Manual de Prácticas de Microbiología Médica

MEDIDAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

1. Las puertas del laboratorio deberán portar emblemas que digan: "Peligro biológico".
2. El laboratorio deberá ser mantenido limpio, ordenado y libre de materiales extraños.
3. No se permitirá comer, beber, fumar y/o almacenar comidas, así como el uso de cualquier
otro ítem personal (ej. cosméticos, cigarrillos) dentro del área de trabajo.
4. Usar bata, chaqueta o uniforme dentro del laboratorio. Esta ropa protectora deberá ser
quitada inmediatamente antes de abandonar el área de trabajo.
5. Antes de iniciar la práctica asegúrese que la piel de sus manos no presente cortes, raspones y
otras lastimaduras, en caso que así sea cubrir la herida de manera conveniente antes de
colocarse los guantes.
6. Usar guantes de látex de buena calidad para todo manejo de material biológico o donde
exista aunque sea de manera potencial el riesgo de exposición a sangre o fluidos corporales.
7. Cambiar los guantes de látex toda vez que hayan sido contaminados, lavarse las manos y
ponerse guantes limpios.
8. No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas.
9. No abandonar el laboratorio o caminar fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos.
10. El uso de agujas, jeringas y cualquier otro instrumento similar deberá ser restringido a su uso
indispensable. Las agujas y otros elementos punzantes deberán ser descartados en un
recipiente resistente. Se deberán evitar los intentos de reintroducir las agujas descartadas
en capuchones o de romperlas o doblarlas ya que esta conducta produce aumento de la
posibilidad de accidentes por pinchazos o salpicaduras. No usar tijeras con puntas muy
agudas. Por ningún concepto las agujas serán retapadas. El conjunto aguja-jeringa deberá
ser descartado en el recipiente destinado a tal fin.
11. Todos los procedimientos deberán ser realizados de manera tal que sea nula la creación de
aerosoles, gotas, salpicaduras, etc.
12. Bajo ninguna circunstancia se pipeteará sustancia alguna con la boca, de ser necesario se
usarán pipeteadores automáticos.
13. Las superficies del área de trabajo deberán ser descontaminadas cuando se termine la tarea
diaria. Usando para tal efecto una solución de hipoclorito de sodio en concentración
adecuada. (Responsabilidad del Personal Técnico).
14. El recipiente para descontaminar especímenes deberá contar con tapa de seguridad para todo
traslado fuera del lugar de trabajo. En ese caso el exterior del recipiente deberá ser
mantenido libre de toda contaminación con sangre usando solución decontaminante.
15. El desecho de los fluidos orgánicos puede efectuarse por las cañerías habituales una vez que
estos hayan sido convenientemente descontaminados.
16. Una vez usados los guantes de látex deberán ser colocados dentro del recipiente con
solución decontaminante.
17. Lavar las manos con jabón y agua inmediatamente después que el trabajo haya sido
terminado. Si los guantes de látex están deteriorados, lavar las manos con agua y jabón
después de quitarlos.
18. Informe inmediatamente al Docente responsable de la Mesa de Práctica de cualquier
accidente ocasionado con elementos del laboratorio.

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PRÁCTICA N° 1: OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS, MORFOLOGÍA

MICROBIANA. EXAMEN EN FRESCO Y COLORACIONES SIMPLES.

IVÁN SABOGAL TORI

OBJETIVO

El alumno de Medicina conocerá la utilidad de un examen en fresco y de las coloraciones

simples.

INTRODUCCIÓN

El examen en fresco, es uno de los exámenes más simples para observar cualquier
microorganismo, especialmente si tiene movimiento y el tipo de movimiento.

Las coloraciones simples se utilizan para visualizar la morfología y utilizan sólo un

colorante. Ej. Azul de Metileno, Azul de Lactofenol y tinta china (da una coloración
negativa; el microrganismo no se colorea).

Uno de los aspectos más notables de los microorganismos es su tamaño pequeño. En

bacterias las medidas se calculan en unidades de micrómetros (1um=0,001mm, hay
1000 micrómetros en un milímetro). La obervación de la bacteria puede darse en uno o
varios planos, pudiendo evidenciarse formas esféricas (cocos); éstos a su vez pueden
disponerse en cadenas (estreptococos), en cadenas y de pares (diplococos); o en
racimos (estafilococos). También se observan de forma alargada (bacilos), pudiendo ser
alargadas y espiraladas (espiroquetas).

