muchas cepas de microorganismos tradicionalmente sensibles a
ciertos antibióticos son ahora resistentes, debido principalmente a la amplia distribución
de plásmidos de resistencia múltiple.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos y habilidades para realizar e

interpretar las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos por difusión en agar.
MATERIALES
Pinzas de disección Gradilla
Mechero Bunsen Portaobjetos
Puente de tinción Microscopio
Cronómetro Regla graduada
Hisopos estériles
Colorantes para tinción de Gram.
Cajas petri con agar Mueller-Hinton
Discos de papel filtro impregnados con quimioterapéuticos
Frascos con alcohol
2 tubos con Solución salina fisiológica
Tubo 0.5 de la serie de Mac Farland.
Cepas en placa de Escherichia coli y Staphylococcus aureus

MÉTODO
1. Tinción de Gram
- Realice una tinción de Gram de una colonia característica de E.coli y S. aureus.
2. Preparación de inóculo
- Tome varias colonias (2-3) características de E .coli y suspéndalas en un tubo con
sol. salina fisiológica homogenizando con movimientos suaves para evitar
derrames.
- Compare la turbidez de esta suspensión con la turbidez del tubo 0.5 de Mac.
Farland.
- Ajuste la turbidez si es necesario adicionando una colonia más.
- Repita este mismo procedimiento con la cepa de S.aureus.
3. Inoculación de las placas de Mueller – Hinton

- Humedezca un hisopo en la suspensión de la cepa de E. coli y exprima el exceso
en las paredes del tubo.
- Inocule una placa de agar Mueller-Hinton sembrando en toda la superficie del agar
con el hisopo (ver figura 12) y permita que la placa seque de 3 a 5 minutos.
- Coloque los sensidiscos sobre la superficie del agar ayudándose con la pinza
previamente flameada en alcohol y presiónalos ligeramente para poner en
contacto el antibiótico con la cepa.
- Repita el procedimiento anterior, con la cepa de Staphylococcus aureus.
- Incube las placas a 37º C durante 24 horas.
- Mida (en mm) el diámetro de inhibición del crecimiento producido por cada
antibiótico y anote los resultados.
- Interprete utilizando la tabla 1 de Interpretación de antibiograma según los halos
de inhibición.

Figura 12. Siembra de antibiogramas
Fuente: McMaster University (2014) y Tlahui-Medic (2011).
Tabla 1. Interpretación de antibiograma

TABLA DE INTERPRETACIÓN DE ANTIBIOGRAMA
R=resistente; I=intermédio; S=sensible
Abreviatura Agente antimicrobiano Contenido del disco Diámetro de halo de inhibición
en mm
R I S
AK Amikacina Enterobacteriaceae 30 µg <14 15-16 >17
AM Ampicilina 10µg
Enterobacteriaceae 30 µg <13 14-16 >17
Staphyloccocus spp <28 - >29
Enterococcus spp <16 - >17
Streptococcus spp - - >24
CB Carbencilina 100µg
Enterobacteriaceae < 19 20-22 >23
Pseudomonas aeruginosa <13 14-16 >17
CF Cefalotina Enterobacteriaceae 30 µg <14 15-17 >18
FEP Cefepime Enterobacteriaceae 30 µg <14 15-17 >18
CTX Cefotaxima Enterobacteriaceae 30 µg <14 15-22 >23
CAZ Ceftazidima Enterobacteriaceae 30 µg <14 15-17 >18
CRO Ceftriaxona Enterobacteriaceae 30 µg <13 14-20 >21
CXM Cefuroxima Enterobacteriaceae 30 µg <14 15-22 >23
CL Cloranfenicol Enterobacteriaceae 30 µg <12 13-17 >18
DC Dicloxacilina 1 µg
Staphyloccocus spp <10 11-12 >13

ENX Enoxacina Enterobacteriaceae 30 µg <14 15-17 >18
E Eritromicina 15 µg
Enterococcus spp <13 14-22 >23
GE Gentamicina Enterobacteriaceae 10 µg <12 13-14 >15
LEV Levofloxacina Enterobacteriaceae 5 µg <13 14-16 >17
NET Netilmicina Enterobacteriaceae 30 µg <12 13-14 >15
NF Nitrofurantoina Enterobacteriaceae 300 µg <14 15-16 >17
PEF Pefloxacina 5 µg <14 15-22 >23
PE Penicilina 10U
Staphyloccocus spp <28 - >29
Enterococcus spp <14 - >15
N. gonorrhoeae <26 27-46 >47
Streptococcus spp - - >24
TE Tetraciclina Enterobacteriaceae 30 µg <14 15-18 >19
SXT Trimetoprim-sultametoxazol 25 µg <10 11-15 >16
NOR Nafloxacina 5 µg <17 18-20 >21
CEF Ceptioflur 5 µg <17 18-20 >21
ENR Enrofloxacina 5 µg <17 18-21 >22
FLR Florfenicol 5 µg <16 17-20 >21
CIP Ciprofloxacin 5 µg <17 18-20 >21
NOR Norfloxacina 10 µg <13 14-18 >19

 Espinoza M. E., Serrano C. C. V., Rojas. A. M., Orea E. E. P., Villegas C. R. J.
(2011). Evaluación mediante antibiogramas del efecto de la quina amarilla
(Hintonia latiflora (Sesse et Moc.ex.DC) Bullock), cuachalalate (Hypopterygium
adstringensSchltdl.), estafiate (Artemisia ludoviciana ssp. mexicana (Willd. ex
Spreng.) Keck), eucalipto (Eucalyptus camaldulensis Dehn.), y tomillo (Thymus
vulgaris L.), en cepa patógena de Escherichia coli. Consultado en:
http://www.tlahui.com/medic/medic32/fito_antibiogramas.htm

 Quinn, P. J., & I. Markey, B. K. (2003). Concise review of veterinary microbiology.
Oxford [etc.]: Blackwell, 2003.
=false
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS
I. RESULTADOS
Realice un esquema de los halos de inhibición observados en la prueba de difusión en

agar (antibiograma).
Antibiograma1 Antibiograma 2
Anote el resultado de la actividad de los antibióticos en placa sobre los cultivos

bacterianos utilizados.
ANTIBIÓTICO GRAM SENSIBILIDAD GRAM SENSIBILIDAD
NEGATIVO S sensible POSITIVO S sensible
Nombre / abreviatura I intermedio I intermedio
(mm del halo) (mm del halo)
R resistente R resistente

II. ASIGNACIÓN
Investigar acerca de las consecuencias del uso irracional de los antimicrobianos en los
animales en producción y elabora un ensayo.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
De los antibióticos probados y sensibles, indica cuales utilizarías y por qué, justifica en
función del microorganismo y la enfermedad que ocasiona. Se deben consultar al menos
dos autores y citarse la discusión.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFIA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 10
CULTIVO DE ANAEROBIOS
INTRODUCCIÓN
Un factor que influye de manera importante en el crecimiento microbiano es el oxígeno y

aunque es un gas muy reactivo, muchos microorganismos dependen de la disponibilidad
del oxígeno molecular como nutriente. Los microorganismos se pueden clasificar de
acuerdo a sus necesidades y tolerancia al oxígeno en: aerobios estrictos,
microaerofílicos, anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y anaerobios
aerotolerantes. Los aerobios estrictos dependen del oxígeno, ya que lo utilizan como
aceptor final de electrones en la cadena respiratoria y no pueden llevar a cabo la
fermentación. Los microaerofílicos no requieren de oxígeno pero lo toleran a bajas
concentraciones. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si está disponible, pero
también pueden crecer en ausencia del mismo, ya que pueden realizar un metabolismo
oxidativo o fermentativo dependiendo de las condiciones de cultivo. Los anaerobios
estrictos no pueden utilizar el oxígeno ya que solo pueden efectuar un metabolismo
fermentativo e incluso no crecen o mueren en presencia de oxígeno debido a que les
resulta tóxico aún a bajas concentraciones, mientras que los anaerobios aerotolerantes
crecen a bajas o elevadas concentraciones de oxígeno aunque no lo utilicen en su
metabolismo. Aún cuando la toxicidad del oxígeno se manifiesta claramente sobre los
anaerobios, a concentraciones elevadas resulta tóxico incluso para los aerobios estrictos
ya que el oxígeno es un agente oxidante fuerte, capaz de generar un grupo de radicales
libres (singlete, superóxido, peróxido e hidróxilo), que reaccionan sobre moléculas
orgánicas. Los microorganismos que toleran el oxígeno, por lo general contienen enzimas
que los protegen de la toxicidad como son la catalasa, peroxidasa y la superóxido
dismutasa.

Mientras que la aireación se emplea para incrementar el crecimiento de los
microorganismos aerobios, el oxígeno debe ser excluido del medio de cultivo para permitir
el crecimiento de los anaerobios estrictos. Esto se puede hacer agregando sustancias
reductoras al medio de cultivo que reaccionan con el oxígeno molecular disuelto,
eliminándolo. Por ejemplo, frecuentemente se añade tioglicolato de sodio, cisteína u otros
compuestos que contienen grupos sulfhidrilos.
En los medios líquidos se suele burbujear nitrógeno, hidrógeno o bióxido de carbono para
desplazar al oxígeno y posteriormente se sella el recipiente para evitar que entre de
nuevo el oxígeno. Además, hay muchos modelos de cámaras de cultivo para anaerobios
que se emplean para eliminar el oxígeno de la atmósfera. Estos modelos como el sistema
GasPack, generan hidrógeno el cual reacciona con el oxígeno mediante un catalizador
dentro de la campana produciendo agua; también se genera bióxido de carbono para
reemplazar el volumen de gas agotado por la conversión de oxígeno a agua. En todos
estos métodos es recomendable utilizar indicadores de oxido-reducción como el azul de
metileno y la resazurina que permiten conocer las condiciones del sistema; en
condiciones oxidadas los indicadores están coloreados y en condiciones reducidas son
incoloros. La cuantificación del estado de oxidación de un medio se expresa por la
relación del potencial de óxido-reducción (O/R). El potencial se puede medir utilizando
electrodos y un potenciómetro, cuando los valores son positivos significa que hay oxígeno
disuelto en el medio y los compuestos orgánicos están parcialmente oxidados, cuando
son negativos significa que no hay oxígeno disuelto y los compuestos orgánicos están
reducidos.
COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos y habilidades para poner en

práctica algunas técnicas para el aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias.
MATERIALES
Plastilina
Tubos de 16 X 150 con 5 ml de agua destilada estéril
Tubos de 16 X 150 con tapón de rosca con caldo tioglicolato
Tubos de 16 X 150 con tapón de rosca con caldo nutritivo
Pipetas Pasteur estériles

Cajas de petri con gelosa sangre
Muestra de material fecal animal
Cepas de Clostridium sp, Bacillus subtilis y Escherichia coli
MÉTODO
PRIMERA SESIÓN
A) Aislamiento de bacterias anaerobias de material fecal.

1. Adiciona aproximadamente un gramo de muestra a un tubo con 5 ml de agua
destilada estéril, agitar y dejar sedimentar durante 10 minutos.
2. Toma una asada del sobrenadante y sembrar por estría cruzada en una placa de
gelosa sangre.
3. Agita de nuevo el tubo y calentar la muestra a ebullición por 10 minutos y dejar
sedimentar otros 10 minutos.
4. Siembra otra placa con gelosa sangre.
5. Incuba las cajas en anaerobiosis a 37º C durante 40 horas.
B) Cultivo de bacterias anaerobias en medios líquidos.

1. Inocula con ayuda de una pipeta Pasteur estéril cada una de las cepas
proporcionadas en los tubos con caldo tioglicolato y caldo nutritivo.
2. Incuba a 37 ºC durante 24 - 48 horas.
C) Cultivo de microorganismos anaerobios por comensalismo.

1. Divide una caja de gelosa sangre en dos y en un lado siembra una asada de
Clostridium sp y del otro lado una asada de Bacillus subtilis.
2. Sella con plastilina los bordes de la caja.
3. Incuba a 37º C durante 24 - 48 horas.

SEGUNDA SESIÓN
1. Describe la morfología colonial de dos colonias aisladas a partir de la muestra de

materia fecal (hervida y sin hervir) y la morfología microscópica utilizando la tinción
de Gram.
2. Observa el crecimiento de las cepas bacterianas sembradas en los medios

líquidos y discute los resultados.
3. Observa el crecimiento de la bacteria anaerobia y de la aerobia y realice un frotis y

tinción de Gram de cada uno. Realice esquemas.

 Madigan, M.T. (2004). Brock. Biología de los microorganismos. Editorial pearson
Education, Inc. 10ª Edicion. España.

2013.




