CURSO DE ASISTE TES DE LABORATORIO CLI ICO

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MUESTRAS BACTERIOLOGICAS

1. Definición de Bacteriología: Es la ciencia que trata del estudio de las bacterias o microorganismos,
también se le conoce como Microbiología.

2. Importancia: El descubrimiento de las causas originarias de las enfermedades infecciosas (Bacterias), se

consideran entre los logros más importantes de la ciencia médica, debido a que las infecciones son las
enfermedades que han constituido uno de los principales azotes para la humanidad.

3. Muestras que se utilizan en Bacteriología:

• Sangre: Hemocultivo.
• Orina: Urocultivo.
• Heces: Coprocultivo.
• Esputo: BK (baciloscopia) cultivo.
• Líquido Cefalorraquídeo.
• Secreciones: ocular, nasal, otica, uretral, vaginal purulenta, de abscesos, de heridas, bronquial (aspirado
bronquial).
• Exudados faríngeos.

4. Condiciones para la toma de muestras: Para cualquier tipo de muestra, el paciente no debe haber
ingerido antibióticos, por lo menos 8 días antes del examen.

Hemocultivo:
Se debe realizar la asepsia con alcohol yodado, es importante conocer la edad del paciente, porque de
esto depende la cantidad de sangre a utilizar.

IÑOS: 1.5 ML ADULTOS: 2 ML

Se agrega la sangre por las paredes del tubo que contiene un medio de cultivo (Schaedler, es un caldo
nutriente).
Se flamea la boca del tubo en el mechero, se tapa y luego se mezcla por inversión, se traslada al
laboratorio.

Urocultivo:
Lavarse los genitales con agua y jabón, al levantarse.
Descartar el primer chorro de orina y recoger el resto, en un recolector de orina estéril; llenar ¾ partes
del recolector, llevarlo al laboratorio a la brevedad posible, en un recipiente con hielo.

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Lic. Senaida Dávila, Lic. Gladys Becerra, Lic. Luz Yadira Orozco
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Coprocultivo:
Las heces deben ser recién emitidas.
Se trasladan al laboratorio en el recipiente adecuado.

Esputo:
La muestra debe ser la más purulenta, sin saliva.
Para BK, se necesitan mínimo tres muestras, máximo 5; para el cultivo con la primera es suficiente..
Se deben obtener las muestras antes de la administración de antibióticos (más o menos 3 días).
Utilizar recolectores estériles de orina (para colocar la muestra).

Secreción Ocular:
La muestra debe tomarse sin lavarse los ojos la noche anterior, ni la mañana del examen, sin colocarse
gotas, y sin tomar antibióticos.

Secreción asal:
La muestra se toma sin sacudirse la nariz, sin haberse realizado lavados, sin colocarse gotas y sin haber
tomado antibióticos.

Secreción Otica:
La muestra se obtiene sin haberse limpiado los oídos, sin haberse colocado gotas y sin haber tomado
antibióticos.

Exudado Faríngeo:
La muestra se obtiene sin haberse lavado los dientes, sin enjuagarse, sin gargarismo ni tocamientos, sin
haber ingerido alimentos y sin haber tomado antibióticos.

Secreción Uretral:
La muestra se toma sin lavarse los genitales, sin orinar y sin haber ingerido antibióticos.

Secreción Vaginal:
Se obtiene la muestra sin lavarse los genitales, sin colocarse cremas ni ungüentos, ni óvulos, sin orinar y
sin haber ingerido antibióticos.

Otras muestras como: abscesos, purulentas, heridas, entre otras, se obtienen haciendo la asepsia del sitio de la
lesión, previo las anteriores indicaciones.

Baciloscopia = BK
Tuberculosis: es una enfermedad infecciosa, producida por un bacilo llamado Mycobacterium tuberculosis
(bacilo de Koch), que puede afectar cualquier tejido del organismo, pero que se suele localizar en los

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pulmones. El nombre de Tuberculosis deriva de la formación de unas estructuras celulares (nódulos) llamadas
tuberculomas, donde los bacilos quedan encerrados.
El diagnóstico de la Tuberculosis se basa, en la identificación del bacilo, a través de un examen llamado BK.
(Se conoce con las siglas BAAR = bacilo acido alcohol resistente).

Muestra:
Esputo o secreción bronquial:
Para obtener resultados confiables, es preciso obtener las muestras que provengan del sitio de la lesión, por esto
se utiliza el esputo como muestra, ya que proviene del árbol bronquial.

El recolector: puede ser el de esputo o el de orina; generalmente se utilizan los de orina, ya que cumplen ciertas
condiciones.