Estas características morfológicas proporcionan la base principal para su

sistematización morfológica.

En cuanto a los hongos pueden presentar la forma redondeada como las levaduras o la
forma filamentosa como los mohos.

Los virus en cambio, nunca se pueden observar al microscopio compuesto, sólo se

visualizan a través del microscopio electrónico por su tamaño menor de 300nm
(1nm=0,000001mm).

MATERIALES

- Tubo con mezcla bacteriana en medio líquido

- Láminas coloreadas con Azul de Lactofenol de un hongo filamentoso.
- Láminas montadas con tinta china (coloración negativa). Sirve para discriminar detalles
estructurales de algunos microorganismos como las levaduras.
- Láminas portaobjetos.

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- Laminillas cubreobjetos.
- Colorante Azul de Metileno.
- Asa en anillo.
- Aceite de cedro o de inmersión.

PROCEDIMIENTOS

A. OBSERVACIÓN EN FRESCO

- Tomar una asada de la mezcla bacteriana.

- Cubrir con una laminilla y observar al microscopio con lente de menor y mayor aumento.
- Observar la morfología y movilidad de los gérmenes

B. COLORACIÓN SIMPLE: AZUL DE METILENO

- Preparar un frotis a partir del tubo con mezcla bacteriana.

- Fijar al calor.
- Cubrir el material con unas gotas de Azul de metileno y dejar actuar el colorante durante
3 a 5 minutos.
- Lavar con agua, secar la lámina al calor suavemente.
- Observar al microscopio con objetivos de inmersión agregando una gota de aceite de
cedro.
- Anotar en el protocolo.

C. COLORACIÓN SIMPLE: AZUL DE LACTOFENOL:

- Se realiza un cultivo del hongo filamentoso en una gota de medio de cultivo, en una
lámina.
- Cuando hay crecimiento se coloca una gota del colorante sobreel crecimiento.
- Se cubre con laminilla y se sella con bálsamo de Canada
- En la práctica se observar con lente de menor y mayor aumento, láminas ya listas.
- Anotar en el protocolo.

D. PREPARACIÓN CON TINTA CHINA

- Se colocar sobre una lámina portaobjetos una gota de tinta china.

- Se tomar una asada del cultivo a estudiar (Cryptococcus) y se le mezcla en la gota del
colorante.
- Se cubre con laminilla.
- En la práctica se observa con lente de menor y mayor aumento, laminas ya preparadas.
- Anotar en el protocolo.

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RESULTADOS

Anote y esquematice sus observaciones

ESQUEMA DE LA OBSERVACIÓN
LÁMINAS DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA
MICROSCÓPICA

Examen en Fresco

Coloración con Azul de

Metileno

Coloración con Azul de

Lactofenol

Preparación con Tinta

China

CUESTIONARIO

1. ¿Qué permite observar una coloración simple de un microorganismo al microscopio?

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. ¿Qué se observa en el microscopio al examen en fresco?

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA

1. Guia de Prácticas de Microbiologia Médica 2005. Departamento de Microbiología Médica

UNMSM.

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PRÁCTICA N° 2: COLORACIÓN DE GRAM-KOPELOV Y COLORACIÓN DE

ZIEHL-NEELSEN
IVÁN SABOGAL TORI

OBJETIVO

Los alumnos deben:

- Realizarar la Coloración Gram y reconocer microrganismos Cocos Gram Positivos, Cocos

Gram Negativos, Bacilos Gram Positivos y Bacilos Gram Negativos.
- Realizar la coloración Ziehl-Neelsen y reconocer los microorganismos Bacilos Ácido-Alcohol
Resistentes.

INTRODUCCIÓN

La coloración Gram es necesaria para clasificar microorganismos, especialmente a las bacterias,

en Gram Positivas y Gram Negativas. Los microorganismos Gram Positivos se tiñen de azul y los
Gram Negativos se tiñen de color fucsia o rojas.

Las bacterias Gram Positivas retienen Violeta de Genciana, por su pared gruesa rica en
Peptidoglicanos, luego de resistir la decoloración con solución alcohol acetona.