=false

A. 1994.
 Collins, C., & Lyne, P.M. (n.d). Métodos microbiológicos. España ACRIBIA, S. A.
1989.

Mexico LIMUSA 1993.
 Ikram, M., (n.d). MICROBIOLOGY FOR VETERINARY TECHNICIANS. Estados

Unidos. AMERICAN VETERINARY PUBLICATIO.1991.

CULTIVO DE ANAEROBIOS
I. RESULTADOS
A) aislamiento de bacterias anaerobias de material fecal.
Dibuja el crecimiento bacteriano de la siembra en la caja de Petri de la muestra de heces
MUESTRA HECES SIN HERVIR MUESTRA HECES HERVIDA
1. 2. Descripción morfológica de las colonias aisladas.

CARACTERISTICA COLONIA 1 (HERVIDA) COLONIA 2 (SIN HERVIR)
Tamaño
Color
Forma
Elevación
Bordes
Superficie
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
2. Descripción microscópica de las colonias aisladas

CARACTERÍSTICA COLONIA 1 (HERVIDA) COLONIA 2 (SIN HERVIR)
FORMA
AGRUPACIÓN
GRAM
ESPORAS

3. Cultivo de bacterias anaerobias en medios líquidos
Descripción:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
4. Cultivo de microrganismos anaerobios por comensalismo
Tinción de Gram de Tinción de Gram de

Bacillus Clostridium
Realiza un dibujo de la caja con los cultivos

II. ASIGNACIÓN
1. Investiga al menos tres bacterias anaerobias de importancia en medicina veterinaria
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2. Investiga los patrones de crecimiento bacteriano en diferentes medios de cultivo de

bacterias anaerobias.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
III. DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

Dirigida a la formación de esporas en bacterias anaerobias como protección ante
condiciones ambientales adversas y el efecto del oxígeno en las bacterias.
Se deben consultar al menos dos autores, mismos que deben estar referenciados en el
texto de la discusión.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

PRÁCTICA 11
AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGÍA COLONIAL
INTRODUCCIÓN
Los hongos son organismos eucarióticos unicelulares o filamentosos con paredes

celulares compuestas de quitina y otros polisacáridos, no fotosintéticos, saprofitos o
parásitos, quimiorganotróficos aerobios que se nutren por absorción y se propagan por
esporas producidas en condiciones normales de reproducción sexual y asexual. Esta
definición tan vaga y amplia se hizo para abarcar todas las anomalías morfológicas y
fisiológicas que ocurren entre los hongos.
La clasificación de los hongos se basa en gran parte en las estructuras de reproducción

que incluyen la naturaleza del ciclo biológico, las estructuras reproductoras y las esporas.
Los principales grupos taxonómicos se basan en las esporas de reproducción sexual.
Aunque en un sentido sistemático formal las levaduras no son diferentes del resto de los
hongos, en la práctica es frecuente que éstas se traten por separado de los hongos
filamentosos tanto en los sistemas de clasificación como de identificación, ocurriendo lo
mismo para otro tipo de hongos como son las setas. Algunos hongos presentan un
comportamiento dimórfico, esto significa que pueden presentar una forma filamentosa y
otra levaduriforme dependiendo del ciclo de vida, del hábitat en el que se encuentren o de
las condiciones de cultivo.
Tradicionalmente los hongos se han separado en dos grandes grupos, los Mixomicetos y
los Eumicetos. Los mixomicetos representan la línea divisoria entre los protozoos y los
hongos. Desde el punto de vista veterinario, los hongos tienen gran interés debido a que
algunas especies causan enfermedades (micosis) y otras se desarrollan en el alimento
para animales produciendo micotoxinas, que pueden provocar intoxicaciones
alimenticias.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán las habilidades para llevar a cabo el aislamiento
de hongos, y realizar la diferenciación de las estructuras que los forman mediante una
descripción morfológica tanto macroscópica como microscópica
MATERIALES
Asa en ángulo recto Portaobjetos y cubreobjetos
Puente de coloración Microscopio
Algodón Papel Kraft
Cubre bocas Guantes de látex
Cajas de petri con agar rosa de bengala
Cajas petri con agar dextrosa Sabouraud
Tubos de ensaye de 16 X 150 con 10 ml de formaldehído al 10%
Solución de lactofenol azul de algodón
Barniz de uñas transparente
Fenol al 3%
Jabón antiséptico líquido
Cepas de Penicillium sp, Aspergillus sp y Sacharomyces cerevisae o Torula
MÉTODO
PRIMERA SESIÓN
A) Aislamiento de hongos
NOTA IMPORTANTE
Coloca el cubre bocas de modo que proteja tu nariz y boca.
Evita moverte de un lugar a otro para evitar el desplazamiento de las esporas.
Coloca un tapete humedecido con fenol al 3% en la superficie de la mesa
donde vas a trabajar.
1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA
IMPORTANTE.

2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a sembrar, el mechero
de bunsen y los medios de cultivo.
3. Esteriliza al fuego el asa doblada en ángulo recto (90°) y toma un poquito del
micelio aéreo.
4. Siembra el hongo por picadura en el centro de una placa de agar dextrosa
Sabouraud.
5. Repite el mismo procedimiento con la placa de agar Rosa de Bengala.
6. Siembra el hongo levaduriforme (Sacharomyces o Torula) estriando sobre la placa
de agar.
7. Sella las placas de los hongos filamentosos con cinta masking tape.
8. Incuba los medios de cultivo inoculados a temperatura ambiente durante 3 - 4 días
para desarrollo de la forma mohosa (filamentosa) y a 37°C la forma levaduriforme.
9. Revisa los medios de cultivo cada 24 a 48 hrs.
10. Anota los cambios de forma y color que se presentan, dibujándolos conforme el
crecimiento de la colonia.
B) Observación de la morfología microscópica.

IMPORTANTE.
2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a sembrar, el mechero
de bunsen y los medios de cultivo.
3. Marca con lápiz de cera los portaobjetos y coloca en el centro una gota de lactó
fenol azul de algodón.
4. Haz una suspensión con un poquito del micelio revolviendo exhaustivamente para
separarlo.
5. Coloca un cubreobjeto.
6. Observa con objetivos 10X y 40X.
7. Realiza los dibujos de las estructuras que observes.
8. Compara tus dibujos con los esquemas anexos.
9. Repite el procedimiento para la levadura, pero tiñendo con Gram.
10. Dibuja y describe los resultados

SEGUNDA SESIÓN
IMPORTANTE.
2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos que sembraste en la
primera sesión y el mechero de bunsen.
3. Describe la morfología colonial de los hongos, intercambiándolos las cepas entre los
equipos.
4. Describe las características conforme se pide en la tabla 2.
Tabla 2. Características a evaluar de la morfología colonial de los hongos.

Tamaño Aspecto Color del micelio Color del Producción y
aéreo micelio color del
vegetativo pigmento
difusible
Mide en cm, Observa la superficie Observa los cambios Observa el grueso Observa si existe
el diámetro del hongo, que puede de color y descríbelos del agar y algún cambio de
de la colonia ser: Algodonoso, partiendo del centro a describe el color color en el medio
fungal. aterciopelado, la periferia. del crecimiento de cultivo
granuloso o fungal. original.
pulvurulento.
5. Realiza preparaciones en fresco de los dos hongos filamentosos seleccionados.
6. Coloca un poco de micelio aéreo en un portaobjetos que contenga una gota de lactó
fenol azul de algodón.
7. Dispersa el micelio en el colorante.
8. Cubre la preparación con un cubreobjetos.
9. Observa la preparación al microscopio usando objetivos seco débil y seco fuerte.
10. Describe la morfología microscópica considerando las características mostradas en la
tabla 3 y compara con las figuras 13 y 14.
Tabla 3. Morfología microscópica de hongos.

Diámetro de micelio Tipo de micelio
Microsifonado, macrosifonado o cenocítico. Observa las hifas. Describe si son multinucleadas,
septadas, ramificadas, pigmentadas o hialinas,

Figura 13.Tipo de esporas asexuales y estructuras reproductoras de hongos.
Fuente: Koneman et. al (1997)
Figura 14. Tipos de Hifas
Fuente: Koneman et. al (1997)
 Fan S. 2013. American Society for Microbiology (ASM), Microbellibrary.org
consultado en: http://microbelibrary.org/library/laboratory-test/3088-elisa


=false
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.
 Johnson T. And Case C. Laboratory experiments in Microbiology. 3th edition.
Benjamín Cummings. 1992.

AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGÍA COLONIAL
I. RESULTADOS
PRIMERA SESIÓN
1) Realiza los dibujos de los hongos de la primera sesión, tal como se observan en
las cajas de petri
HONGO 1 HONGO 2 LEVADURA
2) Realiza los dibujos de las observaciones microscópicas de la primera sesión
10X 10X 10X
40X 40X 40X
HONGO 1 HONGO 2 LEVADURA

SEGUNDA SESIÓN
I. Registra las características de la morfología colonial de los hongos que

sembraste.
Característica Hongo 1 Hongo 2

Tamaño (cm)
Aspecto
Color de micelio aéreo
Color de micelio
vegetativo
Producción de
pigmento difusible
Característica Levadura
Tamaño
Color
Forma
Elevación
Bordes
Superficie
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
Tinción de Gram
Confirmación de Gram
2. Describe la morfología microscópica considerando las siguientes características

y compara tus dibujos con los esquemas anexos.
Característica Hongo 1 Hongo 2

Diámetro del micelio (mm)
Tipo de micelio (macro-micro sifonado)
Hifas (hialinas, cenocíticas, segmentadas,

ramificadas, multinucleadas, etc.)
Observación microscópica con objetivo 100 X
LEVADURA: _____________________________________
Forma: _____________________________________
Agrupación: _____________________________________
T. Gram: _____________________________________

3. Con las características observadas, trata de identificar al menos el género de los
hongos con que trabajaste en la práctica
HONGO 1 ______________________________________________________________
HONGO 2 ______________________________________________________________
LEVADURA ______________________________________________________________
II. ASIGNACIÓN
Investigar en diferentes fuentes de información las características macroscópicas y

microscópicas de los microorganismos con los que se realizó la práctica.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Dirigirla hacia las formas de cultivo para hongos, formas de identificación y la importancia
que estos tienen en la medicina veterinaria. Compara la morfología obtenida con lo
investigado y define los posibles géneros fúngicos analizados.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
________________________________________________________________________
______________________________________________________________________

PRÁCTICA 12
COLECCIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO
INTRODUCCIÓN
La bacteriología y micología clínicas se encargan del estudio de las muestras de
pacientes de los cuales se sospecha una enfermedad infecciosa. El laboratorio de
bacteriología y micología veterinaria puede apoyar al médico veterinario de la siguiente
manera:
 Confirma el diagnóstico presuntivo
 Sugiere la quimioterapia de la enfermedad
 Colabora en el conocimiento epidemiológico de las enfermedades
 Permite la elaboración de productos biológicos como las bacterinas
Los resultados del examen bacteriológico y micológico, así como la rapidez con que éstos
sean obtenidos, no dependen solo de los métodos de laboratorio empleados, sino
también de la forma en que sean colectadas y enviadas las muestras clínicas. Dichos
resultados pueden verse influenciados por la presencia de microorganismos que son
parte de la flora microbiana normal, por la migración bacteriana post-mortem o por la
aplicación de antimicrobianos antes del envío de la muestra. El médico debe tener en
mente estos factores para realizar la interpretación de los resultados obtenidos por el
laboratorio.
Los problemas que con mayor frecuencia se presentan en la identificación bacteriana y
micológica en el laboratorio son:
 Envío de muestras no representativas de la enfermedad en cuestión
 Toma de muestras sin asepsia
 Envío de muestras en condiciones inadecuadas
 Falta de historia clínica completa y de un diagnóstico presuntivo
Por lo tanto, es indispensable tener conocimientos previos sobre la correcta obtención y

envío de muestras al laboratorio. A continuación se enlistan algunas normas generales:
1. Tomar la muestra del sitio anatómico más representativo del problema, de
preferencia en la etapa aguda de la enfermedad.

