Guía de Práctica de Microbiología Acuática

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
GUÍA DE PRÁCTICA
DE
MICROBIOLOGÍA ACUÁTICA
Dra. Olga V. Francia Arana

Docente Principal a D.E
Dra. Olga Francia Arana Guía de Práctica de Microbiología Acuática 2
ÍNDICE
Práctica N°1: Materiales y Equipos de Laboratorio ...........................................................................................................................3

Práctica N°2: Selección de lugares de muestreo y toma de muestra ................................................................................................7
Práctica N°3: Aislamiento e Identificación de Cianobacterias, Bacterias Púrpuras, Bacterias verdes: Columna de Winograsky ....12
Práctica N°4: Recuento de Bacterias Heterótrofas de aguas continentales ....................................................................................18
Práctica N°5: Colimetría Presuntiva y confirmativa de coliformes Totales y Termotolerantes .......................................................21
Práctica N°6: Test Presencia-Ausencia (P-A) para Indicadores de contaminación fecal: Coliformes y Enterococos .......................25
Práctica N°7: Recuento de Clostridios sulfitos reductores de agua de pozos: Método de los Tubos Múltiples ..............................28
Práctica N°8: Aislamiento y numeración de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus de aguas de piscina ..................32
Práctica N°9: Investigación de bacterias y hongos patógenos en agua de consumo humano ........................................................36
Práctica N°10: Investigación de la calidad del agua del efluente de las lagunas de estabilización .................................................39
Práctica N°11: Remoción de Coliformes de aguas residuales en las Lagunas de Estabilización ......................................................42
Práctica N°12: Lagunas de Estabilización de San José-Lambayeque ...............................................................................................45
Práctica N°13: Los métodos de tratamiento secundario de las aguas residuales ...........................................................................47
Práctica N°1: Materiales y Equipos de Laboratorio
Introducción
Para el desarrollo de las prácticas de la asignatura de Microbiología Acuática, se necesita
materiales y equipos de laboratorio que permitan cumplir con los protocolos estandarizados y
legales y así obtener resultados que reflejen la calidad del agua procesada.
Los alumnos deben seleccionar los necesarios para la ejecución de las prácticas del conjunto de
materiales y equipos existentes en el laboratorio y así cumplir con el objetivo
La práctica pretende alcanzar los objetivos siguientes:
 Manejar adecuadamente los materiales de vidrio y metal, su limpieza, acondicionamiento y
esterilización
 Conocer el manejo de los equipos que utilizará en el desarrollo de las prácticas.
Materiales de vidrio
Placas Petri Láminas Pipetas
Tubos de ensayo Matraces Vasos de precipitación

Frasco colector Termómetro Mortero
Materiales de metal y equipos
Mechero Bunsen pHmetro Jarra de Brewer
Contador de colonias Gradilla para pipetas Gradilla para tubos
Cámara de Flujo laminar Estufa Refrigeradora

Balanza analítica Balanza analítica
Otros Materiales
Cucharas y espátulas Pipeteador manual Espátula de Drigalsky
Botellas muestreadoras⃰
Botella Niskin Botella Kenmerer Botella Nansen
⃰Sólo para conocimiento de alumnos de la asignatura para que elabores una botella artesanalmente
Tarea
1. Presentar el informe de práctica

2. Realice la descripción de los materiales y equipos que utilizará en cada práctica.
3. Diga ¿por qué es importante el conocimiento de los materiales y equipos de laboratorio?
4. Diseñe una botella muestreadora. Describa la botella que diseña.
5. ¿Qué tipo de muestra le permitirá tomar su diseño de botella?. Porque
6. ¿Para qué se utiliza una botella muestreadora?
7. Reporte la bibliografía que consulta
Práctica N°2: Selección de lugares de muestreo y toma de muestra
Introducción
El objetivo del análisis de agua en el laboratorio de Microbiología es evaluar las características
del agua natural superficial o subterránea, agua residual doméstica o industrial, agua tratada,
agua marina, cuyos resultados deben ser de alta calidad, confiabilidad y adecuados al propósito
para el cual fueron solicitados, ya que con base en esta información se toman importantes
decisiones en materia de legislación, medidas de mitigación, control y protección del medio
ambiente, las cuales están regidas por normas y regulaciones de carácter oficial. Las muestras
recolectadas para los análisis deben ser representativas, por lo tanto el muestreo es el aspecto
más importante.
Objetivo de la Práctica
Garantizar que las muestras de agua, tomadas en campo se realicen de forma correcta para
obtener resultados óptimos y confiables.
Provisiones para el muestreo de agua

 Logística
 Mapa de localización de las estaciones.
 Marcadores de tinta indeleble, lapicero, lápiz.
 Cinta de embalaje.
 Cadenas de custodia.
 Cámara digital.
 Muestreo
 Coolers
 Ice pack
 Persevantes
 Frascos de vidrio transparente y/o ámbar
 Frascos de plásticos.
 Piscetas
 Limpieza y eliminación de impurezas

 Agua destilada
 Papel toalla
 Características ambientales
Una vez definido el objeto de estudio (río, lago, laguna, mar, agua residual, etc.) se debe
obtener el mayor número de información posible para delimitar y caracterizar el área de
estudio.
Por medio de la utilización de mapas y fotografías se pueden conseguir informaciones
básicas tales como:
 Área comprendida en la cuenca hidrográfica.
 Tamaño y localización del objeto hidrográfico.
 Informaciones sobre el relieve, vegetación e hidrografía.
 Ocupación del área (agricultura, pecuaria ganadería, industria).
 Datos climatológicos
 Selección de puntos para la recolección de las muestras