Las bacterias Gram Negativas no retienen Violeta de Genciana, por su pared delgada rica en
lipopolisacáridos, y por lo tanto se decoloran totalmente con solución alcohol – acetona, para
luego teñirse con la fucsina básica.

La Coloración Ziehl Neelsen nos permite identificar bacterias Ácido-Alcohol Resistentes. Esta
coloración se basa en que la alta cantidad de ácidos micólicos, dándole un gran contenido
lipídico, en la pared de algunas bacterias. Los acidos micólicos retienen el colorante Fucsina
fenicada luego de resistir la decoloración con la solución de alcohol-ácido.

MATERIALES

- Lamina con frotis de mezcla bacteriana.

- Lamina con frotis de esputo.
- Serie de Coloración Gram – Kopelov.
- Serie de Coloración Ziehl - Neelsen.
- Mechero de Alcohol.
- Lámina con Stafilococcus sp.
- Lámina con Streptococcus sp.
- Lámina con Branhamella catarrahlis.
- Lámina con Bacillus sp.
- Lámina con Escherichia coli.
- Lámina con Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes.

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PROCEDIMIENTO

a. Realizar la Coloración Gram en la lámina con mezcla bacteriana:

- Cubrir el frotis con solución de Violeta de Genciana, agregar dos gotas de Bicarbonato de
Sodio. Dejar que el colorante actúe por dos minutos.
- Lavar la lámina con Lugol de Gram y cubrir la lámina con la misma solución por dos
minutos.
- Lavar la lámina con agua corriente.
- Agregar solución decolorante de alcohol - acetona por el borde de la lámina, no
directamente sobre la mezcla de bacterias. Se observa como se desprende la Violeta de
Genciana. Dejar actuar solo por 10 segundos.
- Lavar inmediatamente con agua corriente.
- Cubrir la lamina con solución de fucsina básica. Dejar actuar por 30 segundos.
- Dejar secar la lámina parada.

b. Realizar la Coloración Ziehl – Neelsen en la lámina con frotis de esputo:

- Cubrir el frotis con solución de Fucsina Fenicada. Aplicar el calor de la llama del Mechero
de Alcohol tres veces, observar la formación de 3 vapores (humitos). Se aplica el calor de
lallama una vez, se observa y se deja actuar por un minuto, y asi los tres humitos. Evitar
que hierva el colorante.
- Lavar la lámina con agua corriente.
- Agregar solución decolorante de alcohol - ácido por el borde de la lámina, no
directamente sobre el frotis. Se observa como se desprende la Fucsina fenicada. Dejar
actuar solo por 2 minutos máximo.
- Lavar inmediatamente con agua corriente.
- Cubrir la lamina con solución de azul de metileno. Dejar actuar por 60 segundos.
- Dejar secar la lámina parada.

c. Observar las láminas con bacterias de diverso tipo.

d. Enfocar los microscopios con aceite de inmersión.

RESULTADOS

Esquema de
Descripción
Lamina observación Comentarios
morfológica
microscópica

Coloracion Gram

C. Ziehl-Neelsen

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CUESTIONARIO

1. ¿Qué importancia tiene la pared bacteriana en la coloración Gram y la Coloracion Ziehl-

Neelsen?

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_________________________________________________________________________________

2. ¿Identifica otras formas especiales de bacterias y su forma de agruparse con la coloración

Gram?

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_________________________________________________________________________________

3. ¿Identifica otros elementos que se observa en la Colracion Ziehl Neelsen?

_________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA

1. Manual de Prácticas y Atlas. Asignatura de Microbiología y Parasitología. Departamento de

Microbiologia Médica. EAP Enfermeria. Dra. Hilda María Solis Acosta. 2009.

2. Guía de Prácticas. Microbiología. Médica. Curso Microbiología Medica Básica. Escuela

Académico Profesional Medicina Humana. Departamento Academico de Microbiologia
Medica. Dr. Rito Zerpa Larrauri. 1998.

3. Manual de Prácticas Atlas de Microbiología Médica a Color. Curso Microbiología Medica

Básica. Escuela Académico Profesional Medicina Humana. Departamento Academico de
Microbiologia Medica. Dr. Rito Zerpa Larrauri. 2009.

4. Microbiologia e Inmunologia Medicas. Warren Lavinson. Octava Edicion McGraw-Hill -

Interamericana de España SAU. 2004.