UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO
ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 3

TINCION DIFERENCIAL ÀCIDO-RESISTENTE

Integrantes:

Grupo (día/ hora) : A* Martes de 11am-1 pm

Fecha de la práctica : 3/09/19
Fecha de entrega del informe : 10/09/19

2019-II
 I. INTRODUCCIÓN

La tinción ácido resistente es una tinción diferencial que se utiliza principalmente para
ciertos parásitos y bacterias que tienen un alto contenido de ácidos grasos (ácidos
micolicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) en su pared celular, lo cual les
confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido. (Santambrosio, 2009)

Los microbiólogos utilizan esta tinción para identificar a todas las bacterias del género
Mycobacterium, que comprende dos patógenos importantes: Mycobacterium tuberculosis, el
agente causal de la tuberculosis, y Mycobacterium leprae, el agente causal de la lepra.
(Tortora G. J., 2007)

Este tipo método también se utiliza para la diferenciación de estructuras resistentes como
las endoporas, estructuras resistentes capaces de sobrevivir por largos periodos en
ambientes desfavorables permitiendo a los microorganismos sobrevivir hasta que las
condiciones exteriores sean favorables para el desarrollo. Los géneros de bacterias
capaces de esporular hasta ahora descritos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina.
(Stanier, Ingraham, & Wheelis, 1991)

Estructuralmente la endospora está formada por: El córtex o corteza, compuesto por

peptidoglicano. La cubierta está formada por una proteína similar a la queratina con gran
cantidad de puentes disulfuro. El exosporium es de naturaleza lipoprotéica. Asimismo
poseen en su composición química una alta concentración de dipicolinato de calcio.
(Stanier, Ingraham, & Wheelis, 1991)

Existen diversas técnicas para detectar las endosporas, las que más destacan entre ellas
son las técnica de Dorner y la de Schaeffer y Fulton. En esta práctica se harán uso de estas
dos, con la técnica de “Dorner” se apreciará que la espora se tiñe de color rojo, la parte
vegetativa incolora y toda la estructura aparece sobre un fondo oscuro, y con la técnica de
“Schaeffer y Fulton” la espora se tiñe de rojo y la parte vegetativa de verde.

II. OBJETIVOS
- Distinguir a través de dos tecnicas de tincion diferencial la presencia de
endosporas bacterianas.
- Diferenciar las endosporas bacterianas de las estructuras vegetativas
normales.
III. MATERIALES Y MÉTODOS

muestra
-Bacillus sp.
colorantes
-carbolfucsina
-nigrosina
-verde malaquita

otros materiales
-soporte para tinción
-lámina portaobjeto
-asa de kolle
- mechero de alcohol
- aceite de inmersión
-tubo con agua destilada estéril
-pizeta de agua
-alcohol y papel secante
-alcohol
-alcohol-cetona

procedimiento: Técnica de Dorner

1.- en el tubo de ensayo que contiene agua destilada, con la ayuda del asa de kolle
se le agrega un poco de la muestra de bacteria hasta que se forme una suspensión
2.-añada igual volumen de carbolfucsina y coloque en un recipiente con agua
hirviendo por diez minutos para luego transferir una gota de la suspensión en una
lámina portaobjeto

3.-se le agrega una gota de nigrosina y se extiende hasta lograr una película delgada
que luego se secara para que se pueda observar en el microscopio

procedimiento: técnica Schaeffer y Fulton

1.-se prepara una muestra fija de la bacteria en el portaobjeto, para luego agregarle
carbolfucsina y dejar actuar por treinta segundos

2.- con ayuda de una pinza lleve la lámina al mechero hasta que comience a emanar
vapores y mantenga así hasta que la muestra se seque

3.-luego se procede a lavar con alcohol-ácido la lámina para limpiar los restos del
colorante y después se procede a lavar con agua la muestra
 4.-luego cubra la muestra con unas gotas de colorante de verde malaquita dejando
actuar por dos minutos, para luego enjuagar con agua y dejar secar para
posteriormente examinar el resultado bajo el microscopio

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Figura 1: Bacillus sp. Técnica de Schaeffer Figura 2: Bacillus sp. Técnica de

y Fulton. Resolución 100x. Dorner. Resolución 100x.