 Naciente - curso medio.
 Desembocadura.
 Antes y después de los afluentes.
 En caso de muestras para análisis de consumo humano, el punto de muestreo será en el
lugar exacto de la captación de agua.
 Identificación de la muestra
 Código de muestra
 Fecha y hora de recolección
 Tipo de agua
 Procedencia
 Lugar de recolección
 Nombre del recolector
 Preservación realizada
 Toma de Muestra
 Rotular los frascos, colocar el código de la estación, fecha y hora exacta de toma de
muestra.
 Es importante que la toma de muestras se realice en dirección opuesta al flujo del
recurso hídrico. Se toma primero aguas abajo y después aguas arriba.
 Las muestras de agua de ríos y de arroyos han de extraerse de preferencia de la zona
central del río o de una zona donde fluya el agua, pero sin turbulencia. Se debe de evitar
tomar agua de las márgenes del río ya que allí el agua no está perfectamente mezclada y
puede haber sufrido efectos de evaporación o de contaminación.
 Colocarse los guantes de látex y mascarilla de ser necesario (si la muestra es agua
residual).
 Cuando se trate de cursos que tengan una alta variabilidad de descarga, se deberá
tomar una única muestra en un balde (enjuagado 3 veces) la suficiente cantidad como
para llenar todos los frascos.
 Las muestras para parámetros biológicos se toma directamente sin enjuagar el frasco.
 Preservación de la muestra
El objetivo de la preservación es retardar los cambios químicos y biológicos que continúan
después de que la muestra se retira de su fuente.
Los resultados analíticos son más exactos en la medida que el tiempo transcurrido entre la
recolección de la muestra y su análisis sea menor.
Los métodos de preservación incluyen: control de pH, adición de reactivos, refrigeración y
otros los cuales van a retardar la acción biológica, retardar la hidrólisis de los compuestos
químicos, reducir la volatilidad de los constituyentes y reducir los efectos de absorción.
 Transporte y entrega de la muestra al laboratorio

En el momento de almacenarlas se debe revisar que los recipientes estén correctamente
tapados para evitar posibles derrames. Las muestras deben ser entregadas al laboratorio
correctamente identificadas y lo antes posible después de recolectadas en el transcurso de
24 horas como máximo.
 Recepción de las muestras en el laboratorio

En la recepción se verifica si el recipiente es adecuado para contener la muestra de acuerdo
al tipo de ensayo a realizar. Si el volumen de muestra es el suficiente para la realización de
las pruebas; se verifica si a la muestra se le ha realizado procedimientos de preservación; de
igual forma se revisa que el transporte de la muestra se haya realizado en condiciones
óptimas y en el tiempo requerido, además de ello, el responsable del muestreo deberá
llenar la Cadena de Custodia.
Selección del punto de muestreo en aguas continentales superficiales
La selección del punto de muestreo puede condicionar el muestreo y los resultados analíticos
obtenidos. Se debe tener en cuenta lo siguiente:
 Accesibilidad. El punto de muestreo debe estar en un lugar accesible para que sea posible la
toma de muestras, el transporte de los equipos y material de muestreo.
 Representatividad. El punto de muestreo debe ser lo más representativo posible de las
características generales del cuerpo de agua que se pretende analizar: la masa de agua
debe estar mezclada totalmente; si existiera un vertido, éste debe ser caracterizado en su
totalidad, etc.
 Seguridad. El punto de muestreo, sus alrededores y las condiciones meteorológicas debe
garantizar la seguridad de quien lleva a cabo la toma de muestra: precaución y equipos de
seguridad.
Toma de muestra de agua potable y su conservación
A - Autoridad Nacional del agua B - Toma de Muestra de agua de río

C - Muestras simples o puntuales D - DIGESA: Toma de muestra
Práctica N°3: Aislamiento e Identificación de Cianobacterias, Bacterias Púrpuras,

Bacterias verdes: Columna de Winograsky
Introducción
La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos ocupan
"microespacios" altamente específicos de acuerdo con sus tolerancias medioambientales y sus
necesidades vitales (requerimientos de carbono y energía). Esta columna es un sistema com-
pleto y autónomo de reciclado, mantenido sólo por la energía de la luz.
Es un sistema acuático que permite el establecimiento de los microorganismos en regiones

diferenciadas según su metabolismo y constituye un modelo de ecosistema similar a los tapetes
microbianos que se hallan en aguas dulces o saladas, donde proliferan microorganismos del
medio acuático y de los sedimentos. Permite observar en el laboratorio el proceso evolutivo de
los microorganismos, es decir, el proceso de adaptación a los diferentes ambientes empleando
diferentes estrategias para la obtención de energía.
Una vez que se prepare la columna y se exponga a la luz solar se desarrollará una sucesión de
comunidades bacterianas interrelacionadas metabólicamente, de un modo similar a lo que
ocurre en la naturaleza que se podrán observar fácilmente por su distinta coloración. La
columna es un sistema anóxico en miniatura que puede usarse como suministro a largo plazo
de bacterias para cultivos de enriquecimiento.
Cumplido el tiempo de desarrollo de los microorganismos en la columna, se observa tres zonas:

 Zona Aeróbica, es la más superficial, dispone de una alta concentración de oxígeno
 Zona Microaerófila se ubica inmediatamente debajo de la anterior, con una menor
concentración de oxígeno.
 Zona Anaeróbica, que constituye el lecho de lodo.
Las algas y cianobacterias forman una capa superficial de color verde brillante, y al producir
oxígeno ayudan a mantener la aerobiosis en la zona superior de la columna, mientras que, en el
fondo de la columna las bacterias reductoras del sulfato producen sulfuro, que permite el
crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre (fotótrofos anoxigénicos). De modo que se
establecen dos gradientes en la columna, uno de oxígeno y otro de sulfuro de hidrógeno (H2S).
Las bacterias quimiorganótrofas crecen a lo largo de toda la columna, los microorganismos

aerobios y microaerófilos en la parte superior y los anaerobios en las zonas donde hay sulfuro
de hidrógeno (Fig. 1 y 2).
Fig. 1 Microorganismos que desarrolla en la

Columna de Winograky
Fig. 2 Actividad metabólica de los microorganismos en las zonas de crecimiento en la

Columna de Winograsky
Elaborar una columna de Winograsky
Materiales
 Probeta de 100 ml no graduado o tubo de 20 cm de altura por 3 cm de ancho