2. Las muestras obtenidas a partir de animales muertos deberán tomarse dentro de
las tres primeras horas de ocurrida la muerte o sacrificio.
3. Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de asepsia. Tanto el
material de colección como el recipiente en que la muestra sea transportada
deberán ser estériles. Este último preferentemente debe tener un tapón de rosca.
4. Los especímenes colectados no deben entrar en contacto con desinfectantes.
5. Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza, edad,
sexo, arete o nombre del animal, así como la dirección, teléfono y nombre
del propietario.
6. Una vez colectadas las muestras deben enviarse al laboratorio dentro de las
siguientes 4-24 hrs, en hielo o congelantes, en cajas de poliuretano.
7. Cuando sea necesario el uso de hisopos para la colección de muestras, estas
deben enviarse en medio de transporte (Stuart, Cary-Blair, etc).
8. Debe de anexarse la historia clínica completa que incluya: la hora de
colección de la muestra, hora de la muerte del animal (si es el caso), número
de animales infectados, signos y lesiones que presenta el animal; además si
el animal del que proviene la muestra fue tratado con antimicrobianos (cuál)
y el diagnóstico presuntivo.
9. Es muy importante hacer notar que el manejo de las muestras debe realizarse con
precaución, ya que algunos agentes causantes de las enfermedades infecciosas
de los animales, constituyen un riesgo para la salud humana.
COMPETENCIA: Los alumnos desarrollarán las habilidades necesarias para seleccionar

los procedimientos más adecuados de la toma y envío de muestras al laboratorio de
diagnóstico bacteriológico.
MATERIALES
Tubos con medio de transporte Stuart
Hisopos estériles
Jeringas desechables estériles
Bolsas de plástico estériles
Recipiente estéril para muestra de orina
Guantes de látex

MÉTODO
PRIMER SESIÓN
1. Leer con en forma grupal las consideraciones generales de toma y envío de
muestra.
2. Elaborar un tema de exposición por equipo según lo asignado por el maestro. La
presentación deberá incluir: Tipo de muestra, material de muestreo, medidas de
seguridad, manejo del animal, procedimiento paso a paso de la toma de muestra y
las condiciones de transporte y envío de la muestras.
SEGUNDA SESIÓN
3. Realizar la presentación en equipo.
4. Asignación a cada equipo el tipo de muestra que deberá traer para la realización
de la siguiente práctica.
5. Seguir las condiciones ideales para la colección y transportación correcta de la
muestra asignada por el maestro, la cual es indispensable que provenga de un
animal enfermo.
Para realizar práctica 13: análisis bacteriológico de procesos biogénicos

- Muestra 1: Pus, abscesos, exudado de heridas, hisopos nasales, hisopos
auditivos, exudados faríngeos, según lo asignado por el maestro.
Para realizar práctica 14: análisis bacteriológicos de heces y orina
- Muestra 2: Orina o heces de cerdo, bovino o equino según lo asignado por el
maestro
Para realizar práctica 15: análisis bacteriológico de órganos
- Muestra 3: Órganos afectados con lesiones visibles de la especie animal asignada
por el maestro tales como: Corazón, Riñón, Pulmón, Intestino, Hígado,
Bazo, Linfonódulos o Cerebro.
Nota: Las muestras corresponderán a la solicitada por el maestro en el tiempo

indicado para realización de cada una de las prácticas 13,14 y 15.

 NATIONAL VETERINARY SERVICES LABORATORIES (2006). Procedures for
Collection and Submission of Specimens. National Veterinary Services
Laboratories, Ames, Iowa, USA. Consultado en:
http://www.aphis.usda.gov/vs/nvsl/html/shipping.html
 OIE. (2008) Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008. Consultado en:
http://web.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es_2008/1.01.01.%20Recogida%20y%
20env%C3%ADo%20de%20muestras.pdf
=false
 VETERINARY LABORATORIES AGENCY (2003). Submission of Samples to the
Veterinary Laboratories Agency. Veterinary Laboratories Agency, New Haw,

Addleston, Surrey, United Kingdom, 27 pp. consultado en:
www.vla.gov.uk/servtovet/documents/Submissions.pdf
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

COLECCIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS A LABORATORIO
I. RESULTADOS
Completar el formato de recepción de casos clínicos del laboratorio de diagnóstico que

incluye datos generales del cliente, historia clínica y el diagnóstico presuntivo con la
información requerida.
1. Realice esquemas de la tinción de Gram del frotis tomado directamente de muestra.
2. Enliste los materiales utilizados para la toma y envío de muestras.
MATERIALES MATERIALES MATERIALES

PARA LA TOMA DE PARA EL ENVÍO DE MUESTRA DE BIOSEGURIDAD
MUESTRA

3. Realice el llenado de formatos de registro de muestra.

II. ASIGNACIÓN
1. Entregar una secuencia fotográfica numerada e impresa de los pasos de la toma de
muestra, con una breve descripción al pie de cada figura.
________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
2. Investigar las precauciones y medidas de seguridad que deben adoptarse para la toma
de muestra asignada por el maestro.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Dirigida a las medidas de bioseguridad y el riesgo del médico veterinario para adquirir
enfermedades zoonóticas. Se deben consultar al menos dos autores y citarse en el texto
de la discusión.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
Usar formato APA. Se deben reportar al menos tres autores y deben estar referenciados
en el texto de la discusión.
________________________________________________________________________
______________________________________________________________________

PRÁCTICA 13
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE PROCESOS PIOGÉNICOS
INTRODUCCIÓN
El estudio de la microflora normal o patógena de los animales o humanos, requiere de

conocimientos previos sobre toma y envío de muestras al laboratorio, tipos de medios de
transporte y de aislamiento de microorganismos, así como de antecedentes propios de
los microorganismos que se deben estudiar. Para esta práctica se han seleccionado
algunos productos biológicos a estudiar y se hace referencia a los posibles
microorganismos involucrados en procesos infecciosos.
Procesos piogénicos: Son aquellas infecciones asociadas a microorganismos que

estimulan la formación de pus, que se forma por la acumulación de leucocitos y restos del
microorganismo. Dentro de los procesos infecciosos quedan incluidos los abscesos que
son una forma de inflamación localizada y llena de pus, la mayoría están rodeadas de
tejido conectivo, capilares proliferantes y leucocitos. Las manifestaciones clínicas
asociadas a la presencia de abscesos dependen de su localización y etiología. Hay
abscesos que no son detectados, sino hasta el momento de la necropsia, por ejemplo:
abscesos hepáticos, cervicales, etc. Mientras que otros producen un malestar
generalizado en el animal, como los abscesos en la cavidad oral, pulmón, etc.
La etiología de los procesos piogénicos puede ser muy variada, sin embargo, la más
común es la bacteriana. Entre los microorganismos piogénicos más comunes se
encuentran:
Aerobios y facultativos Anaerobios

Staphylococus aureus Actinomyces spp.
Streptococcus spp Fusobacterium necrophorum
Corynebacterium spp. Clostridium perfringens
Pseudomonas aeruginosa Peptococcus spp.
Escherichia coli Peptostreptococcus spp.

Proteus spp. Propionibacterium spp.
Pasteurella multocida Bacteroides spp.
Eubacterium spp
COMPETENCIA: El alumno enviará correctamente una muestra de un proceso piogénico,

para su estudio y seleccionará los materiales necesarios para el aislamiento e
identificación de un posible agente patógeno.
MATERIALES
Hisopos estériles Placas con agar sal manitol
Microscopio Placas con agar sangre
Asa bacteriológica Pruebas bioquímicas para Gram (-)
Mechero de Bunsen Agar TSI o Kliger
Puente de tinción Agar urea de Christensen
Portaobjetos Agar citrato de Simons
Jeringa desechable Medio SIM
Bolsas de plástico Prueba de oxidasa
Encendedor de piedra Reactivo de Kovacs
Regla Hidróxido de potasio al 3 %
Tubos de solución salina fisiológica Reactivo de rojo de metilo
Tubo 0.5 de serie de MacFarland Agua destilada
Peróxido de hidrógeno al 3%
Colorantes para t. De Gram Pruebas bioquímicas para Gram (+)
Sensidiscos para Gram + y – Prueba de oxidasa
Agar Mueller Hinton Caldo urea o agar urea de Christensen
Pinzas y tijeras para flamear Cloruro de sodio al 6.5%
Alcohol al 70% Caldo sangre
Papel Kraft

MÉTODO
A) Muestra de proceso piogénico
Primera sesión
 Con un hisopo estéril toma la muestra y deposítala en el primer cuadrante de cada
una de las placas de agar sangre y agar sal y manitol.
 Con el asa bacteriológica, completa la siembra aislando por estría cruzada e
incuba las placas a 37º C durante 24 - 48 horas.
Segunda sesión
 Describe en cada placa, la morfología colonial de aquellas que sospeches sean
causantes del proceso infeccioso.
NOTA: Considera a las colonias predominantes de un solo tipo.
 Realiza un frotis de cada colonia y tíñelos por Gram.
 Si son bacterias Gram negativas, siembra las pruebas bioquímicas
correspondinetes e incúbalas por 24 hrs a 37 °C, si no hay cambios espera hasta
72 hrs.
 Realiza un antibiograma.
 Si son bacterias Gram positivas realiza las pruebas bioquímicas
correspondientes e incúbalas por 24 hrs a 37 °C, si no hay cambios espera hasta
72 hrs.
 Realiza un antibiograma.
Tercera sesión
 Interpreta junto con el profesor los resultados de las pruebas bioquímicas y del
antibiograma.
 Con la ayuda de tu maestro y la búsqueda bibliográfica de tablas de interpretación
bioquímica, identifica el microorganismo aislado y su sensibilidad a los
antimicrobianos

13, sigue lo indicado en el mismo para la elaboración de tu reporte. No olvides
anexar los formatos de muestra que incluyen: los datos generales, historial clínico
y diagnóstico presuntivo al reporte antes de su entrega.
Conacyt, 2015.
 Gyles, C. L. (n.d). Pathogenesis of bacterial infections in animals. Estados Unidos :
Blackwell Publishing, 2010
 Gyles, C. L., Prescott, J.F., Songer, G. and Thoen, C.O. (n.d). Pathogenesis of
bacterial infections in animals.4th edition. USA. BLACKWELL PUBLISHING 2004.

2013.

 Quinn, P.J. Markey, B.K. (2004). Microbiología y Enfermedades Infecciosas
Veterinarias. Editorial Acribia, S.A. 1ª Edición. España

=false
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE PROCESOS PIOGÉNICOS
I. RESULTADOS
Complete el formato de recepción de casos clínicos del laboratorio de diagnóstico que


1. Realice esquemas de la tinción de Gram del frotis tomado directamente de muestra.
2. Dibuje la morfología microscópica de las bacterias seleccionadas y aisladas en cultivo

puro.
Bacteria 1: ___________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Medio de cultivo: Agar Sangre
Bacteria 2: ___________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Medio de cultivo: Agar Sal y Manitol
3. Describa la colonia seleccionada de cada uno de los medios de cultivo.
CARACTERÍSTICA Colonia 1 Colonia 2

Agar sangre Agar Sal y manitol
Tamaño
Color
Forma
Elevación
Bordes
Superficie
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia

4. Registre los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas para su interpretación.
REACCIÓN BACTERIA 1 BACTERIA 2

Gram
Tubo de TSI
Producción de gas
Tubo de SIM
Producción de indól
Movilidad
Producción de ureasa
Prueba de Voges-Proskauer
Forma
Agrupación
Prueba de catalasa
Prueba de coagulasa
Género y especie
5. Registre la lectura e interpretación de la sensibilidad a los antibióticos sobre la cepa

identificada.

II. ASIGNACIÓN.
Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluyendo la descripción de

la enfermedad, especies afectadas, modo de transmisión y tratamiento.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2. Investiga la sensibilidad de la bacteria identificada.

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Dirigida a las enfermedades y características del agente etiológico aislado, compara lo

investigado con tus resultados, discute si confirmaste tu diagnóstico presuntivo y de
acuerdo a la sensibilidad del microorganismo que antimicrobiano emplearías y porque.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFIA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 14
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE HECES Y ORINA
INTRODUCCIÓN
Muestras de orina: Las infecciones urinarias se diagnostican frecuentemente en los

perros. Estas se presentan también en otras especies, pero por lo general no se envían
muestras al laboratorio de estos animales. Algunos de los microorganismos que causan
infecciones en los perros, pueden producirlas también en otras especies de animales
domésticos. Ejemplos:
Perro Bovinos Porcinos
Proteus mirabilis Corynebacterium renale Eubacterium suis
Pseudomonas aeruginosa C.renale
Staphylococcus aureus
Enterococcus
Escherichia coli
Enterobacter spp.
Streptococcus pyogenes
Streptococcus viridans
Corynebaterium renale
Las infecciones urinarias causadas por bacterias del género Leptospira, son por lo
general enfermedades primarias de los animales, que en ocasiones pueden transmitirse
al hombre. Algunas especies o serotipos importantes son:
Leptospira icterohemorragiae Rata, ratones.

L. canicola Perros, bovinos, porcinos, zorrillos, chacales.
L. pomona Bovinos, porcinos, zorrillos, mapaches, gato montes.
L. grippotyphosa Mapache, ratón, zorro, ardilla, conejo.
L. hardjo Bovinos.

