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Procesos de identificacin de microorganismos a travs
de una muestra problema por medio de tincin Gram y
Ziehl-Neelsen

Informe de prcticas de laboratorio.
Bellatin Indiveri, Francesca Mara
1

Bustamande Winder, Katherine
1

Guanilo Lpez, Andrea Daniela Alejandra
1

Leveau Daz, Mariela
1


RESUMEN
Se tomaron muestras de suelo en las cercanas de la laguna de Villa 1- Universidad
Cientfica del Sur para posteriormente sembrar una porcin de la muestra en medios de
cultivos como agar licuado fundido (ALF) para la proliferacin de microorganismos y su
consecuente identificacin con la tincin Gram y coloracin Ziehl-Neelsen. Posteriormente
una vez realizada la proliferacin de dichos organismos se procedi a realizar una tincin
Gram para la observacin en microscopio a 1000X. De la observacin se vio que las
muestras obtenidas eran bacilos delgados y cortos Gram positivos en formaciones en
cadenas y disposiciones predominantemente rectas. Se observ tambin una muestra de
Mycobacterium tuberculosis con la coloracin Ziehl-Neelsen a 1000X lo cual devel
bacilos cortos rosceos y dispersos. Se concluy que el mtodo de siembra es
fundamental para la proliferacin de los microorganismos ya que provee condiciones
ptimas para su desarrollo y que el funcionamento correcto de la tincin Gram y
coloracin Ziehl-Neelsen dependen directamente del tipo de microorganismo con el que
se est experimentando.
Palabras clave: Gram, Ziehl-Neelsen, tincin, identificacin, BAAR, siembra.

1
Alumnas de la Facultad de Ingeniera y Gestin Ambiental de la Universidad Cientfica
del Sur.
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INTRODUCCION
Los medios de cultivo son una mezcla de
nutrientes que permite el crecimiento de los
microorganismos; siempre y cuando se encuentre
en concentraciones adecuadas y en condiciones
fsicas ptimas.
Un punto importante que se debe tener presente,
es que cada medio de cultivo preparado debe
pasar por un riguroso proceso de control de
calidad, donde se determinan sus propiedades
fisicoqumicas (apariencia, pH, etc.) y
microbiolgicas (esterilidad y promocin de
crecimiento) verificando que cumplan con los
requisitos de calidad establecidos y por ende
demostrar que son aptos para su uso. [6]
Los Mtodos de siembra son aquellos
mecanismos que se usan en el laboratorio para
una identificacin presuntiva de los
microorganismos presentes en la muestra
problema.
Gram: es el tipo de tincin diferencial ms
importante para la visualizacin de bacterias.
Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos: gram
positivas y gram negativas [1]. Esta tincin tiene
gran importancia en taxonoma bacteriana ya que
indica diferencias fundamentales de la pared
celular de las distintas bacterias.
Mientras que las bacterias gram negativas son
constantes en su reaccin, los microorganismos
gram positivos pueden presentar respuestas
variables en ciertas condiciones. Por ejemplo, los
cultivos viejos de algunas bacterias gram positivas
pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y
en consecuencia, se tien por la safranina
apareciendo como gram negativas. Anlogo
efecto se produce en ocasiones por cambio en el
medio del organismo, o por ligeras modificaciones
en la ejecucin de la tcnica. [2]
Ziehl Nielsen: Esta coloracin permite identificar
micro organismos alcohol acido resistentes; por
ejemplo: micro organismos con pared celular con
abundante cantidad de lpidos.
Se realiza esta tincin en micro organismos con
pared lipoide, estos lpidos presentes en la pared
se conocen como cidos miclicos, ya que es de
alto peso molecular lo que la vuelve cerosa a
temperatura ambiente. Estos cidos miclicos son
resistentes a la tincin gran, por eso la tincin
gram no es satisfactoria para la deteccin de
Mycobacterium.[10]
El objetivo principal de la siguiente prctica es
poder reconocer y diferenciar los medios de
cultivo, reconocer cuales son los mtodos de
siembra necesario para cada tipo de necesidades
y por ltimo el objetivo de esta prctica es poder
realizar correctamente las tinciones para cada tipo
de micro organismo, pudiendo as diferenciar su
estructura (Gram) o su resistencia a alcohol acido.





MATERIALES Y MTODOS
Medios de cultivo y Mtodos de siembra
Estriado: Se coloc un poco de muestra extrada
de los alrededores de la laguna de la Universidad
Cientfica del Sur- Villa 1 con el asa de siembra,
luego se coloc una gota de agua y se
homogeniz. Posteriormente, se coloc
de esta mezcla en la placa petri con
fundido (ALF) previamente dividida en cuatro
cuadrantes y se realiz la siembra con el mtodo
de estriado en cada uno de los cuadrantes.
Diseminacin: Con la pipeta paster se
pequea porcin de muestra (previamente diluida
en agua), luego con la esptula drigalsky se
realiz el pintado primero en un sentido y luego en
el sentido contrario.
En ambos casos se dieron las condicione
ptimas para la proliferacin de microorganismos.
Tincin Gram