 Mortero y pilón
 Láminas y laminillas
 Frascos pequeños
 Bagueta
Reactivos
 Bicarbonato de calcio
 Sulfato de calcio
7
Otros materiales
 Hojas de vegetales triturados
 Papel periódico remojado
 Yema de Huevo
 Aserrín fino
 Insectos muertos y deshidratados, triturados de preferencia las alas
 Lodo residual en un frasco colector
 Agua residual en un frasco colector
 Plumón negro
 Vaselina líquida
 Pabilo
Procedimiento
Preparación del lodo enriquecido
 En un mortero triturar una porción de papel periódico remojado, añadir luego una porción
de aserrín y mezclar
 Adicionar una porción de hojas secas, una porción de alas de insectos, la yema de huevo
cocido y triturar hasta formar una masa suave.
 Adicionar poco a poco el lodo residual y seguir triturando hasta que quede un lodo con una
consistencia suave.
 Adicionar los reactivos CaCO3 y Ca2SO4 para mantener un pH apropiado y darle efecto
reductor, luego agregar un poco de extracto de carne. Mezclar todos los ingredientes hasta
observar una masa suave.
Llenado del tubo

 Llenar el tubo o probeta hasta 1/3 con el lodo enriquecido.
 Inmediatamente colocar en el tubo lodo no enriquecido hasta completar 2 cm de altura,

evitar la formación de burbujas.
 Llenar hasta 2/3 del tubo con agua residual.
 Disolver vaselina y poner una capa de 2cm evitando formar burbujas.
 Tapar con papel aluminio y amarrar hasta que quede el tubo o probeta completamente
sellado
Incubación
 Colocar el tubo en un ambiente con luz solar o en un ambiente con luz artificial por el
tiempo necesario para el crecimiento de los microorganismos (Una o más semanas)
 Describir los cambios que se observa, tomar muestras y observar microscópicamente.
Fig. 3. Columna de Winograsky
Tarea
Elaborar el Informe de Práctica y tener en cuenta las indicaciones siguientes:

Introducción
Indique la importancia y los objetivos
Material y Métodos
Esquematice o presente fotografías, con explicación del mismo. Redacte la metodología
Resultados
Los resultados obtenidos deben ser registrados en tablas. Interpretar las tablas
Interpretación
Interpretar los resultados
Conclusiones
Las conclusiones deben ser puntuales relacionados a los objetivos y resultados

Recomendaciones
Están relacionados con los resultados que obtenga
Bibliografía
Tener en cuenta las normas para presentar la bibliografía
Cuestionario
Responder las siguientes preguntas:
1. ¿Qué sustancias químicas puede reconocer en la columna de Winograsky producto del
metabolismo de las bacterias? ¿Cuáles son sus características que le permite
reconocerlas?
2. Cuáles son las zonas que se forman en la columna de Winograsky que prepararon
luego de un tiempo de incubación? Explique
3. ¿Qué importancia tiene la Columna de Winograsky?
4. ¿Qué microorganismos desarrollan en las zonas que se forma en la columna de
Winograsky?. ¿Qué función desempeñan?
Práctica N°4: Recuento de Bacterias Heterótrofas de aguas continentales
Introducción
Las Bacterias Heterótrofas, son un grupo de microorganismos, que utilizan el carbono orgánico
como fuente única de energía y carbono. La medición de bacterias heterótrofas en el agua
potable puede proporcionar información útil a los operadores de plantas de agua, ingenieros
sanitarios, supervisores de la calidad del agua y analistas de laboratorios.
Durante el tratamiento la densidad bacteriana varía y en la red de distribución se puede

monitorear el deterioro de la calidad a través de los métodos de recuento heterotrófico en
placas (RHP). La aplicación constante del método de RHP seleccionado proporcionará datos
básicos para evaluar cambios en la calidad bacteriana del agua potable.
El recuento de heterótrofos en placas (RHP) es un procedimiento sencillo que se puede realizar

por el método de placa fluida, difusa o filtración por membrana (FM) y es una herramienta muy
útil. Aunque no es esencial para evaluar la seguridad del agua potable, los resultados del RHP
proporcionan información que complementa los resultados de los Coliformes Totales.
El RHP se puede usar para indicar la composición bacteriana general del agua de la fuente y la
eficacia y eficiencia de los procesos de tratamiento, como la sedimentación, coagulación,
filtración y cloración. Además puede proporcionar información sobre limpieza del sistema de
distribución, desarrollo de bacterias después del tratamiento, efecto de los cambios de la
temperatura del agua y del cloro residual.
Objetivos de la Práctica
 Hacer el recuento de microorganismos aerobios en el agua de consumo humano
 Interpretar con la legislación la calidad de agua que consume la población
Materiales
 Agar Plate Count o agar de recuento calentado y enfriado a 50°C
 Placas Petri de 100 mm de diámetro
 Pipetas de 1 ml y 10 ml
 Probeta de 100 ml
 Marcador de vidrio
 Tubos de 150 o 160 mm con tapa de rosca (video)
Procedimiento
 Rotular las placas, pipetas y tubos con las diluciones respectivas.
 Preparar las diluciones de la muestra: 10-1, 10-2, 10-3 y 10 -4 con agua destilada o solución
salina fisiológica.
 Pipetear un ml de cada dilución y dejar en las placas rotuladas con la dilución
correspondiente (Utilizar el doble de placas para cada dilución).
 Adicionar 15 o 20 ml del medio de cultivo. Homogenizar cuidadosamente con movimientos
de las placas sobre la mesa en diferentes direcciones.
 Dejar enfriar e invertir las placas
 Incubar a 30 y 37°C (Una placa para cada temperatura) durante 24 y 48 horas
 Contar las colonias, (marcando cada colonia contada)
 Registrar los conteos para hacer los cálculos correspondientes. Número de colonias por la
dilución correspondiente y sacar el promedio de los dos crecimientos reportando: UFC/ml
Fig. 1. Recuento de colonias de bacterias heterótrofas de agua (diluciones 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5)
Fig. 2. Método de recuento de bacterias heterótrofas de muestra de agua
Tarea
 Presentar el informe de Práctica

