SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

JUAN GUILLERMO CUBILLOS HINOJOSA

Microbiologo Agroindustrial (c)MSc.

DETERMINACION DEL GRUPO COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES

FECALES (E.coli) EN ALIMENTOS MEDIANTE LA TECNICA DE
FERMENTACION EN TUBOS MULTIPLES
NUMERO MÁS PROBABLE (NMP)

1. INTRODUCCION

El grupo coliformes está formado por todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas,
gram negativas, no formadoras de esporas y con forma de baston que fermentan lactosa,
produciendo gas y acido en 48 horas a 35ºC+/-2. Este grupo lo comprenden varios géneros
de la familia Enterobacteriacea; se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza,
agua y suelo. Es habitual encontrarlos en el tracto intestinal del hombre y animales de
sangre caliente.

La determinación de coliformes fecales (E.coli) en los alimentos se utiliza para

diferenciarlos de otros grupos coliformes de otros orígenes. Los fecales son indicadores del
contacto de la materia prima o el procesamiento del alimento con materia fecal.

La presencia de coniformes en el alimento es signo de mala calidad higiénica en el proceso,

mala manipulación del alimento, recontaminación después del proceso y aun de
contaminación fecal.

La técnica de fermentación en tubos múltiples, los resultados del estudio de los tubos y
diluciones replicados se comunican en términos de Numero Mas Probable (NMP) de
microorganismos existentes. Esté numero, basado en determinadas formulas de
probabilidad, es un calculo de la densidad media de coliformes en la muestra.

2. OBJETIVO

 Determinar el grupo coliformes totales en muestras de alimentos.

 Adquirir destreza en la determinación de coliformes fecales (E.coli) en los
alimentos.
 Adquirir destreza en el montaje de la técnica de fermentación de tubos múltiples.
3. MATERIALES

 Caldo Bilis Verde Brillante

 Agua peptonada
 Tubos de ensayo tapa rosca
 Campanas Durham
 Micropipeta
 Pipetas de 1mL
 Maceradotes
 Probetas
 Incubadora
 Gradillas

4. METODOLOGÍA

Procesar la muestra y realizar las diluciones seriadas en agua peptonada.

Prueba para coliformes totales

 Pipetear 1mL de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento en tubos
con caldo bilis verde brillante, utilizando tres tubos por cada dilucion.
 Agitar suavemente los tubos e incubarlos a 35ºC +/-2 durante 24-48 horas.

Prueba para coliformes fecales (E.coli)

 Tomar a partir de los tubos positivos en C. totales una azada y transferirlas a los
tubos con caldo bilis verde brillante.
 Agitar los tubos e incubarlos a 44.5°C+/-2 durante 24-48h.

Prueba confirmatoria de (E.coli)

 Tome los tubos positivos de la prueba anterior y siémbrelos en una caja Petri que
contenga EMB.
Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas líquidas o sólidas)

10 10
ml Gramo
s

1ml 1ml

90 ml
Agua
pepto 9 ml 9 ml
na A.Pep APep
10-2 10-3
10-1

1 1
1 ml ml
ml

Incubar 35ºC +/-2 durante

24-48 horas

+ + +

Incubar 44.5ºC +/-2 durante

24-48 horas

Confirmar tubos positivos

sembrándolos en EMB e
incubando a 35°C+/-2
5. LECTURA DE RESULTADOS

 Coliformes totales

Pasado en tiempo de incubación, obsérvese los tubos que muestren fermentación

(turbidez) y producción de gas, que se observa por el desplazamiento del medio en
la campana de Durham; repórtelos como positivos.

 Coliformes fecales (E.coli)

Pasado en tiempo de incubación, obsérvese los tubos que muestren fermentación

(turbidez) y producción de gas, que se observa por el desplazamiento del medio en
la campana de Durham; repórtelos como positivos, teniendo en cuenta la prueba
confirmatoria de E.coli en agar EMB.

 Confirmación de E.coli

Obsérvese las colonias típicas de E.coli siguiendo las características establecidas

por el medio cultivo EMB y reporte los tubos confirmados como positivos.

6. EXPRESION DE LOS RESULTADOS

 De acuerdo a la serie obtenida en cada una de las pruebas, obsérvese la tabla anexa
de NMP para tres tubos.

 Los resultados se expresan como NMP/ g ó mL de alimento; hay veces dependiendo

del alimentos se expresa como NMP / 100mL. Los resultados de un análisis de
NMP, están directamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una
serie de resultados positivos, que son los más probables que ocurran cuando un
número dado de organismos están presentes en una muestra de alimentos.

Nota: En caso de realizar más diluciones que las que posea la tabla empleada, se puede
usar la siguiente fórmula para hallar el NMP por g ó mL:

(NMP de la tabla x Factor de dilución intermedio de la lectura)/ 100 = NMP/g ó mL

7. BIBILOGRAFIA

 INVIMA. 1998. Manual de técnicas de análisis para control de calidad

microbiológico de alimentos para consumo humano.
 BAM. 2002. Enumeración de coliformes y E. coli NMP. Cap 4 Metódo II
 Tabla de número más probable (NMP), número de tubos positivos.

Número de tubos positivos. Número de tubos positivos.

NMP NMP
10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3
0 0 0 <3 2 0 0 9.1
0 0 0 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6.1 2 1 1 20
0 1 2 9.2 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6.2 2 2 0 21
0 2 1 9.3 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9.4 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 3.6 3 0 0 23
1 0 1 7.2 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7.3 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 >1100