Figura 1. Muestras de colonias
bacterianas sembradras a partir de la
muestra de suelo de Villa 1.
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MATERIALES Y MTODOS
Medios de cultivo y Mtodos de siembra
un poco de muestra extrada
de los alrededores de la laguna de la Universidad
con el asa de siembra,
una gota de agua y se
Posteriormente, se coloc una gota
ezcla en la placa petri con agar licuado
previamente dividida en cuatro
cuadrantes y se realiz la siembra con el mtodo
de estriado en cada uno de los cuadrantes.
Diseminacin: Con la pipeta paster se retir una
de muestra (previamente diluida
en agua), luego con la esptula drigalsky se
el pintado primero en un sentido y luego en
En ambos casos se dieron las condiciones
ptimas para la proliferacin de microorganismos.
de colonias
bacterianas sembradras a partir de la
En una placa porta objeto esterilizado
una gota de agua, con el asa de siembra,
previamente esterilizada a la llama
se llev una pequea cantidad de una colonia de
la muestra problema.
Con el asa se extendi
sobre la lmina porta
emulsin y se fij al calor, calentando suavemente
a la llama del mechero hasta que se seque.
Se colore con cristal violeta (primer colorante)
durante un minuto, para
cristal violeta de la placa
agreg lugol (mordiente) por 1 minuto y se
el lavado con agua. Se agreg
cetona (decolorante) y
agreg safranina (colorante de contraste) a la
placa durante 1 minuto y se
secar al calor. Finalmente
microscopio con aceite de inmersin.
Figura 2. Muestra el procedimiento con las
coloraciones utilizadas en la tincin gram.
http://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/pueba
s-bioquimicas-primarias/
objeto esterilizado se coloc
una gota de agua, con el asa de siembra,
previamente esterilizada a la llama del mechero,
una pequea cantidad de una colonia de
tra problema.
i la gota de agua y muestra
porta objeto hasta hacer una
al calor, calentando suavemente
a la llama del mechero hasta que se seque.
con cristal violeta (primer colorante)
para luego lavar el exceso de
cristal violeta de la placa con agua. Luego se
(mordiente) por 1 minuto y se reiter
Se agreg despus el alcohol
cetona (decolorante) y se lav. Por ltimo se
safranina (colorante de contraste) a la
placa durante 1 minuto y se procedi a lavar y
Finalmente se observ a 1000X al
microscopio con aceite de inmersin.
Muestra el procedimiento con las
coloraciones utilizadas en la tincin gram.
http://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/pueba
primarias/
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Coloracin Ziehl-Nielsen. (Placa con
Mycobacterium Tuberculosis)
En una lmina porta objetos se coloc la muestra
y se fij al calor, se le agreg fucsina (primer
colorante) por 5 minutos en caliente. Luego se
lav con alcohol cido (decolorante) y
posteriormente con agua. Se colore con azul de
metileno (segundo colorante) durante 1 minuto.
Finalmente se reiter el lavado con agua, se sec
y se observ a 1000X. En la prctica realizada se
observ directamente la muestra con la aplicacin
de la coloracin Ziehl-Nielsen mas no se realiz
el procedimiento de coloracin.

Figura 5 Muestras de Mycobacterium tuberculosis
observadas a 1000X.



RESULTADOS Y DISCUSIONES.
Coloracin Gram
Al realizar la experiencia se obtuvieron colonias de
bacilos gram positivas, podemos asegurar que
pertenecen a este grupo debido a que al aplicar la
tincin gram se tiene como referencia que stas
bacterias se teirn de un color violeta, as como
pas en la prctica realizada (Figura 4). Esto se
debe a que las bacterias Gram positivas retienen
el cristal violeta, por lo cual se ven de un color
violeta intenso, mientras que las Gram negativas
pierden el color violeta con el agente decolorante
que ente caso es el alcohol-acetona, y luego
toman un color rojo al teirse con la safranina que
se le agrega al final de la experiencia. [2].

Se debe resaltar que las Gram positivas poseen
una capa gruesa de peptidoglucano o murena y
carecen de membrana externa, al tener una capa
gruesa de peptidoglucano resisten a la
decoloracin, mientras que las Gram negativas
poseen una membrana externa y menor cantidad
de peptidoglucano [4], lo cual hace que se
Figura 3 (Izquierda) y Figura 4 (derecha). Muestras de colonias bacterianas de la muestra de
suelo utilizando tincin Gram observadas a 1000X
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optimice la retencin del colorante cristal violeta.
Algunas bacterias se clasifican como Gram
inciertas o variables debido a que
simultneamente presentan tincin de Gram
positivas y de Gram negativas debido a que tienen
paredes cerosas o con alto contenido lipdico.
Por otro lado podemos observar otras
caractersticas que resaltan fcilmente, como por
ejemplo la morfologa de estas: bacilos delgados y
cortos, con disposiciones rectas y en algunos
casos semi-curvados, unidos unos a otros
formando cadenas, no hay evidencia de flagelos
(Figura 4 y 6).