 Hacer un diagrama de flujo del procedimiento para determinar el número de bacterias
heterótrofas
 Los datos cuantitativos de una muestra deben ser investigados bibliográficamente y
colocados en tablas de resultados (Con título y analizado correctamente)
 Para la interpretación debe utilizar la ley de aguas y otras legislaciones que le permita
discutir los resultados. Reportar conclusiones y bibliografía
 Cuestionario:
¿Cuáles son las características de las bacterias Heterótrofas?
¿Cuáles son los valores que representan un peligro para la salud humana cuando se toma
agua contaminada?
¿Porque es importante en el agua la determinación de heterótrofos?
Práctica N°5: Colimetría Presuntiva y confirmativa de coliformes Totales y

Termotolerantes
Introducción
Los Coliformes son indicadores de contaminación del agua. La determinación y
concentración de estas bacterias en el agua es una herramienta de control indispensable
para conocer su calidad.
La detección y enumeración de Coliformes como indicadores bacterianos de contaminación
de las aguas garantiza la aplicación de un sistema de vigilancia, teniendo en cuenta los
perjuicios a la salud que pueden provocar el resto de los agentes patógenos implicados en
la transmisión hídrica, de esta manera aporta elementos importantes para minimizar
futuras contaminaciones del agua.
La Colimetría es el índice de contaminación fecal de las aguas, medida por el número de
bacterias del grupo Coliforme, Totales o Termotolerantes (E. coli).
1. Determinar el número de Coliformes Totales y Termotolerantes, utilizando el método del
número más probable (NMP)
2. Identificar bioquímicamente a Escherichia coli
Materiales
La determinación de Coliformes Totales se hará en dos etapas y se utilizará:
 Muestra de agua, obtenida siguiendo los requisitos de toma de muestra, conservación
y transporte.
 Tubos para diluciones si fuera el caso
Prueba presuntiva
 15 tubos con tapa de rosca de 150 mm por 15 mm, con campana de Durham rotulados
convenientemente. Con el método de los tubos múltiples (NMP) serie cinco, los tubos
serán distribuidos, 5 tubos para cada una de las tres diluciones que se utilice con 10
ml del medio de cultivo líquido Lauril Sulfato Triptosa.
Prueba confirmativa
 Tubos de 150 mm por 15 mm con campana de Durham conteniendo el medio, caldo
verde brillante bilis o confirmar en placa con agar ENDO
La determinación de Coliformes termotolerantes, requiere los siguientes materiales:
 Tubos con tapa de rosca de 150 mm por 15 mm con campana de Durham conteniendo
el medio EC (10 ml cada tubo), rotulados con la dilución del tubo que dio gas positivo
en la prueba presuntiva)
Para la identificación de E. coli, se utilizará:
 Tubos con caldo peptona para la prueba del indol
 Tubos con caldo glucosado para las pruebas de RM-PV
 Tubos con agar citrato para determinar utilización del citrato
 Tubos con caldo urea para observar su actividad hidrolítica
Procedimiento
Coliformes Totales
 Inocular los tubos de la primera serie con 10 ml de la muestra, la segunda serie con 1
mm de la muestra y la tercera con 0.1 ml
 Incubar los tubos a la temperatura de 35°C durante 24 horas
 Observar la producción de gas en las campanas de Durham
 Anotar los tubos gas positivos
 Si no se observa gas en algunos tubos, dejar incubar 24 horas más
 Anotar el código por ejemplo: 5 5 5
 Llevar el código a la tabla del número más probable y anotar el valor
Coliformes Termotolerantes
 Sembrar una o dos asadas de los tubos gas positivos en tubos con medio EC
 Incubar a 45°C durante 24 horas
 Registrar los tubos gas positivos
 Coliformes Termotolerantes
 Sembrar una o dos asadas de los tubos gas positivos en tubos con medio EC
 Registrar los tubos gas positivos
Identificación de E. coli
 Los tubos con caldo EC gas positivo, sembrar en placas con agar ENDO
 Evaluar los cultivos. Observar colonias lactosa positiva con brillo metálico.
 Repicar las colonias en tubos con agar tripticasa soya para obtener la cepa
 Realizar la identificación Bioquímica: IMViC, Urea
Fig. 1. Diagrama de NMP de Coliformes Totales, Termotolerantes y E. coli

Tarea
Elaborar el Informe de Práctica y tenga en cuenta las indicaciones siguientes:

Introducción
Material y Métodos
Esquematice o presente fotografías, con explicación del mismo. Redacte la metodología
Resultados
Los resultados obtenidos deben ser registrados en tablas. Interpretar las tablas
Interpretación
Interpretar los resultados obtenidos con la normatividad (Ley de aguas peruana y leyes
internacionales)
Conclusiones
Las conclusiones deben ser puntuales relacionados a los objetivos y resultados
Recomendaciones
Están relacionados con los resultados que obtenga
Bibliografía
Tener en cuenta las normas para presentar la bibliografía
Cuestionario
1. Diga los valores normales de Coliformes Totales y Termotolerantes del agua potable de
consumo humano; de río, lago o laguna y playas, en una tabla. Interprete. Con la
legislación peruana
Práctica N°6: Test Presencia-Ausencia (P-A) para Indicadores de

contaminación fecal: Coliformes y Enterococos
Introducción
El método Presencia/Ausencia es mucho más sensible (tienen muchos menos falsos
negativos) que el método de membrana filtrante, pero es menos específico (tienen más
falsos positivos). Por ello, es tan útil como screening negativo, para poder procesar un gran
número de muestras. Si el kit da negativo, el resultado es negativo. Pero si el kit sale
positivo, hay que confirmar esa muestra aislando en placa e identificando colonias aisladas.
El método de presencia-ausencia, es una simplificación del test de NMP y puede ser usado
como base cualitativa de otros indicadores: Clostridios, Pseudomonas, Coliformes Termo-
tolerantes, enterococos. En el caso de Coliformes consta de una fase presuntiva donde se
siembran 100ml de muestra de caldo P/A (triple concentrado), luego de la incubación a
35°C por 24 a 48 horas, las condiciones de acidez por fermentación de la lactosa da un
color amarillo distintivo y por agitación el gas produce espuma.
El método de Presencia-Ausencia de coliformes es cualitativo y utiliza mayor volumen de

muestra, característica que lo diferencia del método del NMP.
Determinar la presencia o ausencia de Coliformes totales, Termotolerantes y Enterococos
de aguas de consumo humano
Materiales
 Un frasco con 25 ml de medio P-A triple concentrado con campana de Durham y tapa
de rosca
 Un tubo de 150 x 15 mm con caldo verde brillante bilis con campana de Durham
 Un tubo de 150 x 15 mm con caldo EC con campana de Durham
 Un tubo de 150 x 15 mm con caldo Enterococo