1. De plástico: que permite ver si la cantidad y calidad del esputo es adecuada, sin necesidad de abrir el
recolector.
2. Con cierre hermético: para disminuir el riesgo de que la muestra, se derrame durante el transporte.
3. Desechable: no reutilizable, se descarta después de usado.
4. De boca ancha: para que el paciente pueda colocar fácilmente su expectoración dentro del envase, y para
que en el laboratorio sea más fácil procesar la muestra.

Instrucciones para la recolección del esputo:

1. Utilizar un recolector estéril.

2. Al levantarse en ayunas, posterior al aseo bucal, se procedo a tomar la muestra.
3. Tomar aire profundamente, retenerlo por un instante en los pulmones, y expulsar el esputo, (más no la
saliva), con un esfuerzo de tos, hasta lograr hacerlo 2 o 3 veces.
4. Tapar inmediatamente el recolector, y limpiarlo.
5. La muestra debe ser llevada de inmediato al laboratorio.

OTA: El mejor esputo, es el recogido al despertar, sobre todo para el cultivo, ya que la cantidad será mucho
mayor, porque se ha acumulado durante la noche. Para el BK, se puede recoger a cualquier hora.

Materiales para el extendido y coloración:

• Mechero
• Aplicadores.
• Laminas.
• Papel absorbente.
• Bandeja.
• Cloro.
• Creolina.

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• Colorantes.
• Lápiz graso.

Preparación del extendido y ormas de Bioseguridad

• Uso de bata, guantes, tapaboca, mechero encendido.
• Disponer de buena iluminación.
• Lavarse las manos antes y después del trabajo.
• Uso de campanas de extracción.

1. Si no se trabaja con las Normas de Bioseguridad, como por ejemplo, en el medio rural, se puede agregar a
la muestra de 5 a 10 gotas de cloro o creolina, tapar y dejar por 30 minutos; pasado este tiempo, se procede
a realizar el extendido, porque ya no habrá peligro de contaminación.

2. Delimitar el sitio de trabajo: Se debe trabajar sobre una bandeja metálica, cubierta con papel absorbente y
humedecido con cloro; de lo contrario colocar el papel directamente sobre la mesa, de manera que delimite
el área.

3. Rotular las láminas en uno de sus extremos.

4. Realizar el extendido:
• Se debe destapar solo el recolector de la muestra que se va a procesar.
• Mezclar el esputo con el aplicador, y tomar las partículas muco – purulentas, realizar el extendido
con movimiento de vaivén o en forma circular sin tocar los bordes de la lámina.
• Descartar el aplicador en la bandeja con creolina.
• Una vez realizado el extendido, flamear.
• Dejar secar a temperatura ambiente.
• Se realiza la coloración de Ziehl Neelsen.

Importancia de estas muestras:

Al aislar la bacteria que produce la infección, y realizar el antibiograma al microorganismo obtenido, se sabrá
cuál es el antibiótico adecuado para combatir la infección.

Extendido de muestras bacteriológicas:

Antes de realizar cualquier extendido del material de estudio, se deben disponer de láminas NUEVAS,
limpias y desgrasadas.
El extendido debe ser una capa muy fina.
Se debe dejar secar a temperatura ambiente.

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Se fija con el calor suave de la llama del mechero, es decir se flamea, tres a cuatro veces, para matar las
bacterias, y que así se adhieran a la lámina; si no se flamea, al momento de lavar el exceso de colorante,
la muestra se lava y no se observa nada.

COLORACIO ES

En la preparación de los colorantes se debe seguir las indicaciones del fabricante, usando las cantidades
adecuadas, y una correcta técnica de coloración.

Coloración de GRAM:
Esta se basa en las diferentes composiciones de la pared celular de las bacterias y se clasifican en: GRAM
positivo y GRAM negativo, dependiendo del colorante que permita retener.

Utilidad:
Representan la primera y más importante etapa del diagnóstico bacteriológico, el cual junto al cultivo, ayuda a
identificar el agente causal de la infección, además es una técnica, sencilla, confiable, y económica.

Técnica de GRAM:
• Se realiza un frotis delgado sobre la lámina.
• Se deja secar a temperatura ambiente.
• Se flamea, tres o cuatro veces.
• Se coloca el frotis sobre un soporte adecuado.
• Se cubre el frotis con violeta de genciana o cristal violeta por un (1) minuto.
• Escurrir y lavar con agua de chorro.

• Cubrir el frotis con Lugol por un (1) minuto.