El hombre puede adquirir la enfermedad a partir de animales infectados y aguas
contaminadas. Los veterinarios y empleados del rastro se encuentran sujetos a mayor
riesgo de adquirir la infección.
Para obtener muestras de orina se recomienda tomar en cuenta varias condiciones de

bioseguridad como son el uso de bata abotonada, guantes, lentes y cubrebocas. Se
puede realizar la punción de vejiga, la cateterización de la uretra o durante la micción.
Para la obtención de las muestras del tracto reproductor se pueden usar hisopos estériles
para el útero, cuello o vagina y de semen en caso de machos, enviándolas en un medio
líquido o en un medio de transporte. Las muestras de orina y de semen deben
conservarse en refrigeración.
Muestras de heces: Cuando existe una infección bacteriana del intestino, una de las
primeras manifestaciones clínicas es la diarrea y ocasionalmente otros signos como
deshidratación, dolor abdominal, septicemia, toxemia y fiebre dependiendo del agente
etiológico, además de la edad, la especie del animal y la resistencia individual. De
acuerdo con la presentación en el animal, la enteritis puede ser aguda o crónica. En la
enteritis aguda, la diarrea se presenta súbitamente, las heces son blandas y líquidas con
olor desagradable y en algunos casos con moco o sangre abundante. La coloración es
variable dependiendo del agente etiológico. A este tipo de diarreas se asocian las
siguientes bacterias:
Escherichia coli Salmonella spp.
Serratia spp. Serpulina hyodisenteriae
Clostridium spp. Candida spp.
Actinobacillus spp. Campylobacter spp.
En la enteritis crónica, la diarrea se caracteriza por ser de consistencia blanda, con o sin
presencia de moco y por lo general su olor es normal. La pérdida progresiva de peso y la
emaciación son frecuentes y generalmente no hay anormalidades sistémicas. A estas
diarreas se asocian las siguientes bacterias:
Mycobacterium paratuberculosis Proteus spp.
Pseudomonas Candida spp.
Salmonella spp.

El diagnóstico de los problemas entéricos incluye el análisis por parte del médico
veterinario de los cambios patológicos funcionales en los animales, así como problemas
de higiene en el manejo de excretas, agua y alimentos como posibles fuentes de
contaminación, y del análisis bacteriológico para determinar el agente infeccioso
involucrado, con el fin de establecer un control epidemiológico y evitar pérdidas
económicas.
COMPETENCIA: El alumno una vez colectada la muestra, la transportará al laboratorio,

para llevar a cabo el aislamiento e identificación de un posible agente patógeno y
determinará su sensibilidad a antimicrobianos.
Es indispensable que las muestras provengan de un animal enfermo, la muestra de

orina debe ser turbia o sanguinolenta y las heces deben ser diarreicas.
MATERIALES
Hisopos estériles Placas con agar verde brillante
Microscopio Placas con agar MacConkey
Asa bacteriológica Placas con agar sangre
Mechero de Bunsen Placas con agar Mueller-Hinton
Tubos con caldo lactosado
Puente de tinción Tubos con caldo selenito
Portaobjetos Pruebas bioquímicas para Gram (-)
Encendedor de piedra Agar TSI o Kliger
Agar urea de Christensen
Agua destilada Agar citrato de Simons
Prueba de oxidasa Medio SIM
Peróxido de hidrógeno al 3% Reactivo de Kovacs
Hidróxido de potasio al 3% Reactivo de rojo de metilo
Colorantes para Tinción de Gram Pruebas bioquímicas para Gram (+)
Sensidiscos para Gram + y – Caldo sangre
Frascos de vidrio Caldo urea o agar urea de Christensen
Pinzas para flamear Cloruro de sodio al 6.5%
Alcohol al 70% Carbohidratos, etc.

MÉTODO
1) Muestras de orina
Primera sesión
1. Usando una pipeta Pasteur estéril, inocula aproximadamente 1 ml de orina en un
tubo con caldo lactosado e incuba a 37 ºC durante 18 - 24 horas. Del crecimiento
obtenido, siembra una placa con agar verde brillante e incuba a 37 ºC durante 18 -
24 horas.
2. Siembra con el asa 2 o 3 gotas de orina en una placa de agar sangre y aísla por
estría cruzada. Incuba la placa a 37 ºC por 24 - 48 horas.
Segunda sesión
3. Describe la morfología colonial de al menos una colonia de las aisladas en las
placas de agar sangre y verde brillante, haga los frotis respectivos y tíñelos por la
técnica de Gram para describir la morfología microscópica.
4. Los aislamientos que resultaron, siémbralos en los tubos para las pruebas
bioquímicas correspondientes.
Tercera sesión
5. Lee e interpreta los resultados de las pruebas bioquímicas y con apoyo del
maestro, identifica a nivel género tus aislamientos.
6. De las bacterias identificadas, selecciona una y siembra una placa de agar para
realizar el antibiograma.
7. Interpreta tus resultados a las 24 hrs.
2. Muestras de heces
Primera sesión
1. Siembra una asada de la muestra en una placa de agar Mac Conkey y aísla por
estría cruzada. Incuba la placa a 37º C durante 24-48 horas.
2. Inocula aproximadamente 0.5 g de la muestra en el tubo con caldo selenito e
Incuba a 37º C durante 18-24 horas y subcultiva en el medio de verde brillante
sembrando por estría cruzada e incuba a 37º C durante 24 horas.

Segunda sesión
3. Describe el crecimiento microbiano en ambos medios de cultivo, selecciona una
colonia de cada placa y anota las características de la morfología microscópica de
las colonias sembradas. Realiza un frotis y tiñérlo con Gram, siembra las pruebas
bioquímicas correspondientes.
Tercera sesión
4. Lee e interpreta los resultados de las pruebas bioquímicas y con apoyo del
maestro, identifica a nivel género tus aislamientos.
5. De las bacterias identificadas, selecciona una y siembra una placa de agar para
realizar el antibiograma.
6. Interpreta tus resultados a las 24 hrs.

Conacyt, 2015.

2013.


Veterinarias. Editorial Acribia, S.A. 1ª Edición. España.
 OMS (2005). Manual de Bioseguridad en el laboratorio. 3ra edición. OMS.
Ginebra, Suiza. 2005. Consultado en:
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11
SP.pdf?ua=1
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE HECES Y ORINA
I. RESULTADOS

1. Realice esquemas de la tinción de Gram del frotis elaborados.
Bacteria 1: ___________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Bacteria 2: ___________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Medio de cultivo: Agar Verde Brillante

CARACTERÍSTICA COLONIA 1 COLONIA 2
Agar sangre Agar Verde Brillante
Tamaño
Color
Forma
Elevación
Bordes
Superficie
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
Tinción de Gram
3. Registre los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas para su interpretación.

Tubo de TSI
Producción de gas
Tubo de SIM
Producción de indól
Movilidad
Forma
Agrupación
Prueba de catalasa
Prueba de coagulasa
Género y especie

4. Registra la lectura e interpretación de la sensibilidad a los antibióticos sobre la cepa
identificada.

II. ASIGNACIÓN

________________________________________________________________________
______________________________________________________________________

________________________________________________________________________
______________________________________________________________________

IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFIA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 15
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE ÓRGANOS
INTRODUCCIÓN
El análisis bacteriológico de órganos está recomendado cuando se sospecha de muertes

por septicemia o por el hallazgo de lesiones macroscópicas en uno o varios órganos
específicamente relacionados con alguna enfermedad. Ejemplo: en las neumonías
(pulmón), enteritis (intestino), abortos (órganos fetales), encefalitis (cerebro), etc. La
elección de las muestras dependerá de la experiencia del clínico, del diagnóstico
presuntivo y de los hallazgos a la necropsia.
El análisis bacteriológico y micológico constituye en estos casos un apoyo en el

diagnóstico definitivo. Los siguientes son algunos ejemplos de microorganismos
típicamente asociados a septicemias:
Brucella spp Erysipelothix spp. Leptospira spp.

Haemophilus spp. Pasteurella spp. Bacillus anthracis
Clostridium spp. Pseudomonas spp. Listeria monocytogenes
Campylobacter spp. Salmonella spp. Escherichia coli
Criptococcus spp. Leccidioides spp. Histoplasma spp
Blastomyces spp.
COMPETENCIA: El alumno enviará una muestra de órganos afectados

correctamente al laboratorio, y llevará a cabo la identificación del agente bacteriano, así
como la prueba de sensibilidad a antimicrobianos.
MATERIALES
Placas con agar sangre Placas con agar sal y manitol
Placas con agar verde brillante Placas con agar Mac Conkey
Tubos con medio de transporte Stuart Placas de Microscan para Gram positivos
Placas de Microscan para Gram negativos. Alcohol de caña al 70 %.

Equipo de tinción de Gram Mechero de Bunsen
Asa bacteriológica Hisopos estériles
Microscopio Pinzas y tijeras de disección
Muestra de órganos Puente de tinción
Aceite de inmersión Portaobjetos
Papel aluminio Papel Kraft
Vaso de precipitado de 250 ml Tripié
Malla de asbesto Guante de asbesto
Espátula Pizeta con desinfectante
MÉTODO
En esta práctica se analizarán las muestras asignadas a cada equipo en la práctica

anterior, de igual manera deberán haber tomado y transportado correctamente al
laboratorio.
Muestras de órganos
Primera sesión
1. Deposita la muestra sobre un papel limpio y esteriliza la superficie utilizando
cualquiera de los siguientes métodos:
a) Con pinzas estériles toma el fragmento de órgano y humedécelo con
alcohol, flaméalo rápidamente y deposítalo en una caja estéril.
b) Calienta la espátula en el mechero de Bunsen y quemar la superficie del
órgano.
c) En el caso de órganos muy pequeños, se recomienda introducir la muestra
en un recipiente con agua hirviendo durante 2 o 3 segundos.
2. Con instrumental estéril (previamente flameado), corta un trozo de la muestra a
través de la superficie que fue previamente descontaminada.
3. Con pinzas estériles toma el trozo de tejido por la parte externa y frota con la cara
interna el primer cuadrante de la caja con agar sangre, y con el asa bacteriológica
completa la técnica de aislamiento por estría cruzada.
4. Incuba los medios de cultivo a 37 ºC durante 24 horas.

NOTA: EN TIEMPO EXTRACLASE
Seleccionar una colonia predominante de cada placa, realiza las tinciones de Gram que
sean necesarias para asegurar una colonia pura para la siguiente sesión. Realiza la
resiembra de las colonias puras en agar Mac Conkey o Agar sangre, según corresponda.
Segunda sesión
- Realiza una tinción de Gram de las colonias predominantes aisladas del agar Mac
Conkey y/o agar sangre
- Describe la morfología microscópica y colonial de las colonias puras aisladas en
agar Mac Conkey y/o sangre.
- Inocula e incuba las placas del sistema MICROSCAN con las bacterias aisladas:
1. Con el asa de plástico desechable tocar 3 o 4 colonias aisladas, cuidando de
no perforar o rayar el agar.
2. Retirar el exceso de muestra desprendiendo del asa el cilindro unido a ella.
3. Abrir un frasco del diluyente e insertar el asa con la muestra en él.
4. Agitarlo vigorosamente de 8 a 10 veces, o hasta suspender la bacteria en la
solución.
5. Vaciar la suspensión bacteriana en la placa acanalada.
6. Colocar la tapa que tiene las puntas para extracción de la suspensión
bacteriana.
7. Fijar la micropipeta múltiple a la tapa.
8. Llevar a cabo la extracción de la suspensión bacteriana.
9. Retirar la placa a inocular de su envoltura.
10. Realizar la descarga de la suspensión bacteriana y retirar la tapa y la
micropipeta
11. En la placa inoculada existen algunos pocillos cuyos nombres se encuentran
subrayados, a los cuales se les adicionaran tres gotas de aceite mineral a cada
uno.
12. Colocar una tapadera e incubar a 37° C por 24 hrs.

Tercera sesión
- Revela las reacciones bioquímicas de las placas de MicroScan.
- Para realizar la lectura, es necesario adicionar algunos reactivos en pocillos
específicos, indicados en la tabla de interpretación.
PARA GRAM NEGATIVOS

- Adicionar al pozo IND 3 gotas de reactivo de Kovacs
- Adicionar al pozo VP 1 gota de KOH y 1 gota de alfa-naftol
- Adicionar al pozo TDA 1 gota de Cloruro férrico
- Adicionar al pozo NIT 1 gota de ácido sulfanílico y 1 gota de N,N-dimetil
- Realizar la prueba de oxidasa a la bacteria en una tira reactiva
PARA GRAM POSITIVOS

- Adicionar al pozo NIT 1 gota de ácido sulfanílico y 1 gota de N,N-dimetil
- Adicionar al pozo VP 1 gota de KOH y 1 gota de alfa-naftol
- Adicionar al pozo PYR 2 gotas de peptidasa
- Comprobar la hemólisis de la bacteria
- Lee los resultados de las placas con ayuda del profesor e introduce la información
en el sistema LABPRO para identificar al menos a nivel de género los
aislamientos bacterianos.