 Probeta de 100 ml esterilizada
 Pipeta de 10 y 1 ml
 Marcador de vidrio
Procedimiento
 Medir 75 ml de muestra de agua, llevar al frasco con medio P-A triple concentrado
 Homogenizar, tapar e incubar a 35°C durante 24 a 48 horas en aerobiosis
 Evaluar el crecimiento y producción de gas
 Registrar el resultado
Confirmar el resultado:
 Sembrar una o dos asadas en el tubo con caldo verde brillante bilis. Incubar a 35°C
durante 24 horas
 Observar producción de gas, quedando confirmado el resultado de presencia de
coliformes totales
 Sembrar una o dos asadas en el tubo con caldo EC. Incubar a 45°C durante 24 horas
 Observar producción de gas en la campana. Confirma presencia de coliformes
termotolerantes
 Sembrar una o dos asadas de P-A positivo en un tubo con caldo enterococo. Incubar a
37°C durante 24 a 48 horas.
 Observar precipitado negruzco o grisáceo que indica presencia de enterococos. Hacer
tinción de Gram para confirmar.
Fig. 1. Método de Presencia-ausencia de Coliformes en agua

Tarea
 Hacer el informe de Práctica

Introducción
Material y Métodos
Esquematice o presente fotografías, con explicación del mismo
Resultados
Utilizar Tabla con datos de una muestra procesada y luego interprete esos resultados
Interpretación
Utiliza la normativa para la interpretación de los resultados
Conclusiones
Debe, referirse a los objetivos o competencias alcanzados
Recomendaciones
Se refiere a la calidad del agua
Bibliografía
Cuestionario
1. ¿En qué aspectos se diferencia este método con el método del NMP?
2. ¿Qué características observa en el video cuando los resultados de P-A son
positivos?
3. Cuáles son las ventajas del método de presencia-ausencia.
Práctica N°7: Recuento de Clostridium sulfito reductores de agua de

pozos: Método de los Tubos Múltiples
Introducción
Las bacterias sulfito reductoras son microorganismos de morfología bacilar, Gram positivos,
anaerobias estrictos, capaces de formar esporas y tienen la capacidad de reducir los sulfatos a
sulfuro. Las especies del género Clostridium tienen una supervivencia mucho mayor que
cualquier otro indicador bacteriano de contaminación fecal debido a su capacidad
formadora de esporas.
Si se evidencian simultáneamente coliformes y Clostridium es evidente el origen fecal

de la contaminación. Si sólo se detectara Clostridiium indicaría una contaminación fecal remo-
ta. El género Clostridium, no dispone de sistemas citocrómicos ni de los mecanismos de
fosforilación para el sistema de transporte de electrones (indicativos de un sistema aeróbico),
por lo que únicamente pueden obtener energía por fosforilación a nivel de sustrato.
Hacer el recuento de colonias Clostridium sulfitos reductores de agua de pozo
Materiales
 Muestra de agua de pozo
 Medio de cultivo: Agar Clostridium o agar SPS
 Tubos de ensayo con tapa de rosca de 150 x 15 mm
 Pipetas de 10 y 1 mm
 Láminas
 Microscopio compuesto
Procedimiento
 20 ml del medio de cultivo para Clostridium doble concentrado, se reparte en cada tubo
de 50 ml de capacidad. En el momento de realizar el análisis, se funde el medio en baño
maría
 Calentar la muestra en baño maría termorregulado a 80°C durante 10 minutos
 Sembrar cada tubo de medio preparado y enfriado hasta 60°C aproximadamente, con
20 ml de la muestra de agua calentada a 80°C.
 Rápidamente, se homogeniza, se enfría y se incuba en anaerobiosis a 37°C durante 48
horas.
 Al cabo de este tiempo de incubación se hace la evaluación de los tubos.
 El crecimiento de colonias negras en el medio de cultivo caracteriza al género
Clostridium
Fig. 1. Procedimiento para hacer el recuento de colonias de Clastridium sulfito reductor

Fig. 2. Desarrollo de colonias negras de Clostridium sulfito reductor en medio sólido SPS en tubo y en TSC
más yema de huevo en placa
Fig. 3. Morfología microscópica de Clostridium pergringens

Tarea

Introducción
Material y Métodos
Resultados
Interpretación
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Cuestionario
1. ¿Porque es importante el análisis microbiológico de Clostridium sulfito reductor en
aguas? Fundamente.
2. ¿Qué características del cultivo y de la morfología microscópica le permite reconocer
a este grupo de bacterias?
3. Con relación a Clostridium sulfito reductor, ¿Qué método de análisis microbiológico
es el más indicado para determinar la calidad del agua de consumo? ¿Por qué?
Práctica N°8: Aislamiento y numeración de Pseudomonas aeruginosa y

