SEMANA 1

SEMINARIO - MICROBIOLOGÍA
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BIOSEGURIDAD
Es un conjunto de normas y medidas para proteger la
salud del personal,frente a riesgos biológicos,químicos
y físicos.
Frente al SARS-COV-2 implica higiene de manos con
técnica adecuada, EPP.
Con la finalidad de conocer ,reconocer y prevenir a qué
riesgos nos vamos a enfrentar.(hospital/clínica)
Ejecución apropiada de los procedimientos
➔ Ejem: Si tengo ácido + agua y queremos
mezclarlos , primero coloco el agua y luego el ácido ,ya que si primero
colocamos el ácido ocasionamos accidentes.

PRINCIPIOS BÁSICOS DE BIOSEGURIDAD:

1. Universalidad:Cualquier tipo de fluido es peligroso para nosotros

2. Autocuidado:Cuidado a uno mismo.
Ejemplo:Área contaminada con TBC y nosotros como médicos contamos con
los EPP,pero vemos que el personal de limpieza se acerca y no tiene los EPP
necesarios (tendriamos que informarle sobre los riesgos que corre esa
persona y hablar con los encargados para que le puedan brindar los
elementos necesarios),En este caso vemos que también sería autocuidado
ya que el autocuidado va más allá de uno mismo y que esa persona puede
rotar por donde estás y te puede contagiar.
3. Barrera de protección :EPP(barrera física) y vacunas(barrera inmune)

MEDIDAS DE ELIMINACIÓN

¿Cómo eliminar los contaminantes?

¿Cuál es la ruta de la eliminación de estos materiales?
A. Desinfección
B. Toma de temperatura
Uso de desinfectantes:

AGENTES

1. Antiséptico:Superficie de la piel
2. Desinfectantes :Superficie inertes
3. Esterilizante:Para eliminar los microorganismos(bacterias ,esporas)
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Indicadores de esterilización(con ello se verá si se hizo la correcta
esterilización, con indicadores: fisicos ,quimicos,biologicos)

Microscopio

Para identificar la parte mecánica y óptica. Más usado en los hospitales.

Coloración
¿Por qué será importante una coloración?
¿Por qué será importante teñir una célula?
¿Cómo se que tipo de coloración debo emplear para identificar las características
del microorganismo?
CUESTIONARIO:
● Definición de seguridad en el laboratorio.
● Mencione cinco ejemplos (c/u) de barreras primarias, secundarias y
terciarias.
● ¿Cuál es la diferencia entre desinfección, descontaminación y esterilización?
(ejemplo de c/u).
● Mencione las diferencias entre los 4 niveles de bioseguridad.
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MÉTODOS DE COLORACIONES
COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES Y ESPECIALES.
INTRODUCCIÓN
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos: A)
Aquellos en los cuales el ion portador del color(cromóforo) es el anión llamados
colorantes ácidos Ej. Eosinato de sodio o Eosina. B) Aquellos cuyo cromóforo es el
catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de metileno. C) Los colorantes
neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina (ácido).
En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el
azul de metileno, cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen
al grupo de los colorantes derivados de la anilina. Las coloraciones pueden ser
según el número de colorantes que utilizan: A) Simples: cuando se utiliza un solo
colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de lactofenol B) Diferenciales:
cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl - Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas
estructuras celulares como la coloración de Leishman, Vagó, Hiss (para cápsula),
Wirtz conklin (para espora), Albert, etc.
1. REALIZACIÓN DE LA EXTENSIÓN • Producto líquido: Depositar en el centro de
un portaobjetos una pequeña cantidad del producto a examinar y extenderlo
con la ayuda de un asa de platino o una pipeta de modo que la extensión
sea lo más fina y homogénea posible. Un producto denso puede ser diluido
antes ligeramente. • Cultivo en medio sólido: depositar en un portaobjetos
una gotita de agua ó solución salina estéril y disociar en ella una pequeña
cantidad de cultivo. Extender para obtener un frotis fino y homogéneo. •
Sangre: hacer un frotis como para un examen hematológico, depositar
sobre el primer tercio de un portaobjetos limpio y desengrasado una
pequeña gotita de sangre. Hacer contactar con la misma un portaobjetos de
bordes esmerilados, que se inclina 45 °C. La sangre alcanza por capilaridad
todo el borde del portaobjetos que se empujará hacia la parte libre del
primer portaobjetos que contenga la gota de sangre, haciéndolo de un solo
movimiento, sin detenerse ni volver atrás. • Órganos: seccionar un pequeño
fragmento. Sujetarlo con una pinza, secar el trozo seccionado sobre un
papel secante, haciendo seguidamente con ésta porción una extensión o una
serie de aposiciones, sin apoyar demasiado, de manera que se obtengan
preparaciones finas.
2. SECADO Dejar secar por sí solo el frotis. Se puede acelerar la desecación
calentando ligeramente con un mechero Bunsen, pero sin calentar jamás
brutalmente.
3. FIJACIÓN Cuando la extensión esté bien seca, proceder a la fijación. Sólo
algunas coloraciones especiales no deben ir precedidas de una fijación. Él
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motivo de la misma es hacer adherir el frotis en portaobjetos y fijar la
morfología de las bacterias, células, por coagulación rápida de las proteínas.
Puede ser por: • Alcohol flameado: Es la técnica más general. Verter sobre la
preparación algunas gotas e inflamar después el alcohol restante. • Por el
calor: Aplastar la llama de un mechero Bunsen 2 a 3 veces contra la parte
inferior de la preparación, que sujetaremos con unas pinzas. Este método
debe rechazarse para los productos patológicos puesto que altera la
morfología de los elementos celulares. • Por el alcohol en frío: Cubrir la
preparación con alcohol etílico absoluto o metílico. Dejar actuar 1 o 2
minutos. Escurrir y dejar secar