Conacyt, 2015.
 Gobernado M. y López-Hontangas J.L. (2003) Identificación bacteriana. Enferm
Infecc Microbiol Clin 2003;21(Supl. 2):54-60.España. Consultado en:
http://www.elsevier.es el 10/01/2017.
 Organización Panamericana de la Salud. (2011). Guía para el uso correcto de los
equipos automatizados para identificación bacteriana y su correspondiente prueba
de susceptibilidad. Washington, D. C.: OPS, © 2011. consultado en:
http://new.paho.org/hq/dmdocuments/2011/Guia_inside_LR.pdf

Veterinarias. Editorial Acribia, S.A. 1ª Edición. España.

A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE ÓRGANOS
I. RESULTADOS

1. Realice esquemas de la tinción de Gram del frotis elaborados.
Colonia 1: ________________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Colonia 2: ________________________________
Forma:___________________________________
Agrupación:_______________________________
Reacción de Gram:_________________________
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey

CARACTERÍSTICA COLONIA 1 COLONIA 2
Agar sangre Agar Mac Conkey
Tamaño
Color
Forma
Elevación
Bordes
Superficie
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
Tinción de Gram
3. Identifique las reacciones positivas de la placa inoculada de MicroScan comparándola

con la tabla indicadora del sistema.
Gram
Tubo de TSI
Producción de gas
Tubo de SIM
Producción de indol
Movilidad
Forma
Agrupación
Prueba de catalasa
Prueba de coagulasa
Género y especie

4. Dibuje o fotocopie el resultado de revelación de placa de MicroScan.
5. Registra el resultado proveniente de la lectura e interpretación del Género y especie

identificada así como la sensibilidad a los antimicrobianos arrojados por el sistema
MicroScan.
Género, especie: _________________________________________________________
Sensibilidad a antimicrobianos:

II. ASIGNACIÓN

________________________________________________________________________
______________________________________________________________________

________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFIA
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

PRÁCTICA 16
MECANISMOS DE PATOGENICIDAD
INTRODUCCIÓN
Para que se pueda mantener la condición de salud de un huésped, las defensas del
organismo deben ser capaces de controlar los mecanismos de patogenicidad de los
microorganismos que ingresan al mismo. Se entiende por patogenicidad a la capacidad
de un organismo parásito de causarle daño al huésped, mientras que virulencia es el
grado de patogenicidad. La infección es la invasión o colonización del organismo por
parte de microorganismos patógenos lo cual puede producir o no daño al huésped,
mientras que la enfermedad se presenta cuando el huésped es dañado de alguna forma
por la presencia del agente infeccioso. La probabilidad que la infección por un patógeno
dé origen a una enfermedad depende del grado de virulencia, del número de gérmenes
patógenos que infecten el huésped y de la resistencia del huésped.
Una vez que las bacterias son transmitidas hasta un huésped susceptible, para que
puedan causar una enfermedad, deben ingresar al huésped, adherirse a sus tejidos,
penetrar o evadir sus defensas y causar daño tisular, para ello pueden emplear dos
mecanismos básicos: 1) Invasión a los tejidos (invasividad) y 2) Producción de toxinas
(toxigenicidad).
La sobrevivencia del patógeno en el huésped, también depende del tipo de parásito: Los
parásitos extracelulares son aquellos que son destruidos rápidamente luego de ser
fagocitados, por lo tanto ellos dañan los tejidos el tiempo que permanecen fuera de los
fagocitos. Usualmente producen enfermedades agudas de duración relativamente corta.
Por ejemplo, Streptococcus pneumoniae que produce la neumonía neumocócica. Los
parásitos intracelulares se pueden multiplicar dentro de las células fagocitarias y dan
origen generalmente a enfermedades crónicas Ej. Mycobacterium tuberculosis que causa
la tuberculosis. Las bacterias parásitas extracelulares deben su virulencia a componentes
antifagocitarios (cápsula) que tienen en su superficie. Ej. Streptococcus pneumoniae.

Las propiedades invasoras de algunas bacterias son atribuidas a la elaboración de
enzimas extracelulares que desempeñan un papel importante en los procesos
infecciosos. Ejemplos: Hialurinidasa, coagulasa, Estreptoquinasa y estafiloquinasa
colaginasa y las leucocidinas algunas presentes en géneros como Streptococcus y
Staphylococcus.
Las propiedades toxigénicas se deben a la producción de toxinas bacterianas, las cuales

pueden ser agrupadas como endotoxina (producidas principalmente por bacterias Gram
negativas) o exotoxinas (producidas principalmente por bacterias Gram positivas). Las
exotoxinas presentan elevada antigenicidad y toxicidad, mientras que en las endotoxinas
ambas características son bajas.
Finalmente los mecanismos de patogenicidad que posee una bacteria son determinantes
para evaluar su virulencia en un organismo animal, por lo que es importante conocer
cuáles son los que están presentes en el género aislado a partir de una muestra de un
animal enfermo.
COMPETENCIA
Los alumnos adquirirán los conocimientos y habilidades para hacer uso de una técnica
especializada para el diagnóstico bacteriano e identificación de factores de virulencia.
MATERIALES
Lector de inmunoensayo (Lector de absorbancia de placa de microtítulo)
Computadora con software xCHECK plus de IDEXX
Sistema de lavado semiautomático en columna (Semi-automated systems)
Estufa de incubación (+/- 10 °C- 37°C)
Vórtex marca Stuart Vórtex mixer (agitador orbital de placas)
Potenciómetro
Reloj de laboratorio (timer)
Viales criogénicos (no poliestireno) crioviales c/tapa eppendorf de 1.5 ml y 2 ml
Tubo vacutainer sin anticoagulante y con atiguagulante (EDTA o Heparina)
Micropipeta Multicanal de vol variable ( de 0.5 a 10 µL; 5-50 µL; 50-250 µL; 1-20 µL; 10-
100 µL; 50-300µL; 200-1000 µL)

Micropipeta Monocanal de vol variable (0.5-10 µl; 5-50 µl; 1-20 µl; 10-100 µl; 200-1000 µl)
Puntillas para micropipetas (paquete de 500 piezas)
Rack para crioviales eppendorf
Rack para puntillas universales de 5-10 µL
Placas profundas (canaletas para multicanal) para diluir sueros (300 microlitros)
Dispensor semiautomático multicanal (8-12 pozos)
Placas de poliestireno fondo plano de 96 pocillos NUNC 2-69620
Selladores de placa
Tubo SARSTEDT 50 ml graduado
Gradilla de plástico múltiple
Guantes y cubrebocas 3M N100 para pesar ABTS
Lentes de protección
Vasos de precipitado
Aluminio o lámina adhesiva para cubrir la placa de prueba
Agua destilada
Hisopos estériles
Jeringa desechable
Bolsas de plástico
Reactivos:
Kit prueba IDEXX SE Ab Ref: 99-08701 para Salmonella enteritidis. (5 placas tapizadas)
Kit prueba IDEXX M. bovis Ab test Ref: 99-29853 para Mycobacterium bovis (5 placas
tapizadas)
Kit prueba IDEXX pp-ApXIV Ab Ref: 99-41189 para Actinobacillus pleuroneumoniae (5
placas tapizadas)
kit ELISA flocktype Salmonella Ab (5 placas tapizadas) (Para 96 reacciones: 2 placas de
prueba (tiras), tampón de lavado, diluyente de muestras, control positivo, control negativo,
conjugado, solución de sustrato TMB, solución de parada)

Suero control positivo y control negativo de anticuerpos:
- Anticuerpos gm (flagelina gm) de Salmonella enteritidis
- Anticuerpos Salmonella sp
- Anticuerpos Brucella ovis
- Anticuerpos Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) toxina Apxi
- Anticuerpos Mycobacterium bovis
MÉTODO
kit ELISA flocktype
Cuidados:
Los componentes del kit ELISA flocktype Salmonella Ab deben almacenarse a una
temperatura comprendida entre 2 y 8 °C y permanecen estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta. El tampón de lavado (10x) y la solución de parada
pueden almacenarse a temperatura ambiente (18-25 °C) para evitar la cristalización de
sales. Si el kit se suministra con tiras reactivas, almacene las tiras reactivas sobrantes en
la bolsa de aluminio con cierre junto con desecante a una temperatura comprendida entre
2 y 8 °C hasta el próximo uso. Las tiras reactivas pueden almacenarse durante 6
semanas como mínimo después de abrir la bolsita de las placas.
Medidas de seguridad
Utilice una bata de laboratorio adecuada, guantes desechables y gafas protectoras.
PRECAUCIÓN: la solución de parada contiene 0,5 M de ácido sulfúrico.
Todos los residuos de muestras y los objetos que han estado en contacto con las mismas
deben descontaminarse o eliminarse como material potencialmente infeccioso
Principio
La placa de prueba de microtítulo está recubierta de una mezcla de antígeno de LSP de
la salmonela. Durante la incubación de la muestra, los anticuerpos específicos de la
salmonela se unen al antígeno inmovilizado. El material sin unir se elimina mediante

aclarado. El conjugado anti-IgY con HRP detecta anticuerpos del suero unidos al
antígeno.
El conjugado sin unir se elimina mediante aclarado. Al añadir solución de sustrato se

inicia una reacción colorimétrica que se detiene trascurridos 10 minutos.
La densidad óptica (DO) se mide mediante un espectrofotómetro. Los valores de DO se
correlacionan con la concentración de anticuerpos anti-salmonela de la muestra.
Recomendaciones:
 No exponga la solución de sustrato TMB a luz intensa o a la luz solar durante la
realización de la prueba.
 Evite que los componentes del kit de prueba se contaminen o mezclen con los
componentes de otros lotes.
 No utilice los componentes del kit de prueba si están caducados.
 El agua procedente de sistemas de intercambio iónico utilizada para diluir la

solución de lavado (10x) puede interferir con el ensayo si no es lo suficientemente
pura. La calidad de agua adecuada es la correspondiente al agua doblemente
destilada o al agua de alta pureza (Milli-Q).
 A fin de obtener unos resultados precisos de la prueba, es imprescindible utilizar

dispositivos de cristal limpios, pipetear y aclarar con atención durante la prueba y
respetar de forma estricta los tiempos de incubación indicados.
Antes de comenzar
 Permita que los reactivos se equilibren a temperatura ambiente (18-25 °C)
inmediatamente antes de su uso. Si se han precipitado cristales de sal en el
tampón de lavado (10x), disuélvalos agitando suavemente y aplicando calor.
Tampón de lavado: diluya el tampón de lavado (10x) con agua destilada en una
proporción de 1:10; p. ej., para una placa de prueba, diluya 25 ml de tampón de lavado
(10x) en 225 ml de agua destilada y mezcle.

Suero/Plasma: antes del análisis de la muestra, diluya las muestras de suero/plasma con
diluyente de muestras en una proporción de 1:500 (p. ej., diluya 1 μl de muestra en 499 μl
de diluyente de muestras) y mezcle bien. Utilice tubos de plástico o placas de microtítulo
sin recubrimiento para la dilución. Cambie las puntas de las pipetas para cada muestra.
También es posible diluir las muestras de suero/plasma a partir de una predilución (1:50
en diluyente de muestras) directamente en la placa de prueba (consulte el paso 1a del
procedimiento).
Procedimiento
1. Pipetee 100 μl de cada uno de los controles listos para utilizar, control negativo y
control positivo (por duplicado), y las muestras diluidas en una proporción de 1:500, en los
pocillos de la placa de prueba.
1a. También puede pipetear 90 μl de diluyente de muestras en cada pocillo de muestra y
añadir luego 10 μl de la muestra prediluida en una proporción de 1:50. Mezcle bien.
Registre las posiciones de los controles y las muestras en un protocolo de prueba. Se
recomienda la utilización de una pipeta multicanal para la transferencia de muestras.
Cubra la placa de prueba.
2. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C).
3. Retire la solución de los pocillos mediante aspiración o golpecitos suaves.
4. Aclare cada pocillo 3 veces con 300 μl de tampón de lavado preparado. Retire el
tampón después de cada aclarado.
5. Pipetee 100 μl de conjugado listo para utilizar en cada pocillo e incube durante 30
minutos a temperatura ambiente (18-25 °C).
6. Retire la solución de los pocillos mediante aspiración o golpecitos suaves.
7. Aclare cada pocillo 3 veces con 300 μl de tampón de lavado preparado. Retire el
tampón después de cada aclarado.
8. Pipetee 100 μl de solución de sustrato TMB en cada pocillo.
9. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Comience a medir
el tiempo después de llenar el primer pocillo.
10. Detenga la reacción añadiendo 100 μl de solución a cada pocillo. Añada la solución
de parada en el mismo orden en que se añadió la solución de sustrato.
11. Mida la DO en el lector de placas a 450 nm en un periodo de 20 minutos tras la
parada de la reacción.

