TAREA PARA MICROBIOLOGIA CLINICA TEMA 01

Actividad n º 1:
Analiza las imágenes que se adjuntan e indica en cada caso la información que aportan
acerca del microorganismo.

Puntos a considerar:
Tipo de microorganismo
Información que aporta la tinción realizada en relación a
Tamaño y morfología
Agrupación
Otros aspectos (pared celular, cápsulas, esporas…)
Imagen 1: Tinción de Gram-1.

Teniendo en cuenta que la imagen esta ampliada a 1000x lo que vemos es una bacteria del
género Corinebacterium diphtheriae (causante de la difteria).
Esta bacteria forma parte del grupo de los bacilos, tiene forma de maza ya que hay un
ensanchamiento en uno de sus lados y esta agrupada en letras chinas o empalizada.
Es gram positiva, aerobia y sin esporas; como vemos en la imagen, la tinción nos permite ver
la ausencia de capsulas, membranas y orgánulos internos. Mide de 1 a 8 µm de largo y de
0,3 a 0,8 µm de diámetro.

Imagen 2: Tinción de Gram-2.

En esta imagen vemos una bacteria gram positiva con bacilos agrupados en forma de cadena.

Esta forma de agruparse se denomina estreptobacilo. No hay presencia de esporas.

Imagen 3: Tinción de Gram-3.

En esta imagen vemos bacterias gram negativas ya que están teñidas de rojo, tienen forma
de bacilo largo y con los extremos redondeados. Su agrupación es en forma de cordón y en
empalizada.

Imagen 4: Montaje húmedo.

En esta imagen vemos levadura, un tipo de hongo unicelular, su morfología es redonda u

ovalada, tienen un tamaño entre 1 y 10 µm y se reproducen por gemación (multiplicación
asexual consiste en la formación de prominencias sobre el individuo progenitor, y al crecer y
desarrollarse, originan nuevos seres que pueden separarse del organismo parental o quedar
unidos a él, iniciando así una colonia). También podemos observar en la imagen la existencia
de pared celular y de núcleo.

Actividad n º 2:
Elabora un protocolo en el que se muestren todos los pasos necesarios para realizar el
procedimiento de tinción de gram (incluyendo la preparación de frotis) indicando como
quedarían teñidas las bacterias después de cada paso. Señala en el esquema los puntos
críticos del procedimiento.
Preparación del frotis:

Material necesario:

Asa de siembra: para recoger la muestra.

Portaobjetos limpios: láminas de vidrio que sostendrán la muestra.
Mechero Bunsen: para esterilizar el asa bacteriológica y para secar el frotis.
Medio de cultivo: para extender la muestra.
Microscopio: para observar el frotis.

Pasos para preparar un frotis bacteriano:

Lavado de manos: Lavamos las manos con cuidado y utilizamos guantes estériles si es
necesario.
Identificación de la muestra: Rotula e identifica la muestra.
Preparación del asa bacteriológica: Esterilizamos el asa bacteriológica calentándola en la
llama del mechero Bunsen o lámpara de alcohol hasta que esté al rojo vivo. Luego, dejamos
enfriar durante unos segundos.
Toma de la muestra: Utilizamos el asa de siembra para recoger una pequeña cantidad de la
muestra bacteriana. Esto puede ser una muestra líquida o un cultivo en agar.
Extensión de la muestra: Extendemos la muestra uniformemente sobre el portaobjetos
limpio. Podemos hacerlo de dos maneras:
Extensión en un solo sentido: Colocamos una gota de muestra en el portaobjetos y la
extendemos a lo largo de la superficie con el asa bacteriológica.
Extensión en zigzag: Colocamos varias gotas de muestra en una fila y luego las unimos con
el asa de siembra en un movimiento en zigzag.
Fijación del frotis (opcional): Si vamos a realizar una tinción de Gram, debemos fijar el
frotis. Esto se hace dejando secar el frotis al aire o pasándolo suavemente sobre la llama del
mechero Bunsen para fijar las bacterias en el portaobjetos.
Este es un punto crítico, ya que, si el portaobjetos pasa en la llama mucho tiempo, las
células se deformarían, llegándose a romper y se dificultaría su identificación.