Imaginemos que tenemos un

personal que nos trae una
muestra de esputo con
sospecha por síntomas de
tuberculosis, teniendo como
objetivo identificar si tenemos
un microorganismo para
descartar la enfermedad.
Entonces del total de la
muestra sólo escojo una
pequeña cantidad y conseguir
observar mediante el
microscopio mediante una
coloración para distinguir el inicio y final de la bacteria, la diferenciación de
otros elementos de la bacteria.
Al escoger una pequeña cantidad de la muestra siento un cultivo sólido o muestra
sólida, al colocarla sobre el portaobjeto con una o dos gotas de agua, se convierte
en una emulsión que vamos a mezclarlo con el “asa de siembra” (instrumento
muy utilizado para mezclar, como muestra la imagen) que debe ser estéril y
logramos esterilizar por medio del calor usamos el mechero. En la imagen
podemos observar que sobre el asa de siembra tiene un mango, viene a ser un
alambre. Es decir cuando esto toque el fuego va a llegar a ser incandescente,
temperaturas muy altas llegando a un rojo vivo y mata todo lo que hubiera en
esta zona (asa de siembra esteril).
Una vez ya esterilizado mezclo el agua con la muestra obteniendo una muestra
homogénea para esparcirlo y secar la muestra, dejándolo secar en el ambiente del
laboratorio, otras veces se usa alcohol. o etanol a causa que el alcohol va a captar
el agua va a conseguir que la muestra se seque más rápido pero hay otra forma
para secar con la ayuda de un mechero dejando una distancia prudente entre la
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lámina y el mechero para evitar que la muestra se pierda o que la lámina se
quiebre.
La idea es básica, conseguir una muestra y luego secarla. .
Fijamos las muestras con calor y dejamos secar ,porque en una muestra tenemos
muchas bacterias para poder ver en el microscopio. Al no realizar una dilución de
la muestra, en el microscopio voy a ver una bacteria encima de la otra sin
observar nada. Entonces si mi muestra es sólida hago una dilución (un poco de
muestra más agua) y dejamos secar, porque ese acto me permite fijar o adherir a
la lámina portaobjeto, después de este procedimiento realizamos la coloración. Si
es un cultivo líquido, colocó una asada o dos con este instrumento de la imagen
para colocarlo en esta lámina y esparcirlo bien para dejar secar o agregar alcohol
que tiene como propiedad deshidratar. Debemos tener en cuenta que hay
muestras que no podemos someterlas al calor pero básicamente la primera
parte es fijar la muestra para después pasar al exámen de tinción.

EXAMEN DE LAS PREPARACIONES TEÑIDAS

Las preparaciones coloreadas se examinan con el objetivo de inmersión (100x) sin

usar cubreobjetos. Depositar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión.
Descender primero el objetivo de 10 x, una vez enfocado pasar al lente de 100 x
sumergiéndose en la gota, comprobar el enfoque microscópico con el tornillo
micrométrico. OBJETIVO • Realizar coloraciones:simples, diferenciales y especiales •
Diferenciar que tipos de muestras se utilizan para cada coloración. • interpretar y
evaluar correctamente los resultados obtenidos en las distintas coloraciones y
discernir si la coloración fue bien realizada.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la
morfología de los microorganismos
MATERIAL • Muestra con mezcla bacteriana • Láminas portaobjetos • Laminillas
cubreobjeto • Asa bacteriológica de Kolle en aro • Colorante Azul de metileno •
Colorante Tinta China • Colorante Azul de lactofenol • Mechero de Bunsen • Varillas
para coloración • Aceite de cedro • alcohol isopropílico • Papel lente • Microscopio de
luz con objetivo de inmersión
COLORACIÓN AZUL DE METILENO: 1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y
fijar al calor 2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5
minutos 3. Lavar con agua y dejar secar 4. Observar al microscopio con objetivo de
inmersión y aceite decedro RESULTADO: Los microorganismos se observan de color
azul intenso
COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA: 1. Colocar una gota de tinta china sobre
la lámina portaobjetos 2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana 3. Cubrir la
preparación con una laminilla cubreobjeto 4. Observar con lente de menor y mayor
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aumento. RESULTADO: Observar la cápsula en los microorganismos sin teñir
resaltan sobre un fondo oscuro. Como la cápsula de la levadura Cryptococcus
neoformans
COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL: 1 Colocar una gota del colorante sobre la
lámina portaobjetos 2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el
colorante 3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto 4 Observar con lente de menor y
mayor aumento RESULTADO: Los microorganismos se observarán en un fondo
azul – celeste PROTOCOLO: Esquematiza o dibuje la morfología de los
microorganismos observados
B. COLORACIONES DIFERENCIALES Son aquellas coloraciones que utilizan más de
un colorante y, generalmente el segundo colorante es llamado colorante de
contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la de Ziehl
Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente

Al ser examinadas son el objetivo va estar en

inmersión de 100x, el objetivo va aumentar 100
veces la muestra, a este objetivo se le debe agregar
aceite, con el nombre de aceite de inmersión,
generando una mejor visión con este objetivo. Con
los otros objetivos no es necesario.