La medición a una longitud de onda de referencia (620-650 nm) es opcional.
Criterios de validación
Los resultados serán válidos si se cumplen los criterios siguientes:
 El valor medio (VM) de la DO medida para el control positivo (CP) es ≥ 0,7.
 El valor medio (VM) de la DO medida para el control negativo (CN) es ≤ 0,2.
En el caso de obtener ensayos no válidos, repita la prueba después de realizar una

revisión minuciosa de las instrucciones de uso.
Cálculo
Calcule el VM de la DO medida para el control negativo (CN) y el control positivo (CP).
El cociente (M/P) de la DO de la muestra con respecto a la DO media del control positivo
se calcula de acuerdo con la ecuación siguiente:
DOmuestra – VM DOCN
M/P = _____________________
VM DOCP – VM DOCN
Los títulos de punto final se calculan a partir del cociente M/P diluido con una
concentración de 1:500 y utilizando la siguiente fórmula:
Log10 Título = 1,54 (Log10 S/P) + 3,77
Interpretación de los resultados (Infección de campo)
Las muestras con un cociente M/P < 0,2 se consideran negativas.

No se han podido detectar anticuerpos específicos de Salmonella enteritidis o de
Salmonella typhimurium ni otros serotipos con antígeno O 1, 4, 5, 9 y 12.
Las muestras con un cociente M/P ≥ 0,2 y < 0,3 se consideran dudosas.
Los resultados dudosos deben agruparse con la mayoría de resultados positivos o
negativos. Se recomienda volver a analizar los resultados dudosos al cabo de unas

semanas. La obtención de resultados dudosos con animales vacunados recientemente
puede ser indicio de un aumento en la formación de anticuerpos específicos. En el caso
de animales que se han vacunado varias veces, los resultados dudosos pueden ser
indicio de una formación insuficiente de anticuerpos específicos o de una disminución de
los mismos.
Las muestras con un cociente M/P ≥ 0,3 se consideran positivas.

No se han podido detectar anticuerpos específicos de Salmonella enteritidis o de
Salmonella typhimurium ni otros serotipos con antígeno O 1, 4, 5, 9 y 12.


2013.
 Madigan M.T, Martingo J.M. & Jack P. (2004). Brock Biología de los
Microorganismos. Editorial Prentice Hall. 10a Edición.

 Qiagen®. (2013). Manual de uso del kit flocktype® Salmonella Ab para la

detección de anticuerpos de Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium ©

2013. QIAGEN Leipzig GmbH, Deutscher Platz 5b, 04103 Leipzig, Alemania.
Consultado en www.qiagen.com
BIBLIOGRAFÍA SUGERIDA
A. 1994.
1989.
Mexico LIMUSA 1993.
UNAM. 2ª Edición. MéxicO

REPORTE DE LA PRACTICA 16
MECANISMOS DE PATOGENICIDAD
I. RESULTADOS

Describa el resultado obtenido de las pruebas de diagnóstico empleadas para la
identificación de los factores de virulencia de los microorganismos analizados.
Interpretación: _____________________________________
_________________________________________________
_________________________________________________
_________________________________________________
Interpretación: _____________________________________
_________________________________________________
_________________________________________________
_________________________________________________
_________________________________________________
II. ASIGNACIÓN
1. Investigue el mecanismo de patogenicidad y los factores de virulencia de las especies

analizadas.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
2. Describa la importancia de la identificación bacteriana a través de métodos serológicos

y moleculares y el fundamento aplicado en cada uno de los procesos empleados para
realizar estas pruebas.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3. Investigue otros métodos para identificar mecanismos de patogenicidad y describa las

ventajas y desventajas de cada uno.
________________________________________________________________________

Dirigida a analizar los factores de virulencia, pruebas serológicas y moleculares, su

importancia en la identificación bacteriana, impacto de la identificación en el control de
enfermedades.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
IV. CONCLUSIONES
renglones.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
V. BIBLIOGRAFÍA
________________________________________________________________________
______________________________________________________________________

Anexo 1. Riesgo biológico
Definición: Riesgo biológico es aquel susceptible de ser producido por una exposición no
controlada a agentes biológicos. Entenderemos por agente biológico cualquier
microorganismo y sus excreciones, cultivo celular o endoparásito humano capaz de
producir enfermedades, infecciones, alergias, o toxicidad.
Existe riesgo biológico en los laboratorios donde se trabaja con microorganismos, cultivos
celulares, se experimenta con animales. También existe este riesgo cuando se efectúan
actividades médicas y paramédicas con seres humanos o animales. El trabajo con
animales en granjas y establos, así como trabajo con muestras como las aguas
residuales.
Recomendaciones generales.
1. Se delimitará y señalizará las zonas de trabajo.

2. No se comerá, beberá o fumará en el laboratorio. Bajo ningún concepto se
guardarán alimentos o bebidas en refrigeradores del laboratorio.
3. Se extremará la higiene personal, lavándose las manos antes y después de cada
tarea.
4. En caso de que hubiere, cubrir las heridas cutáneas con guantes. No emplee
anillos, pulseras, joyas, etc.
5. La manipulación de cualquier muestra se efectuará siempre con guantes y con
gafas o pantallas antisalpicaduras. Cuando menos mascarillas contra vapores.
6. Toda muestra se transportará siempre en recipiente con tapa ajustable y cierre
hermético que impida la salida de fluidos y vapores.
7. Todas las actividades al trabajar con productos biológicos deben realizarse
cuidadosamente para evitar la formación de gotas y aerosoles.
8. En el caso de que durante una operación de centrifugación se produjese la ruptura
de los tubos en el interior del equipo, se esperará al menos durante 5 minutos
para abrir la tapa del mismo. Posteriormente se desinfectará equipos, materiales y
superficies de trabajo con un producto de efectividad constatada (para el tipo de
agente infeccioso que se este trabajando; esto de acuerdo a recomendación por el
instructor.
9. Se restringirá en la medida de lo posible, el uso de agujas y jeringuillas. Se
desechará las jeringas y agujas de un solo uso en contenedores especiales
(indeformables, no perforables, sin fisuras para evitar derrames) sin ser
encapsuladas.
10. El material contaminado que deba ser descontaminado en un lugar exterior al
laboratorio se colocará en un contenedor especial (indeformables, no perforables,
sin fisuras para evitar derrames), debidamente señalizado.
11. Todo material de desecho o residuo biológico previamente esterilizado debe ser
sometido a un programa de gestión de residuos (ver manual de disposición de
residuos). No mezcle los residuos contaminados biológicamente con otro tipo de
residuos.
Para tareas con animales
12. Se manipulará al animal siempre en silencio y con tranquilidad. Evitar en todo
momento su sufrimiento innecesario ya que además puede inducir al animal a
defenderse y a producir lesiones.
13. Se usará siempre guantes en la extracción de sangre o procedimientos invasivos,
en el contacto con líquidos que requieran precauciones universales (líquido
amniótico, pericardio, peritoneal, pleural, semen, secreciones vaginales y cualquier
líquido contaminado con sangre), en contacto con mucosas, piel no intacta y para
manipular objetos o superficies manchados con líquidos corporales. También se
han de usar guantes cuando se tengan cortes, arañazos o lesiones en la piel de
las manos.
14. Se efectuará lavado de las manos después de quitarse la bata y los guantes antes
de dejar la estancia, e inmediatamente si se han ensuciado de sangre. En los
trabajos en granjas y establos se extremará la higiene personal tras la realización
de las tareas.
15. Se recomienda el uso de batas desechables cuando la ropa pueda ser manchada
por líquidos corporales, sangre, excreciones o secreciones. El resto de ropa que
se utilice para estas actividades, será lavada frecuentemente, preferiblemente sin
mezclar con ropa que vaya a ser utilizada en menesteres no laborales.
16. Se debe usar pantalla antisalpicaduras, bata y mascarilla protectoras cuando haya
riesgo de salpicaduras o proyección de líquidos corporales.
17. Las gotas de sangre que se derramen deberán limpiarse rápidamente con un
desinfectante.

Anexo 2. Lineamientos generales de laboratorios de ITSON.
Apartado vii. Alumnos
7.1 Solo tendrán derecho a realizar las prácticas de laboratorio, los alumnos que estén
oficialmente inscritos en la materia correspondiente.
7.2 El alumno que falte a una práctica, sin motivo justificado ante su maestro, pierde
derecho a la misma.
7.3 Ningún experimento debe de ser iniciado por el alumno hasta que se haya dado las
instrucciones pertinentes y cuente con la aprobación del instructor.
7.4 Ningún equipo deberá ser operado parcial o totalmente hasta que ser reciban las
instrucciones correspondientes y cuente con la aprobación del instructor.
7.5 Al finalizar la práctica, deberá efectuarse la limpieza del área de trabajo, equipo,
materiales o instrumental bajo la supervisión del instructor y de acuerdo con lo
estipulado en el Manual de Seguridad de Laboratorios.
7.6 Ningún equipo deberá ser desarmado parcial o totalmente a menos que sea
requisito indispensable de la práctica y así esté estipulado en el manual de curso.
7.7 El deterioro o falla del equipo deberá ser comunicado de inmediato al instructor.
7.8 Todas las reglas de seguridad establecidas en el Manual de Seguridad e Higiene de

Laboratorios deberán observarse estrictamente. La violación de alguna de ellas,
implicarán un sanción, que puede ir desde la amonestación hasta la expulsión
parcial o total, de acuerdo con el artículo 35 de la Ley Orgánica de esta institución.
7.9 Los alumnos podrán hacer uso de los laboratorios fuera de la hora programadas
siempre y cuando cumplan con los siguientes requisitos:
a) Se presenten todos los integrantes del equipo de trabajo.

b) Se trate de una práctica donde no se hayan alcanzado los resultados
esperados, el maestro titular deberá analizar la solicitud y en su caso,
apruebe su repetición de acuerdo a la disponibilidad de reactivos.
c) Que no sea solicitado este servicio frecuentemente por el mismo equipo de
trabajo.
d) Se realice día y hora asignados por el maestro, cuidando que el equipo,
materiales y/o laboratorio no estén comprometidos para el desarrollo de
una práctica programada.
e) Que se tenga excedentes en inventarios de los reactivos requeridos por la
práctica.
f) Los alumnos al realizar esta práctica deberán registrarse en el formato
disponible para ello en el almacén del edificio.
g) Los alumnos deberán dejar limpia el área de trabajo al finalizar la sesión.
h) Los alumnos firmarán la hora de salida del aula.
i) Los alumnos aceptan que se les aplique los estipulado en el punto 8.2 a
8.5 de la sección correspondiente a aspectos económicos de este
lineamiento
La no asistencia en el horario asignado para cubrir una repetición solicitada según

el punto 7.9 de este lineamiento ocasionará la perdida de derecho a este servicio.

Anexo 3. Cuidados y manejo del microscopio
I. Cuidados del microscopio.
1. Transportar el microscopio sujetándolo del brazo con una mano y colocar la otra debajo
de la base para sostenerlo y colocar cuidadosamente el microscopio en su mesa de
trabajo en un sitio sin vibraciones.
2. Limpiar el sistema mecánico con un trapo suave que no deje pelusa y el sistema
óptico con papel seda. No manejar las lentes con los dedos. Limpiar las lentes antes y
después de usarlo en clases, solo con papel seda.
3. No arrastrar, golpear o inclinar el microscopio.
II. Manejo del microscopio
1. Conectar y encender la lámpara.

2. Colocar el objetivo seco débil (10 X) en posición.
3. Subir el condensador hasta el tope.
4. Abrir o cerrar el diafragma hasta lograr una adecuada iluminación. La iluminación
excesiva disminuye el contraste.
5. Colocar la preparación en la platina y ajustarla con las pinzas o en el carrete para
portaobjetos.
6. Iniciar el enfoque usando el tornillo de ajuste grueso (macrométrico) y después de
ajuste fino (micrométrico), hasta obtener una imagen nítida.
7. Sin mover los tornillos cambiar al objetivo seco fuerte (40 X) usando el porta objetivos
giratorio (revólver) y enfocar de nuevo usando el micrométrico.
8. Una vez localizado el campo de interés y antes de cambiar al objetivo de inmersión,
colocar una pequeña gota de aceite de inmersión en la preparación y sin mover los
tornillos proceda a colocar el objetivo de (100X) en posición. Enfocar la preparación
usando solamente el tornillo micrométrico y cuidando de no presionar demasiado el
portaobjetos con el objetivo porque puede romper la preparación y rayar la lente.
9. Al terminar de hacer sus observaciones, limpiar el microscopio como se indicó, bajar la
platina hasta el tope inferior y dejar el revólver en el objetivo de menor aumento o donde
no lo tiene.
10. Entregar o guardar el microscopio con el cable enrollado y cubierto con la funda.
11. Avise a sus profesores de cualquier irregularidad que note en el microscopio para
que el maestro lleve registro en almacén del mismo.