Staphylococcus aureus de aguas de piscina
Introducción
Las piscinas, constituyen establecimientos públicos y privados, que deben ser monitoreados y
evaluados por entes gubernamentales para preservar la salud pública, ya que todos los
elementos que se conjugan suponen un riesgo potencial para el bienestar de los bañistas,
aumentado cada día más por el uso masivo de estas instalaciones.
Las Pseudomonas son bacilos Gram negativos, aerobios, oxidasa positiva que gracias a su
metabolismo tienen diferentes hábitats que le permite utilizar diferentes fuentes de carbono o
nitrógeno para su nutrición y dentro de los cuales se encuentra el agua de piscina. Poseen una
cápsula de exopolisacárido que facilita la adhesión celular, la formación de biopelículas que lo
protege de la fagocitosis o los iones libres formados en la potabilización del agua, aumentando
así su patogenicidad.
Las bacterias del género Staphylococcus, son cocos Gram positivos, anaerobios facultativos,
oxidasa negativo y con metabolismo fermentativo. Los bajos niveles de cloro residual libre (0,3
a 0,5 mg/L) y niveles insatisfactorios de pH no garantizan una desinfección efectiva, lo cual se
ve reflejado en los recuentos altos de estos indicadores.
Analizar la calidad del agua de las piscinas públicas y hacer el recuento de las especies de
Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus
Materiales
 Muestra de agua de piscina tomada a 30 cm por debajo de la superficie, utilizando para la
recolección frascos Schott de 250 ml con tiosulfato de sodio al 10% como conservante de la
muestra
 Tubos con 10 ml de caldo Cetrimide doble concentrado para la primera serie de 3 tubos
 6 tubos con 10 ml de caldo Cetrimide concentración simple para la segunda y tercera serie
de 3 tubos
 2 tubos con caldo glucosa
 Tubos de dilución
 Agar Baird Parker para aislamiento de estafilococos
 Materiales para la prueba de coagulasa
 2 tubos con caldo manitol
Procedimiento
Aislamiento y recuento
 Utilizar el número más probable (NMP) serie 3 para Pseudomonas
 Inocular la primera serie de tubos con 10 ml de muestra, la segunda con 1ml y la tercera
con 0.1 ml. Incubar a 35 °C durante 24 a 48 horas en aerobiosis. La pigmentación verde
azulada en la superficie confirma la presencia de P. aeruginosa y la pigmentación verde
amarillenta, la presencia de P. fluorescens. Anotar los tubos positivos y registrar el código
del NMP, el mismo que será comparado con la tabla respectiva.
 Para el aislamiento y recuento de S. aureus, se prepara tres diluciones de la muestra: 10-1,
10-2 y 10-3 luego, se inocula las placas con 1ml de la dilución de la muestra, se vierte el
medio de cultivo. Se incuba a 37 °C durante 24 horas. Las colonias negras, brillantes, con
morfología característica corresponden a S. aureus. Se hace el recuento de las colonias
características y se multiplica por el factor de dilución correspondiente.
Fig. 1. Piscina pública contaminada con Pseudomonas aeruginosa (A) y S. aureus (B)
Tarea

Introducción
Material y Métodos
Resultados
Interpretación
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Cuestionario
1. Existen tres pruebas que permite identificar a S. aureus. ¿Cuáles son esas pruebas?
Indique porque
2. Que características del microorganismo puede utilizar para afirmar que el agua de
piscina está contaminada con Pseudomonas aeruginosa.
Práctica N°9: Investigación de bacterias y hongos patógenos en agua de

consumo humano
Introducción
El agua de consumo humano puede estar expuesta a contaminación microbiana con aguas
residuales o con excretas del hombre y de los animales. Si la contaminación es reciente y se
haya microorganismos patógenos, es posible que dichos microorganismos se encuentren vivos
y puedan producir enfermedad. Para controlar estos peligros se aplican criterios (guías y
estandares) para normar la calidad de las aguas para consumo.
Los indicadores de calidad del agua como recuento de heterótrofos y coliformes no garantizan
que el agua esté exenta de riesgo para la salud. Este riesgo puede deberse a una mayor
capacidad de supervivencia de los microorganismos patógenos por su mayor resistencia a las
concentraciones del cloro residual empleado en la potabilización del agua.
 Investigar la presencia de bacterias y hongos patógenos en el agua de consumo humano
 Determinar la calidad sanitaria del agua de consumo
Materiales
 Medios de cultivo: agar Mc Conkey, agar SS, Agar ENDO, Agar Chapman, Agar TCBS, agar
CETRIMIDE, AGAR GSP, agar Sabouraud dextrosa.
 Pipeta de 1 y 10 ml
 Tubos 150 mm con tapa de rosca
 Medios para identificación.
 Láminas y microscopio compuesto
Procedimiento
 En cada frasco colocar 10 ml de medio de cultivo doble concentrado
 Mantener los frascos con los medios de cultivo disueltos a 50°C
 Adicionar 10 ml de muestra de agua
 Homogenizar la mezcla y verter a las placas
 Dejar solidificar e incubar a 37°C durante 24 a 48 horas en aerobiosis
 Realizar la lectura, anotando las características de las colonias
 Hacer el recuento de colonias
 Aislar las colonias características para hacer tinciones y pruebas que permitan identificar la
bacteria u hongo.
A B
C D
Fig. 1. Crecimiento bacteriano en medios sólidos: TCBS, GSP (A), Mc Conkey (B), Cetrimide (C) y agar sangre (D)
Tarea

Introducción
Material y Métodos
Resultados
Interpretación
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Cuestionario
1. ¿Porque se puede encontrar bacterias y hongos en agua de pozo, piscina y en
recipientes (baldes o cilindros) que usted está utilizando?. Explique?
2. Especifique un artículo de la norma técnica que reglamenta la calidad sanitaria del agua
e interprete.
Práctica N°10: Investigación de la calidad del agua del efluente de las lagunas de
estabilización
Introducción
Según METCALF, E. (1996),” las lagunas de estabilización son sistemas de tratamiento para
aguas servidas en las cuales, mediante la acción conjunta de algas, bacterias y otros
organismos, se logra la estabilización biológica de materia orgánica biodegradable presente”.
El tratamiento de las aguas residuales a través de lagunas consiste en reducir el contenido de