Técnica de Schaeffer y Fulton.

En la figura 1 observamos como luego de realizar la técnica de Schaeffer y Fulton, donde

sometidos la muestra a altas temperaturas, generando endosporas, las cuales adquirieron
un color verde y la estructura vegetativa un color rojo.
Las bacterias de los géneros Bacillus sp. forman endosporas que aportan la capacidad de
supervivencia en condiciones ambientales desfavorables o extremas, se le denomina de
esta forma porque se desarrolla dentro de la célula y pueden ser esféricas o elípticas.
(Prescott, 2004).

En la figura 1 observamos que la coloración roja no es muy visible, esto puede ser debido a
que las endosporas han sido destruídas por la condiciones de estrés y debido a que el
colorante carbolfucsina no se ha fijado de manera adecuada.

Técnica de Dorner

Esta técnica también es utilizada para observar la presencia de endosporas, pero a

diferencia de la técnica de Schaeffer y Fulton, en esta se utiliza nigrosina y se realiza una
tinción de la muestra con carbolfucsina para observar las endosporas que produce la
bacteria Bacillus. ( Rodriguez, 2005).

En la figura 2 no se logra observar con claridad la presencia de endosporas ni la parte

vegetativa, esto puede ser debido a la sobreexposición a temperaturas altas, así como la
falta de fijación o maduración de la muestra de Bacillus sp.

V. CONCLUSIONES
● Es necesario fijar la muestra y siempre tener en cuenta las medidas para
evitar la contaminación y procurar la esterilización para posteriormente
observar en el microscopio compuesto a un aumento de 1000x con el lente
sumergido.
● El fundamento de las técnicas aplicadas para la tinción de bacterias ácido-
resistente se centra en la composición lipídica de la pared por lo que se
necesita emplear métodos de tinción especiales. En estos se aplican
variables como el calor y el uso de colorante básicos.

● En la tinción de las células bacterianas se pueden distinguir dos partes muy

diferenciadas: la endospora y la estructura vegetativa. La primera puede
identificarse como una estructura circular u ovoide que se encuentra en el
interior y centrada, mientras que la segunda es la que rodea a la endospora.

● Las dos tinciones aplicadas, Dorner y Schaeffer y Fulton se debieron teñir de

rojo la endospora, sin embargo, esto se visualizó débilmente solo en la
técnica de Schaeffer y Fulton mas no en la de Dorner. La primera
mencionada tiene una ventaja sobre la segunda debido al factor tiempo, ya
que esta la muestra debe hervirse durante un tiempo mayor de 20 minutos
para poder permeabilizar la pared. En cambio,Schaeffer y Fulton, trabaja 3
minutos en el mechero y el resto es una secuencia de aplicación de
colorantes. Otra diferencia es que en la de Schaeffer y Fulton se debió teñir
la parte vegetativa de verde, mientras que en el otro método, esta parte debió
ser incolora y con fondo oscuro por la nigrosina.
BIBLIOGRAFIA

Santambrosio, E. (2009). Tinción y observación de microorganismos. Buenos Aires:

Universidad Tecnológica Nacional.

Tortora, G. J. (2007). Introduccion a la microbiologia. Buenos Aires-Argentina:

Panamericana.

Stanier, R. Y., Ingraham, J. L., & Wheelis, M. L. (1991). Microbiología. Barcelona-España:

Reverté.

Prescott, H. 2004. Microbiología. 5ta edición. Mc Graw Hill Interamericana. Madrid, España.

Rodriguez, Evelyn. 2005. Bacteriología General. Observación microscópica de bacterias.

Sección 3. Editorial Universidad de Costa Rica.