Anexo 4. Procedimientos para el lavado, esterilización y desinfección de
materiales utilizados en laboratorio.
De acuerdo con Gonzales y colaboradores (2004), los procesos de esterilización o

desinfección son diariamente llevados a cabo en el laboratorio ya que evitan la
contaminación de los medios, cultivos, placas, etc. Los mirocroorganismos pueden ser
inhibidos o muertos por agentes físicos, químicos o por procesos físicos y agentes
quimioterapéuticos. Se dispone de una gran variedad de técnicas y agentes que actúan
de maneras diferentes y cada uno tiene su aplicación y límite de uso.
Limpieza: es la eliminación de restos de alimentos, grasa o suciedad mediante el uso de

agua, jabón o detergente.
Esterilización: es la destrucción de microorganismos patógenos mediante el uso de

sustancias químicas o procedimientos físicos, a un nivel que no sea dañino para el
alimento o para el ser humano.
Desinfección: es reducción o disminución de microorganismos por medio de agentes

químicos y/o físicos, a un nivel que no sea dañino para el alimento o para el ser humano.
Detergente: sustancia química que se utiliza para eliminar la suciedad y la grasa o el

material orgánico de una superficie antes de desinfectarla.
Desinfectante: sustancia química que reduce el número de bacterias nocivas o patógenas

hasta un nivel seguro para la vida humana, animal o vegetal.
Lavado y limpieza de cristalería
La cristalería que vaya a ser utilizada en laboratorio (investigaciones, prácticas, etc.) debe
ser sometida previamente a un proceso de limpieza y desinfección antes de esterilizarla.
*Cristalería nueva: pasar previamente por agua caliente para eliminar la presencia de
vestigios fabriles. Después se sumerge en una solución de ácido clorhídrico al 1%,
dejando actuar el desinfectante por un espacio de tiempo no menor de 4 horas. Lavar con
detergente posteriormente, se enjuaga con agua corriente y finalmente con agua

destilada. Escurrir y dejar secar al aire; si se desea mayor rapidez se puede introducir en
una incubadora.
*Cristalería previamente utilizada: si mantiene material infeccioso por haber estado en

contacto directo con microorganismos o contiene cultivo de ésta, debe ser sometida
previamente a un proceso de esterilización en autoclave a 121°C durante 30 minutos,
para evitar que el técnico o la persona encargada de su limpieza se contamine con
microorganismos patógenos.
Después de la esterilización, la cristalería se enjuaga para eliminar los restos del material
que contenía y se sumerge durante 10 o 15 minutos en mezcla sulfcrómica, o más tiempo
si la mezcla ya ha sido utilizada y mermada su efectividad. La cristalería así tratada, se
friega con detergente, se enjuaga con agua corriente y finalmente con agua destilada,
procediendo a su secado en la forma anteriormente explicada.
La eficiencia del lavado se puede evaluar observando si el agua escurre en forma
continua por su superficie interior, sin dejar gotas aisladas que señalen un proceso de
limpieza deficiente y hacer pruebas con azul de bromotimol para determinar trazas de
detergente.
Preparación previa de la cristalería para su esterilización

Después de desinfectadas, fregadas y secas se procede de la siguiente manera:
- Tubos de ensayo: se taponean con algodón y se envuelven con papel de estraza
en grupos de 5 a 10 tubos.
- Placas de Petri: después de ensambladas (tapa y caja) podrán ser colocadas
dentro de un cilindro de material inoxidable con tapa, fabricado para ese fin, o en
su defecto, las placas serán empaquetadas con papel de estraza, individualmente,
en parejas o en grupos de no de más 5 placas.
- Pipetas: se taponean de tal manera que no dificulte la succión, pero al mismo
tiempo impida el paso del material que esté pipeteando, posteriormente se
enrollan en una franja de papel de estraza.
- Matraces Erlenmeyer, probetas y otras cristalerías similares: se taponean con
algodón y recubren con papel de estraza, el cual se ata fuertemente con un lazo al
cuello o porción anterior a de la cristalería.

El resto de los materiales se empaquetan igualmente e incluso, algunos como las
jeringuillas con doble envoltura.
Esterilización en autoclave:
1. Revise el nivel del agua de la caldera y en caso de ser insuficiente, proceda
a echar la cantidad requerida.
2. Introduzca en la cámara los objetos y materiales que se van a esterilizar,
cerrar herméticamente la puerta.
3. Encienda la fuente de calor.
4. Manténgase atento a la válvula de salida de aire. Cuando el vapor salga
mediante un chorro continuo y sin intermitencia, cierre la válvula, pues será
indicativo de que el aire acumulado dentro del autoclave ha salido y que todo
el espacio de la cámara está ocupado exclusivamente por el vapor de agua.
5. Espere a que el termómetro maque 121°C y el manómetro 15lb/pgda3 de
presión, para comenzar a contar el tiempo de esterilización, que
generalmente es de 15 a 20 minutos, aunque puede extenderse a 30
minutos si el objeto o producto a esterilizar es demasiado grande, si se diera
el caso, de que la temperatura no corresponde con la presión, es indicativo
de que no se sacó el aire.
Desinfección
El hecho de que todos los desinfectantes tengan la capacidad de matar a los
microorganismos, no significa que pueda emplearse cualquiera sin una previa selección.
Lo primero que hay que hacer, es la caracterización de objeto, material o ambiente que
se desea desinfectar, lo segundo, es seleccionar el desinfectante que resulte más eficaz
para ese objetivo, teniendo en cuenta su poca o suficiente capacidad de penetración de
penetración en el tratamiento de las sustancias orgánicas y tercero, cerciorarse de que su
empleo no produzca deterioro del objeto a desinfectar.
La aplicación de estos productos químicos se realiza de manera diferente, de acuerdo

con lo que se quiera desinfectar:

1. Desinfección por sumersión: consiste en sumergir los objetos en un recipiente
apropiado hasta cubrirlos con la solución desinfectante.
2. Desinfección por aplicación directa: aplicar con ayuda de algodón, gasa o paño, el
desinfectante a la superficie del objeto de que se trate: mesa, puesto de trabajo y, en
menor grado, las paredes y el suelo.
3. Desinfección por gasificación: algunos desinfectantes como el formaldehído se pueden
emplear en su estado gaseoso, para la desinfección de ambientes especiales, ropas,
mobiliarios y otros artículos.
Tabla 4. Agentes desinfectantes (oxidantes y catiónicos)

AGENTE MECANISMO DE ACCIÓN ESPECTRO DE ACCIÓN USOS
DESINFECTANTE
OXIDANTES Los oxidantes (peroxígenos) son Su espectro de actividad es Su espectro de actividad es
productos que liberan oxígeno sobre bacterias vegetativas, sobre bacterias vegetativas,
naciente. Considerados como virus, micobacterias y virus, micobacterias y
compuestos bactericidas útiles, esporas. esporas.
su mecanismo de acción
consiste en la inactivación de
proteínas enzimáticas actuando
sobre los grupos -SH de las
proteínas de estructura y de las
proteínas de función de las
bacterias.
EI peróxido de hidrógeno tiene Es activo frente a bacterias y Antiséptico tópico

PERÓXIDO DE efectos oxidantes por producir virus, según la concentración en solución al 3%.
HIDRÓGENO OH y radicales libres, los cuales y condiciones de utilización.
atacan a los componentes
esenciales de los Estudios in vitro de soluciones
microorganismos como lípidos, de peróxido de hidrógeno al
proteínas y ADN. 3% han mostrado amplio
Es un agente oxidante de efecto espectro de eficacia, con
fugaz por ser descompuesto por mayor actividad frente a
las catalasas de los tejidos. bacterias grampositivas.
COMPUESTOS DE Son sustancias que lesionan la Activos para eliminar bacterias Desinfección de superficies
AMONIO membrana celular debido a que Grampositivas y no críticas, Acción
CUATERNARIO desorganizan la disposición de gramnegativas, aunque éstas desodorante. Limpieza de
(agentes las proteínas y fosfolípidos, por últimas en menor grado. superficies ásperas o difíciles.
activos lo que se liberan metabolitos Son bactericidas, fungicidas y Las soluciones tienden a
Catiónicos). desde la célula, interfiriendo con virucidas, actuando sobre adherirse a las superficies, por
el metabolismo energético y el virus lipofílicos pero no sobre lo que es necesario
transporte activo. los hidrófilos. enjuagarlas a fondo.
No tiene acción sobre las No son compatibles con
micobacterias, ni son jabones o detergentes
esporicidas. aniónicos.
Fuente: Universidad de Pamplona, (2015).

Tabla 5. Agentes desinfectantes (alcoholes-aldehídos y fenoles)
DESINFECTANTE
ALCOHOLES Los alcoholes actúan Los alcoholes poseen una
destruyendo la membrana rápida acción y amplio
celular y desnaturalizando las espectro de actividad, EI alcohol se utiliza muy
proteínas. Su acción es rápida, actuando sobre bacterias frecuentemente para la
incluso desde los 15 segundos, gramnegativas y desinfección o limpieza de la
aunque no tiene efecto grampositivas, incluyendo piel, su aplicación esta
persistente. Sus efectos microbacterias, hongos y virus también indicado en la
biológicos de daño microbiano Sus efectos pero no son desinfección de material no
permanecen por varias horas. esporicidas. El etanol al 70% crítico como termómetros
destruye alrededor del 90% de
las bacterias cutáneas en dos
minutos
ALDEHíDOS Actúan mediante la aniquilación Los aldehídos tienen un Esterilización de objetos
FORMALDEHíDO de los grupos químicos de las amplio espectro de actividad inanimados, como
proteínas y ácidos nucleicos de contra microorganismos y instrumentos.
las bacterias, virus y hongos. EI virus. Desinfección de material de
formaldehido actúa sobre las El formaldehído esbactericida, metal, caucho y plástico.
Proteínas por desnaturalización. esporicida y virucida, pero Desinfección de alto nivel de
EI glutaraldehído actúa de forma trabaja más lentamente que el Hemodializadores.
similar en pH alcalino. Sobre la glutaraldehído.
pared celular, el glutaraldehído EI formaldehido es un AI 20% a 30% es astringente.
actúa al nivel de los puentes producto químico
cruzados delipeptidoglicano. extremadamente
reactivo y que interactúa con
proteínas, ADN y ARN in vitro.
FENOLES Son bactericidas a bajas Los fenoles se utilizan más En la actualidad, sólo se
concentraciones, causando como desinfectantes, tienen emplea para la desinfección
daño a las membranas con propiedades antibacterianas de puntos críticos en la
pérdida de los constituyentes frente a estreptococos, industria, aplicándolo a
citoplasmáticos, inactivando estafilococos y Escherichia superficies, ropa blanca,
irreversiblemente las oxidasas y coli, y también propiedades instrumentos, sanitarios,
deshidrogenasas de membrana antifúngicas y antivirales excreta y evitar el crecimiento
y produciendo de hongos.
desnaturalización, de las
proteínas.

Tabla 6. Agentes desinfectantes (halogenados)
DESINFECTANTE
HALOGENADOS EI mecanismo de acción Los hipocloritos tienen un EI hipoclorito de sodio se
HIPOCLORITOS sobre extenso espectro de presenta en solución a una
los microorganismos es poco actividad, Concentración de 5,25%.
conocido, pero se postula que son bactericidas, virucidas, Para las desinfecciones, las
actúan inhibiendo las fungicidas y esporicidas, Diluciones en uso son entre
reacciones pero 0,1% y 1%.
enzimáticas y actividad variable frente a Limpieza de vajilla. Lavado
desnaturalizando micobacterias, según la de ropa en general,
las proteínas concentración en que se Cloración del agua.
use. Desinfección de algunos
alimentos. Desinfección de
Desechos líquidos
contaminados como este
grupo de desinfectantes
corroe los metales y
produce efectos
decolorantes, es necesario
enjuagar lo antes posible las
superficies desinfectadas.
COMPUESTOS Los compuestos yodados son El yodo tiene una poderosa La desinfección de la piel
YODADOS agentes oxidantes, se combina actividad germicida, ataca sana.
irremediablemente con residuos bacterias grampositivas y EI tratamiento de afecciones
tirosina de las proteínas. gramnegativas, micobacterias, de la piel causadas por
Precipitan las proteínas esporas, hongos, virus, bacterias y hongos.
bacterianas y ácidos nucleídos. quistes y protozoos. La limpieza de las heridas, en
Alteran las membranas solución acuosa.
celulares al unirse a los enlaces
C=C de los ácidos grasos.
Actúa disminuyendo los
requerimientos de oxigeno de
los microorganismos aerobios,
interfiriendo la cadena
respiratoria por bloqueo del
transporte de electrones a
través de reacciones
electrolíticas con enzimas.
YODOFOROS Tienen amplio espectro de La yodopovidona es activa El lavado de las manos, como
actividad contra bacterias y contra bacterias antiséptico.
hongos y presentan el mismo grampositivas, La limpieza de la piel sana en
mecanismo de acción y gramnegativas, hongos, virus Procedimientos quirúrgicos y
espectro de actividad de los y micobacterias. la Limpieza de objetos de
yodados. EI más conocido de Es efectiva contra al S. superficie dura.
los yodóforos es la aureus MRSA y especies de Para superficies limpias,
yodopovidona compuesta enterococo. normalmente se necesita una
de yodo y polivinil-pirrolidona Resistencia significativa a solución entre 25 a 50
yodopovidona no ha sido miligramos por litro de yodo
reportada disponible a PH 4.