sólidos suspendidos por sedimentación, satisfacer la demanda bioquímica de oxígeno,
estabilizar los compuestos orgánicos biodegradables y reducir el número de organismos
patógenos.
.
Para algunos autores el objetivo básico del tratamiento de AR es proteger la salud, promover el
bienestar de las personas y proteger el ambiente. Para otros autores, el objetivo es modificar
las características del agua de tal forma que el efluente tratado cumpla con los requisitos
especificados en la legislación, para ser vertido en un cuerpo receptor sin causar impactos
adversos en el ecosistema o pueda ser reutilizado en otras actividades.
Investigar la presencia de bacterias y hongos en el agua residual del efluente de las lagunas de
estabilización de San José-Lambayeque.
Materiales
 Muestra: agua residual del efluente de las lagunas de estabilización de San José-
Lambayeque.
 Tubos de centrífuga
 Placas con medio de cultivo: Agar TCBS, agar ENDO, agar Mc Conkey, agar manitol salado
(AMS), agar Cetrimide, agar GSP, agar Sabouraud
 Instrumentos de siembra
 Materiales para identificación
Procedimiento
 Centrifugar la muestra a 4000 rpm, eliminar sobrenadante y dejar sólo el sedimento
 Sembrar una asada del sedimento en placas con los medios sólidos, utilizando el método del
agotamiento y estría
 Incubar las placas invertidas a 37°C con excepción de la placa de agar Sabouraud, que debe
ser incubada la placa derecha a 35°C durante 24 a 48 horas en ambiente aeróbico.
 Evaluar el crecimiento de las bacterias y hongos. Esquematizar, describir y comparar
Aguas residuales de efluente en Perú Beneficios del reúso del

efluente
Tarea

Introducción
Material y Métodos
Resultados
Interpretación
Conclusiones

Recomendaciones
Bibliografía
Cuestionario
1. ¿A qué se debe la presencia de microorganismos en el agua residual del efluente?. Diga
por lo menos tres razones
2. ¿Cuáles son las consecuencias de un efluente con microorganismos patógenos? Expli-
que.
Práctica N°11: Remoción de Coliformes de aguas residuales en las Lagunas

de Estabilización
Introducción
Las aguas residuales son cualquier tipo de agua cuya calidad es afectada negativamente
por influencia antropogénica. Incluyen las aguas usadas, domésticas, urbanas y los
residuos líquidos industriales o mineros eliminados, o las aguas que se mezclan con las
anteriores
La descarga de aguas residuales sin tratamiento provoca la contaminación de los cuerpos

de agua receptores disminuyendo la calidad de las aguas superficiales y subterráneas,
poniendo en riesgo la salud de la población y la integridad de los ecosistemas.
La descarga de aguas residuales de origen urbano proviene de viviendas, edificios públicos

y de la escorrentía urbana que se colecta en el drenaje. Sus principales contaminantes son
el nitrógeno y fósforo, compuestos orgánicos, bacterias coliformes fecales, materia
orgánica, entre muchos otros (Jiménez, et al., 2010).
Para la remoción de los contaminantes en las aguas residuales municipales existen diversos
procesos de tratamiento. En el departamento de Lambayeque, la remoción se realiza a
través del sistema de lagunas y se busca la remoción de coliformes.
Determinar el porcentaje de remoción de coliformes en las lagunas de estabilización de San
José.
Materiales
 Muestra de agua residual del afluente (entrada al sistema) y muestra de AR del
efluente (salida del sistema)
 Tubos de dilución de 150 mm de largo por 15 mm de ancho para las diluciones

respectivas
 Tres series de 5 tubos de 150 mm con tapa de rosca y campana de Durham, con 10 ml
de caldo Lauril Sulfato Triptosa para el afluente y tres series de 3 tubos cada una con
campana de Durham y caldo Lauril Sulfato Triptosa para el efluente
 Placas con agar ENDO para confirmar.
 Tubos de 150 mm con tapa de rosca y campana de Durham, con 10 ml de caldo EC
para determinación de Coliformes Termo tolerantes.
Procedimiento
 Preparar 5 diluciones de la muestra de AR del afluente: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
 Aplicar el método del NMP serie 5, utilizando un ml de las tres últimas diluciones para
inocular los tubos de las tres series.
 Aplicar el método del NMP serie 3 para el AR del efluente. Preparar 3 diluciones: 10-1,
10-2 y 10-3 Inocular las tres series de tubos que contiene el medio de cultivo. Con la
primera dilución, la primera serie, con la segunda dilución, la segunda serie de tubos y
con la tercera dilución la tercera serie.
 Homogenizar convenientemente, facilitando la mezcla del inóculo con el medio de
cultivo.
 Incubar a 35°C en aerobiosis durante 24 y 48 horas
 Hacer la lectura, el número de tubos con producción de gas. Representar el código del
NMP
 Leer en la tabla del NMP la equivalencia del código y anotar como número de Colifor-
mes Totales.
 Confirmar el NMP, sembrando en placas con agar Endo, incubar a 35°C, y observar colo-
nias lactosa positivas con brillo metálico
 Determinar ColiformesTermotolerantes, inoculando 1.0 ml de los tubos gas positivos, en
tubos con caldo EC, homogenizar. Incubar a 45°C durante 24 horas. Hacer la lectura:
Tubos con gas en la campana de Durham son positivos para CTT. Anotar el código y
llevar a la tabla del NMP
 Anotar los resultados
 Aplicar la fórmula para determinar la remoción de coliformes (A: afluente, E: efluente)

R (%) = A – E/A x 100
Tarea

Introducción
Indique la importancia y las competencias
Material y Métodos
Resultados
Interpretación
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Cuestionario
1. ¿Qué otros métodos de tratamiento de aguas residuales se aplican?. Describa los
métodos y establezca diferencias con el del sistema de lagunas en cuanto a eficiencia,
tiempo de remoción, economía, etc
2. ¿Cuál es el porcentaje de remoción en el sistema de lagunas y que significa?
Práctica N°12: Lagunas de Estabilización de San José-Lambayeque
Introducción
Es un conjunto de lagunas, donde se lleva a cabo de manera natural el tratamiento de las aguas
residuales. Están constituidas por excavaciones poco profundas de forma rectangular o
cuadrada. Tienen como objetivo:
 Remover la materia orgánica que ocasiona la contaminación.
 Eliminar microorganismos patógenos que representan un grave peligro para la salud,
 Utilizar su efluente para reutilización, en la agricultura
La eficiencia del tratamiento del agua residual por el sistema de lagunas depende de las
condiciones climáticas de la zona, temperatura, radiación solar, frecuencia, fuerza de los
vientos locales y factores que afectan directamente a la biología del sistema.
 Conocer las lagunas de estabilización de San José para observar el funcionamiento y
diferencias según su función.
Tarea