• Escurrir y lavar con agua de chorro.
• Decolorar con alcohol acetona por 30 segundos.
• Escurrir y lavar con agua de chorro.
• Cubrir el frotis con safranina o fuscina por un (1) minuto.
• Lavar, escurrir y dejar secar a temperatura ambiente. Entregue al bioanálista.

Coloración de Ziehl eelsen

Esta técnica se utiliza exclusivamente para colorear el bacilo de Koch, el cual se colorea de color rosado.

Técnica de coloración de Ziehl eelsen

• Cubrir la lámina con el reactivo de Ziehl Neelsen por 5 minutos. Durante estos 5 minutos flamear con el
mechero, cada minuto la lámina (por debajo de ella) hasta emitir vapores.
• Escurrir y lavar con agua de chorro.
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• Agregar alcohol clorhídrico por 3 segundos (decolorar).

• Escurrir y lavar con agua de chorro.
• Agregar azul de metileno, para colorear el fondo de la lámina x 30 segundos.
• Escurrir y lavar con agua de chorro.
• Secar a temperatura ambiente y entregar al bioanálista.

OTA: El extendido queda con un color azul – morado.

Coloración de Hansel
Es utilizada en la secreción nasal, para colorear eosinófilos, estas son células que aumentan en los procesos
alérgicos, y se ponen en evidencia en la secreción de las mucosas nasales.

Técnicas de coloración de Hansel

• Fijar el extendido con metanol por 3 minutos, no fijar al calor.
• Descartar el metanol, lo que indica que NO se debe dejar secar el metanol durante los 3 minutos de
fijación.
• Cubrir la lámina con el colorante de Hansel por 1 minuto.
• Al transcurrir el minuto, inmediatamente agregar agua destilada a la lámina (sin permitir que se derrame
el colorante que se colocó previamente), y dejar 30 segundos.
• Lavar con agua de chorro para quitar el exceso de colorante (se puede agregar una pequeña cantidad de
metanol para eliminar el exceso de los precipitados o excesos de colorante).
• Secar a temperatura ambiente y entregar al bioanálista.

MEDIOS DE CULTIVO QUE SE UTILIZA E BACTERIOLOGIA

Definición:
Medios de cultivo es toda suspensión en la cual los microorganismos encuentran, los requerimientos
nutricionales para desarrollarse y realizar sus actividades.

Estos medios deben ser, lo más semejantes al hábitat natural del microorganismo, para lograr su objetivo.

Clasificación de los medios de cultivo:

Según su origen:
• Naturales: Agua, orina, sangre, leche (poco utilizados).
• Sintéticos: son sustancias químicas orgánicas e inorgánicas (extracto de carne, peptona, cloruro de
sodio).

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• Vivos: son cultivos para microorganismos que son parásitos intracelulares obligados; ejemplo: huevos
embrionados, células LE, crecimiento de virus.

De acuerdo a su función:
• Básicos: Son aquellos utilizados para el desarrollo de microorganismos, no exigentes en cuanto a
nutrición; ejemplo: caldo nutriente, caldo tripticasa.
• Enriquecidos: Son aquellos que contienen un medio básico, al cual se le añaden sustancias nutrientes,
que permiten el crecimiento de microorganismos exigentes. Ejemplo: Agar loefler, Agar sangre,
Lowenstein Jensen, caldo selenito, caldo tetrationato.
• Diferenciales: Nos permite diferenciar dos o más tipos de microorganismos. Ejemplo: manitol salado,
citrato, Agar SS (Salmonella Shiguella).
• Altamente diferenciales: Ejemplo: Agar Sangre, Agar chocolate, Agar Mc Conkey, Agar EMB Kligler.
• Selectivos: son específicos para un solo tipo de microorganismos.
• Medios de transporte: tienen gran utilidad en aquellos casos que existe demora entre la toma de muestra
y su procesamiento, por ejemplo: Cary Blair Stuart.

Según su estado físico:

• Sólidos: ejemplo Agar en placa y en tubo.
• Semi – sólidos: ejemplo: Agar indol, Agar motilidad, medio OF.
• Líquidos: ejemplo: caldos (se preparan en tubos de 16 x 150).

Criterios a seguir para la preparación de medios de cultivo.

1. Revisar la fórmula del medio deseado, y disponer de todos los componentes.
2. Realizar los cálculos de acuerdo a la cantidad que se va a preparar.
3. Medir con exactitud los componentes del medio deseado.
4. Medir y ajustar el PH.
5. Envasar y rotular.
6. Esterilizar.