No hubo presencia de bacterias del tipo gram
negativas en ninguna de las muestras
observadas. Se debe tomar en cuenta el lugar en
donde fueron recolectadas las muestras, que en
este caso se llevo a cabo cerca a una de las
lagunas internas de Villa 1, de la Universidad
Cientfica del Sur.


Coloracin Ziehl-Neelsen

En otra de las experiencias llevadas a cabo en
laboratorio, se observaron muestras de Bacilos
Alcohol cido Resistente(BAAR),
(especficamente del Gnero Mycobacterium
tuberculosis), estas a diferencias de las gram no
se detectarn si se usa el mtodo de tincin gran
(se encuentran en la clasificacin de Gram
Inciertas), es por eso que se tiene que realizar la
tcnica de coloracin de Ziehl-Neelsen para su
identificacin. Estos organismos se caracterizan
por poseer pared celular con abundante cantidad
de lpidos (cerca del 40% del su peso total),
debido a esta caracterstica, normalmente se
encuentran formando colonias hidrfobas de
aspecto ceroso, que son difciles de teir. Estas
caractersticas solo lo poseen los gneros
Mycobactrium y Nocardia.[7]
En las muestras se observaron bacilos alargados
de coloracin roscea, no hay evidencia de que se
encuentren agrupados formando colonias (Figura
5).
REFERENCIAS
1. Aquiguali Ramos M. Prez Chavela M.
Manual de prcticas del laboratorio de
microbiologa. Universidad Autnoma
Metropolitana. Mxico. Unidad 3. 28-32 ppg.
http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/lic
enciatura/diversos/AQUIAHUATL_RAMOS_M
ARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_pract
icas_de.pdf
2. Departamento de microbiologa. Universidad
de Salamanca. (2008). Prcticas de
Figura 6. Muestras de colonias bacterianas,
no hay evidencia de flagelos.
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microbiologa. Salamanca- Espaa. Unidad 1.
5-7 ppg.
http://imb.usal.es/Practicas2/P2/Practicas2.pd
f
3. Garca V. Introduccin a la
microbiologahttp:[Base de datos]. Extrado de
google books:
//books.google.com.pe/books?id=K_ETVnqnM
ZIC&pg=PA47&lpg=PA47&dq=gram+positiva
+y+negativo&source=bl&ots=ZfunyojLXn&sig
=2eF0UqYLi7p7Lwkl8D22Sp04C8k&hl=es&sa
=X&ei=PaBCUPLlD4qm8ASl_IHYDw&ved=0
CDQQ6AEwAQ#v=onepage&q=gram%20posi
tiva%20y%20negativo&f=false
4. Gamboa M, Garca J, Hernndez F,
Rodriguez E. (2005).Bacteriologia general,
principios y prcticas de laboratorio. Editorial
Universidad de Costa Rica,465pp (63-64
).[Base de dato] [ disponibles en
http://books.google.com.pe/books?id=vwB0fgi
rgN0C&printsec=frontcover&hl=es&source=gb
s_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=fal
se
5. Laboratorio de Microbiologa. Instrumentacin
y principios bsicos. Mtodos de siembra.
Cuba. http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-
bin/library?e=d-00000-00---off-0prelicin--00-0-
---0-10-0---0---0direct-10---4-------0-0l--11-0-
50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-0gbk-
00&cl=CL3.3&d=HASH01ebc63ab80c0bbb5a
17ddab.20.4&hl=1&gc=0&gt=0
6. Laboratorio de microbiologa. Universidad
Cesar Vallejo. Lima- Per. Unidad 6. 9-11
ppg.
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facult
ad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C3
%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf
7. Olivas Evangelina. Manual de prcticas de
Microbiologa I y II y Parasitologia. Evangelina
Olivas. Universidad autnoma de ciudad de
Jurez. Instituto de ciencias biomdicas de
microbiologa y parasitologa. Departamento
de ciencias bsicas. Mexico (pag 33). [ base
de dato]. [disponible en :
http://books.google.com.pe/books?id=q1gALT
KvynsC&pg=PA17&lpg=PA17&dq=Bacterias+
alcohol+acidorresistentes&source=bl&ots=Ud
1z1jhgof&sig=RSMiluPM5VkBxmHoQH2yHtA
Ur3E&hl=es&sa=X&ei=6qZCUPaDDJHU8wS
Bl4G4BQ&ved=0CDAQ6AEwAQ]
8. Peas Parrilla M. (2008-2009). Microbiologa
Clnica (Guin de prcticas). Espaa. 2-3 ppg.
www.unavarra.es/genmic/microclinica/practica
s.pdf
9. Sridhar Rao P. Microbiology notes. Dept. of
microbiology JJMMC, DAVANGERE. 1ppg
http://www.microrao.com/micronotes/acidfast.
htm
10. Surgical pathology - histology. staining
manual microorganism. 1-2ppg.
http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHT
ML/MANUALS/AFB.PDF