Introducción
Material y Métodos
Resultados
Interpretación
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Cuestionario
• Hacer una descripción detallada de los tipos de laguna y la función que desempeñan.
 Indicar la eficiencia en el tratamiento de las aguas residuales por el sistema de lagunas.
 Explicar los procesos biológicos más importantes que se producen en las lagunas.
Práctica N°13: Los métodos de tratamiento secundario de las aguas residuales
Introducción
El tratamiento secundario de depuración de las aguas residuales constituye una serie de
procesos de naturaleza biológica que tienen en común la utilización de microorganismos
principalmente, bacterias, que llevan a cabo la eliminación de materia orgánica biodegradable,
tanto coloidal como disuelta, así como la eliminación de compuestos que contienen elementos
químicos como N y P.
En la mayor parte de los casos, la materia orgánica constituye la fuente de energía y de
carbono que necesitan los microorganismos para su crecimiento, además, también es necesaria
la presencia de nutrientes, que contengan los elementos esenciales para el crecimiento,
especialmente los compuestos que contengan N y P, y por último, en el caso de sistema
aerobio, la presencia de oxígeno disuelto en el agua. Este último aspecto es fundamental para
elegir el proceso biológico más conveniente.
Los procesos aerobios se basan en la eliminación de los contaminantes orgánicos por su
transformación en biomasa bacteriana, CO2 y H2O y Los procesos anaerobios transforman la
sustancia orgánica en biogás, mezcla de metano y CO2
Entre los procesos más conocidos figuran:
 Lechos bacterianos o filtro por goteo
 Biodiscos y Biocilindros
 Fangos activos o lodos activados
 Reactores discontinuos secuenciales (SBR)
 Filtros verdes
 Digestión anaerobia
 Reactor biológico de membrana (MBR)
 Electrocoagulación
 Electro oxidación
Establecer diferencias entre los métodos aerobios de tratamiento secundario
Tarea

Introducción
Material y Métodos
Resultados
Interpretación
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Cuestionario
¿Cuál es el nivel de eficiencia en el tratamiento de las aguas residuales de los sistemas:
Filtro por goteo, lodos activados y lagunas? ¿Porque?

Guía de Práctica de Microbiología Acuática

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Guía de Práctica de Microbiología Acuática

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dra. Olga V. Francia Arana

Práctica N°1: Materiales y Equipos de Laboratorio ...........................................................................................................................3

Práctica N°1: Materiales y Equipos de Laboratorio

Placas Petri Láminas Pipetas

Tubos de ensayo Matraces Vasos de precipitación

Frasco colector Termómetro Mortero

Materiales de metal y equipos

Mechero Bunsen pHmetro Jarra de Brewer

Contador de colonias Gradilla para pipetas Gradilla para tubos

Cámara de Flujo laminar Estufa Refrigeradora

Balanza analítica Balanza analítica

Cucharas y espátulas Pipeteador manual Espátula de Drigalsky

Botella Niskin Botella Kenmerer Botella Nansen

1. Presentar el informe de práctica

Práctica N°2: Selección de lugares de muestreo y toma de muestra

Provisiones para el muestreo de agua

 Limpieza y eliminación de impurezas

 Selección de puntos para la recolección de las muestras

 Transporte y entrega de la muestra al laboratorio

 Recepción de las muestras en el laboratorio

Selección del punto de muestreo en aguas continentales superficiales

Toma de muestra de agua potable y su conservación

A - Autoridad Nacional del agua B - Toma de Muestra de agua de río

Práctica N°3: Aislamiento e Identificación de Cianobacterias, Bacterias Púrpuras,

Es un sistema acuático que permite el establecimiento de los microorganismos en regiones

Cumplido el tiempo de desarrollo de los microorganismos en la columna, se observa tres zonas:

Las bacterias quimiorganótrofas crecen a lo largo de toda la columna, los microorganismos

Fig. 1 Microorganismos que desarrolla en la

Fig. 2 Actividad metabólica de los microorganismos en las zonas de crecimiento en la

Elaborar una columna de Winograsky

 Probeta de 100 ml no graduado o tubo de 20 cm de altura por 3 cm de ancho

Llenado del tubo

 Inmediatamente colocar en el tubo lodo no enriquecido hasta completar 2 cm de altura,

Fig. 3. Columna de Winograsky

Elaborar el Informe de Práctica y tener en cuenta las indicaciones siguientes:

Las conclusiones deben ser puntuales relacionados a los objetivos y resultados

Práctica N°4: Recuento de Bacterias Heterótrofas de aguas continentales

Durante el tratamiento la densidad bacteriana varía y en la red de distribución se puede

El recuento de heterótrofos en placas (RHP) es un procedimiento sencillo que se puede realizar

Fig. 2. Método de recuento de bacterias heterótrofas de muestra de agua

 Presentar el informe de Práctica

Práctica N°5: Colimetría Presuntiva y confirmativa de coliformes Totales y

 Registrar los tubos gas positivos

Fig. 1. Diagrama de NMP de Coliformes Totales, Termotolerantes y E. coli

Elaborar el Informe de Práctica y tenga en cuenta las indicaciones siguientes:

Práctica N°6: Test Presencia-Ausencia (P-A) para Indicadores de

El método de Presencia-Ausencia de coliformes es cualitativo y utiliza mayor volumen de

 Un tubo de 150 x 15 mm con caldo Enterococo

Fig. 1. Método de Presencia-ausencia de Coliformes en agua

 Hacer el informe de Práctica

Práctica N°7: Recuento de Clostridium sulfito reductores de agua de

Si se evidencian simultáneamente coliformes y Clostridium es evidente el origen fecal

Fig. 1. Procedimiento para hacer el recuento de colonias de Clastridium sulfito reductor

Fig. 3. Morfología microscópica de Clostridium pergringens

 Hacer el informe de Práctica

Práctica N°8: Aislamiento y numeración de Pseudomonas aeruginosa y

 Hacer el informe de Práctica

Práctica N°9: Investigación de bacterias y hongos patógenos en agua de

 Hacer el informe de Práctica

El tratamiento de las aguas residuales a través de lagunas consiste en reducir el contenido de

 Materiales para identificación