Esterilización:
Es el proceso mediante el cual e destruye de forma total cualquier tipo de microorganismo, ya sea saprofito o
parasito o que se presente en forma vegetativa o esporulada.

Tipos de Esterilización:
Métodos físicos:
• Seco:
• Directo: a través de la llama (flameado).
• Indirecto: horno de aire caliente.
• Calor: vapor de agua (puede ser a presión, o sin presión)
• Calor Húmedo: ebullición.
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Finalidad de la preparación de los medios de cultivo:

1. Desarrollar y conservar cultivos de bacterias.
2. Estudiar las reacciones de los microorganismos sobre algunas sustancias del medio.
3. Facilitar la producción de los microorganismos, de algún producto determinado.

¿Qué es un cultivo de microorganismos?

Consiste en promover el crecimiento de los mismos, proporcionándole las condiciones ambientales adecuadas,
como nutrición, PH, temperatura, concentración de sales, presión osmótica del medio y aireación.

Materiales para preparar cultivos:

• Balanza. • Varilla de vidrio.
• Espátula. • Agua destilada.
• Vasos de precipitado. • Medio de cultivo comercial.
• Fiolas. • Mechero con trípode y rejilla metálica.
• Cilindro Graduado.

Materiales para envasar los medios de cultivo:

• Placas estériles (de vidrio o plásticas, completas o divididas).
• Tubos con tapas de baquelita.
• Mechero.
• Bata, guantes, tapabocas y gorro.

Preparación de medios de cultivo:

Agar en placa:
1. Pesar en la balanza con exactitud, la cantidad del medio requerido, y disolverlo con agua destilada en una
fiola.
2. Llevar a ebullición.
3. Dejar enfriar aproximadamente 5 minutos.
4. Luego tapar la fiola con papel Kraff, y sellar con cinta adhesiva.
5. Se lleva a esterilizar en el autoclave por 15 minutos, a 121°C y a 15 libras de presión, dejar enfriar en el
autoclave a puerta cerrada.
6. Sacar fuera del autoclave y se procede a envasar; se traslada el medio del cultivo al área de trabajo donde
estarán dispuestas, las placas, fiolas, tubos, etc. Se prende el mechero.

OTA: Se debe envasar a puerta cerrada, y no se debe dejar entrar y salir personas del ambiente donde se está
preparando, y en caso de estar acompañado, no hablar mientras se esté envasando.

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Se debe flamear las placas, y si les queda burbujas, se flamean hasta que se eliminen (sin la tapa), se deja
solidificar, se invierten y se guardan en la nevera.

Preparación de Agar solido en tubo:

1. Pesar en la balanza con exactitud, la cantidad del medio requerido, y disolverlo con agua destilada en una
fiola.
2. Llevar a ebullición.
3. Se envasa con el mechero prendido.
4. Se esteriliza en autoclave por 15 minutos, a 121°C y a 15 libras de presión.
5. Se deja enfriar y solidificar bien sea en taco o en pico.
6. Se rotula y se guarda en la nevera.

Preparación de caldos en tubo:

1. Se pesa el medio.
2. Se diluye en agua y se calienta sin llevar a ebullición.
3. Se envasa en tubos con tapa de baquelita (la tapa se debe dejar semi ajustada) para permitir el adecuado
ajuste de las presiones, durante la esterilización.
4. Llevar al autoclave por 15 minutos, a 121°C y a 15 libras de presión.
5. Dejar enfriar
6. Cerrar la tapa de baquelita.
7. Llevar a la nevera.

Preparación de azucares y aminoácidos:

1. Se pesa y se diluye el medio en agua.
2. Se toma el PH. Debe ser neutro, si queda acido se alcaliniza con hidróxido de sodio Na(OH), Si esta
alcalino, se acidifica con ácido clorhídrico HCl (unas gotas).
3. Se lleva la fiola al mechero, si es agar se lleva a ebullición, si es caldo solo se calienta.
4. Se envasa en tubos de 13x100 con tapa de baquelita.
5. Luego se lleva al autoclave por minutos, a 121°C y a 15 libras de presión.
6. Se deja enfriar y se lleva a la nevera.

Control de calidad de los medios:

De los medios de cultivos preparados, se toma un tubo o una placa al azar, y la colocamos dentro de la estufa o
el horno por 24 horas, a 37°C, para observar si hay crecimiento bacteriano, de haber, fue mal esterilizado el
material.

Mantenimiento y conservación de cultivos:

Se deben mantener en nevera a 4°C, pueden durar de 8 a 15 días las placas, y los caldos, azucares y
aminoácidos de 1 a 2 meses.

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