Veamos un caso con tres objetivos (4X, 40X y 100X)

para nuestro ensayo.
➔ ¿Cúal de estos objetivos requiere el aceite de inmersión? el objetivo 100X
➔ ¿Qué pasa? Si estoy viendo una bacteria con el objetivo 100X y el objetivo
ocular tiene una ampliación de 10X ¿cuál es el aumento total del objetivo?
Esto lo podemos calcular multiplicando AUMENTO OCULAR(OBJETIVO)
AUMENTO= 10X(100X) = 1000X VECES

Si estoy usando un objetivo de 40X y el objetivo ocular es de 4X ¿cuál es el

aumento total del objetivo? AUMENTO= 4X(40X)= 160X VECES
Usualmente se usa la ampliación ocular de 10X
➔ Andrea que está en laboratorio está observando una muestra de esputo
con el objetivo ocular 10X con el objetivo 45X ¿cuál es el máximo aumento
que está utilizando? AUMENTO= 10X(45X)= 450X VECES

COLORACIÓN SIMPLE:

La tinción proporciona información sobre el tamaño, forma y agrupación de los

microorganismos.
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MATERIAL:
● Caja portaobjetos
● Asa
bacteriológica
● Mechero
● Bandeja
● Puente vidrio
● Piseta con agua
● Colorante
PROCEDIMIENTO:
Una vez realizado el
frotis después de fijarlo iniciamos la tinción simple. Colocamos el frotis sobre el
puente de vidrio y agregamos unas gotas de colorante, evitando que escurra el
colorante dejándolo actuar un minuto, en este lapso se tiñen las células.
Transcurrido el momento se retira el exceso de colorante y se lava con agua hasta
que sea incolora el portaobjeto. el frotis teñido se deja secar sobre un papel
absorbente. Una vez seca la muestra la colocamos en el microscopio, recordando
que para visualizar mejor un microorganismo primero lo colocamos con el objetivo
de 10X, luego afinamos la imagen a 40X para observar levadura. En el caso de una
preparación de bacterias agregamos una gota de inmersión y colocamos el
objetivo a 100X para hacer la descripción de las bacterias
INTERPRETACIÓN:
Describiremos la morfología de las bacterias que
pueden ser cocos, bacilos, o spirillum. Así como su
agrupación en pares diplococos y diplobacillus, en
grupos de cuatro o tétradas, en cadenas como
esteptococo, en racimos o estafilococos o sin
agrupación definida.
Una vez terminada la observación se coloca el
portaobjeto en un recipiente con desinfectante para
su posterior lavado suave de agua y limpiamos el
aceite de inmersión del objetivo 100X
FUNDAMENTO
En la tinción están involucrados los
mecanismo de absorción y reacción
química del colorante con los componentes
celulares
PRECAUCIONES
No dejar actuar por más tiempo el
colorante pues al secarse si cristaliza y
dificulta la observación.
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RESUMEN: La tinción simple es una técnica que nos permite observar tanto la
morfología como agrupación de microorganismos,
Resulta simple porque sólo se usa un color.
Bacilo - forma de bastones
Cocos - forma redonda
Estafilococos -racimo de uva
Usamos la ampliación de 4X o 10X para identificar y
centrar la muestra que se coloreó y aumentamos la
ampliación

COLORACIÓN TINTA CHINA:

No guarda relación en los libros como una verdadera

coloración debido a que no se va teñir a la muestra en sí,
sólo el alrededor. Es decir se va colorear todo de color
negro menos la muestra en interés que se va mantener
blanco, también denominada tincion negativa. Esta
tinción se usa en bacterias que tienen cápsula, estructura
que la protege. Ejemplo: estereptococos pneumoniae,
cryptococcos neoformans (médula ósea), klebsiella
pneumoniae

COLORACIÓN LACTOFENOL

¿Para qué se usa? hongos

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COLORACIÓN GRAM

Observamos la envoltura de una bacterias que se tiñe de color azul (positiva) y la

otra de color rojo (negativa)
La estructura grande como un ladrillaso se denomina, peptidoglucano mureina
comparado con el otro peptidoglucano mureina, delgado

¿Por qué una muestra se tiñe de morado y otra de rojo? IMPORTANTE PARA
PRACTICA

AVERIGUAR:
COLORACIÓN DIFERENCIAL ZHIEL NEELSEN
COLORACIONES ESPECIALES: LEISHMAN, VAGO, HISS, WIRTZ CONKLIN Y ALBERT