Anexo 5. Métodos empleados en la identificación y/o diagnóstico bacteriano
1. Métodos basados en criterios morfológicos

Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos
años a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatómicos tan
diferentes que pueden ser fácilmente utilizados en su clasificación, pero con respecto a
los microorganismos, estos lucen bajo el microscopio tan similares que se dificulta su
clasificación. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un
microscopio, tan similares que se dificulta su clasificación, pueden diferir en propiedades
bioquímicas, fisiológicas y/o serológicas. Sin embargo, aun cuando la morfología celular
dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación de
bacterias. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización resulta de mucha
utilidad en la identificación de bacilos esporulados.
2. Métodos basados en tinción diferencial

Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología de una bacteria, examinando
una lámina que fue sometida a un proceso de tinción diferencial (Gram o Ziehl Neelsen).
Estos criterios morfológicos encabezan las primeras etapas del proceso de identificación
bacteriana. Un examen microscópico de una lámina teñida por medio de tinción
diferencial es útil para obtener una información rápida sobre la calidad de un ambiente
clínico. Por otro lado, un médico también puede obtener suficiente información de un
reporte técnico de laboratorio para comenzar el tratamiento apropiado de un paciente.
3. Métodos basados en pruebas bioquímicas

Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias.
Estas, se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar
azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de
compuestos coloreados, etc. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse
en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas. Por ejemplo, las bacterias
entéricas Gram negativas, forman un grupo muy grande y heterogéneo cuyo hábitat
natural es el tracto gastrointestinal de los humanos y otros animales. Existen en el
mercado sistemas miniaturizados basados en pruebas bioquímicas, que permiten reducir
el tiempo del reporte. Estos sistemas han sido diseñados para realizar varias pruebas

bioquímicas simultáneamente y permitir la identificación en más corto tiempo. Requieren
tener la cepa en suspensión pura. Las pruebas se clasifican en grupos; a cada uno de los
resultados positivos de los ensayos se les asigna un determinado valor numérico,
obteniéndose un código que corresponde a un determinado género o especie en un texto
de la base de datos. Este tipo de método también ha sido desarrollado para la
identificación de levaduras y hongos. Algunos ejemplos son: Enterotube® y API 20E®.
Una limitación de este tipo de método de identificación es la aparición de cepas mutantes

y la adquisición de plásmidos que puedan dar origen a cepas con características
diferentes.
4. Métodos basados en tipificación con fagos

La interacción entre un virus bacteriano (fago) y su célula bacteriana sensible es
sumamente específica, ya que el proceso de adsorción se encuentra mediado por
receptores específicos tanto en el virus como en la célula bacteriana. A una placa con
medio de cultivo sólido inoculado con un cultivo puro de una determinada bacteria, se le
añade una alícuota de un fago específico; este puede ocasionar lisis de las bacterias,
hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, denominadas placas,
que indican que hubo infección y lisis celular. El uso de fagos específicos permite
identificar y subclasificar bacterias dentro de una misma especie.
5. Métodos basados en ensayos serológicos

Estas pruebas están basadas en la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo. Los
métodos serológicos, implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas
específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en
la identificación microbiana en muestras puras o en muestras biológicas. Cada uno de los
métodos tiene su fundamento particular, pero en líneas generales, todos se basan en la
reacción de un antígeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo
correspondiente. La solución que contiene los anticuerpos se denomina antisueros. Este
método de identificación bacteriana se utiliza en la caracterización de las leptospiras,
salmonelas, Rickettsias, micoplasmas, estreptococos y brucelas.

Algunos ejemplos son: inmunofluorescencia, aglutinación, precipitación,
radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático (ELISA), fijación de complemento, e
inhibición del crecimiento mediante antisueros específicos.
En el caso de los ensayos de Elisa, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas:

Utiliza anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno a identificar, marcados con
una enzima. Se refiere a un grupo de métodos de ensayo que tienen en común, ya sea
un antígeno o un anticuerpo específico ligado a un soporte sólido, un "sorbente". El
ligando afín a continuación, se puede unir indirectamente al soporte sólido a través de la
unión "inmunoabsorbente", lo que permite o bien la detección de la "sorbente" unida a
ligando. Mientras que un ensayo de ELISA tipo sándwich, los anticuerpos específicos
para el antígeno, se colocan sobre los pozos de una microplaca, posteriormente se añade
la muestra donde se quiere determinar la presencia del agente (bacteria, virus,
protozoario). Si el agente está presente ocurre la reacción antígeno-anticuerpo; luego del
lavado se añade el anticuerpo específico marcado con la enzima. Una vez transcurrido el
tiempo de incubación y realizado el lavado correspondiente, se añade el sustrato. Si se
desarrolla un color se trata de un resultado positivo. Estos ensayos, involucra el uso de
controles positivos y negativos. Inmunoensayos tipo ELISA han sido desarrollados para la
detección de varios tipos de agentes microbianos como: VIH, virus de hepatitis A, B y C,
Chlamydea trachomatis, Mycoplasma pneumoniae, Escherichia coli, Haemophilus
influenzae, Neisseria, salmonella sp, entre otros.
Los pasos generales de un ensayo Elisa son los siguientes:

1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el
pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido.
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima.
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo.
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida.
8. Adición del substrato.
9. Unión del substrato a la enzima.

10. Desarrollo del color.
ELISA Directo
• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar
los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos
reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
ELISA Indirecto
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de
estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).

• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar.
Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará
específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.

• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una
enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que
se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados
que no hayan reaccionado.
ELISA Sándwich “HADAS”

• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará
específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales
reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran
fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado.
• Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el
paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
ELISA Competitivo
• Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo utilizado
en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos objeto de
estudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenos del anticuerpo usado en el paso

anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antígenos que no hayan
reaccionado.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y
comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son análogas, el antígeno a
estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si
hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antígeno objeto de estudio, está
relacionado serológicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la
diferencia de densidad óptica, es proporcional a la concentración del antígeno problema
en la muestra.
6. Métodos basados en biología molecular

Modernamente adquiere más importancia el uso de métodos basados en biología
molecular donde, a través del procedimiento y reactivos, se pueden detectar
determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente microbiano.
El método que se está utilizando ampliamente en los laboratorios de diagnóstico es el
PCR (Polymerase Chain Reaction), que se aplica generalmente para la identificación de
microorganismos que no pueden ser cultivados por los métodos convencionales. A través
de este método, puede aumentarse la cantidad de ADN hasta niveles detectables
mediante electroforesis o mediante sondas de ADN.
El proceso requiere la siguiente secuencia de pasos:

1. Separación de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la temperatura, la cual
rompe los enlaces de hidrógeno que mantiene unidos a las cadenas de ADN.
2. Adición de cadenas cortas de polinucleótidos, denominados cebadores, que se unen
por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del fragmento de ADN que
se desee amplificar. Uno se une a la cadena 5’—3’ y otro a la cadena 3’—5’.
3. Disminución de la temperatura para permitir que los cebadores hibridicen con las
cadenas de ADN de la muestra problema, por complementariedad de bases.
4. Adición de la ADN polimerasa, los cuatros nucleótidos (ATP, GTP, TTP, CTP) y demás
cofactores para que tengan lugar la síntesis de la cadena complementaria.
5. Repetición de las etapas 1 a 4.

Este proceso se caracteriza por ser exponencial. En cada ciclo se duplica la región de
ADN ubicada entre los cebadores. Este procedimiento se realiza en un equipo
denominado termociclador, que permite regular las diferentes temperaturas que se
requieren para cada uno de los pasos. Agentes microbianos como bacterias, virus y
protozoario, que han sido identificados mediante PCR.
Otros método que también ha sido ampliamente utilizado y que se fundamenta en

complementariedad de bases de ácidos nucleicos, son aquellos que utilizan sondas de
ADN, que se definen como secuencias de oligonucleótidos de ADN marcados, con un
elemento radioactivo (32P, 125I, 35S) o con una proteína unida a una enzima como la
fosfatasa alcalina. Estas sondas se utilizan para la detección de una secuencia
complementaria de ADN o ARN, presente en el agente que se desea identificar. La
muestra, que se supone que contiene un agente microbiano con una secuencia
complementaria que se desea identificar, se coloca en un filtro, se trata de manera tal de
liberar al ácido nucleico, se calienta para que las cadena “S” complementarias se
separen. Posteriormente se añade la sonda, y se deja transcurrir un periodo para que
tenga lugar la hibridación si existe la cadena complementaria. La unión de la sonda a la
secuencia complementaria se detecta mediante la señal radiactiva que se emite la sonda
mediante métodos enzimáticos.

Anexo 6. Formato de registro de casos clínicos para estudio bacteriológico.


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Instituto Tecnológico De Sonora

Dirección de Recursos Naturales

Manual de Prácticas del

M.C. Ana Laura Miranda Romero

Anexo 1. Riesgo biológico 140

Figura 1. Estructura química del colorante safrina 9

Tabla 1. Interpretación del antibiograma 65

La adquisición de habilidades y conocimientos que implican el aprendizaje de la

El Manual de Bacteriología y Patogenia Bacteriana del Instituto Tecnológico de Sonora

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 1

2. La tolerancia máxima para permitir el acceso de los alumnos al laboratorio es de 10

5. No se permite el uso de sombrero y gorras.

6. El alumno guardará sus objetos personales en las gavetas.

7. Está prohibido introducir alimentos, comer, beber, fumar y masticar chicle en el

8. Apagar el teléfono celular al ingresar al laboratorio, no se permitirá su uso interno.

9. Evitar llevarse objetos a la boca, tocarse la cara, cabello, ojos, etc.

10. Mantener limpia la mesa de trabajo, desinfectarla al inicio y al término de la práctica.

12. Los portaobjetos y pipetas contaminados, se colocarán en recipientes con

14. En caso de heridas o erosiones en la superficie corporal, el alumno dará aviso al

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 2

19. Los exámenes se aplicarán al inicio de cada práctica.

20. Es obligatorio que el alumno entregue el diagrama de flujo previo a la realización de la

Academia de Bacteriología y Patogenia Bacteriana

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 3

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Las medidas de seguridad deben ser adecuadas para el tipo de microorganismo en

COMPETENCIA: El alumno aplicará las medidas de seguridad que se han implementado

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 4

Realice el reporte de práctica 1 y siga lo indicado en el mismo.

 Prescott, L.M.; Harley, J. P.; Klein, D. A. (2002). Microbiology. The McGraw-Hill

 Quinn, P. J. (2011). Veterinary microbiology and microbial diseases. Estados

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 6

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 7

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Y TINCIONES SIMPLES

El microscopio compuesto es un instrumento de precisión que consiste en una serie de

Tratar de observar a los microorganismos con un microscopio óptico sin un contraste

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 8

En el procedimiento de tinción se emplea un sólo colorante. Una vez fija la preparación,

Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de la anilina y que

Figura 1. Estructura química del colorante safranina

COMPETENCIA: El alumno diferenciará la forma y agrupación microscópica de los

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 9

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Figura. 2. Forma y agrupación de las bacterias.

Registra todos los resultados de manera gráfica y descrita en el reporte de práctica

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 11

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 12

A) Frotis a partir de un medio sólido:

Cuadro1. Resultados de la morfología microscópica

Esquemas del microorganismo1 con el objetivo 40 X.

Esquemas del microorganismo 1 con el objetivo 100X.

B) Frotis a partir de un medio líquido:

Cuadro 2. Resultados de la morfología microscópica.

Esquemas del microorganismo1 con el objetivo 40 X.

Esquemas del microorganismo 1 con el objetivo 100X.

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 13

Dirigirla hacia la importancia de las formas y agrupaciones bacterianas en el proceso de

2. Investiga la forma y las características generales de los microorganismos que

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 14

Las características que se toman en cuenta para describir la morfología colonial

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 15

Fuente: Prescott y col. (2002).

COMPETENCIA: Adquirir los conocimientos necesarios para diferenciar las formas

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA 17