Consejos para la preparación del frotis: Colocar la muestra en el centro del portaobjetos,
será más fácil de localizar.
Debemos intentar que la superficie de extensión no sea muy grande. Las primeras veces es
mejor realizar un círculo con un rotulador sobre el portaobjetos.
Tendremos especial cuidado en que la muestra forme una capa fina sobre el portaobjetos,
sin grumos.
Tinción de gram:
Materiales necesarios:
Portaobjetos con frotis bacteriano.
Cristal violeta (colorante primario).
Lugol (solución yodada).
Alcohol etílico o acetona (alcohol decolorante).
Safranina (colorante secundario).
Microscopio.
Papel secante.
Procedimiento:
Tinción inicial con Cristal Violeta: Aplicamos unas gotas de cristal violeta al frotis. Dejamos
actuar durante 1 minuto. Enjuagamos suavemente el portaobjetos con agua corriente para
eliminar el exceso de tinte. El agua no debe incidir directamente sobre la muestra,
dejaremos que el chorro golpee la parte superior del portaobjetos y resbale sobre la
muestra.
Tinción con Lugol: Aplicamos unas gotas de la solución de Lugol al frotis. Deja actuar
durante 1 minuto. Lavamos el exceso de Lugol con agua corriente.
Decoloración con Alcohol (Acetona): Este es un punto crítico de la tinción. Inclinamos el
portaobjetos y añadimos el alcohol en un flujo suave sobre el frotis. Esto debe realizarse
cuidadosamente durante unos segundos hasta que no haya más color que se desprenda del
frotis (unos 3 segundos). Lavamos inmediatamente con agua corriente.
Tinción con Safranina: Aplicamos unas gotas de contracolorante safranina al frotis.
Dejamos actuar durante 1 minuto. Lavamos el exceso de safranina con agua corriente.
Secado: Dejamos secar el frotis al aire colocando el portaobjetos en posición vertical
Examinación al microscopio: Observamos el frotis con el microscopio en objetivo de
inmersión (100x) para determinar la morfología y la tinción de las bacterias. Las bacterias
Gram-positivas aparecerán de color púrpura, mientras que las Gram-negativas se verán de
color rosa o rojo.

Actividad N. º 3: Imagina que tienes que repartir un caldo de cultivo de un microorganismo

de nivel 3 en tres tubos, añadiendo 1 ml a cada uno de ellos.
Detalla:
El material que necesitarías.
Los pasos del procedimiento de preparación de las alícuotas.
Las medidas de seguridad que adoptarías en la operación.

Material necesario:
Caldo de cultivo del microorganismo de nivel 3: Preparado previamente en un matraz
Erlenmeyer o frasco estéril.
Micropipeta: Seleccionamos una pipeta automática que tenga una precisión adecuada para
medir 1 ml. Nos aseguramos de que esté calibrada correctamente.
Tubos estériles: Necesitaremos tres tubos eppendorf etiquetados adecuadamente para su
identificación.
Cabina de seguridad biológica: Realizamos la operación en una cabina de seguridad
biológica nivel III, que proporciona un ambiente controlado para trabajar con
microorganismos de nivel 3, minimizando el riesgo de exposición.
Guantes de nitrilo: Debemos usar guantes de nitrilo desechables de calidad adecuada para
manipular el material biológico.
Bata de laboratorio: Usamos una bata de laboratorio para evitar que los microorganismos
entren en contacto con tu ropa.

Pasos del procedimiento de preparación de las alícuotas:

Preparación del espacio de trabajo: Nos aseguramos de que el área de trabajo esté limpio y
desinfectado antes de comenzar. Esto incluye la superficie de trabajo y todos los equipos y
materiales que utilizaremos.
Colocación de los tubos: Colocamos los tres tubos estériles etiquetados en una rejilla o
soporte en la cabina para que estén listos para recibir las alícuotas.
Aspiración de la alícuota: Utilizamos una pipeta automática calibrada para medir con
precisión 1 ml del caldo de cultivo del microorganismo de nivel 3. Nos aseguramos de que la
pipeta esté bien ajustada para evitar derrames.
Transferencia a los tubos: Con cuidado, introducimos la pipeta en el primer tubo y
dispensamos el 1 ml del caldo. Luego, repetimos el proceso para los otros dos tubos,
utilizando una pipeta estéril diferente para cada uno.
Cierre de los tubos: Una vez que hayamos transferido el caldo a los tubos, cerramos
herméticamente las tapas de los tubos.
Limpieza y desinfección: Desinfectamos cualquier superficie y equipo que haya estado en
contacto con el caldo de cultivo del microorganismo de nivel 3. Desechamos los guantes y la
bata de laboratorio de manera adecuada.
Salida de la cabina: Antes de retirar nuestros brazos de la cabina, nos aseguramos de seguir
los procedimientos de descontaminación y desinfección recomendados.
Medidas de seguridad:
Uso de cabina de seguridad: Trabajamos exclusivamente en una cabina de seguridad
biológica de nivel 3.
Equipo de protección personal: Utiliza guantes de nitrilo y una bata de laboratorio
adecuada en todo momento.
Etiquetado: Etiqueta claramente los tubos con el nombre del microorganismo, la fecha y
cualquier otra información relevante.
Evita derrames: Manipula el caldo de cultivo con cuidado y evita derrames o salpicaduras.
Limpieza y desinfección: Desinfecta todo el material que ha estado en contacto con el
microorganismo de nivel 3 antes de sacarlo del BSB.
Eliminación de desechos: Desecha los materiales biológicos y desechables de manera
segura, siguiendo las normativas de tu institución y regulaciones locales.
Lavado de manos: Lávate las manos con cuidado después de completar la tarea y antes de
salir del laboratorio.