PRÁCTICA 11.

ANÁLISIS DE AGUA NUMERACIÓN BACTERIAS COLIFORMES TOTALES –

COLIFORMES FECLAES – E. coli.

 Caldo Lauril Triptosa

 Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis

FÓRMULA (en gramos por litro)

Peptona 10g/L
Lactosa 10g/L
Bile# 20g/L
Verde Brillante 0.0133 g/L

 Caldo E. coli (Confirmativo de coliformes fecales)

FÓRMULA (en gramos por litro

Tripteína 20
Lactosa 5
Sales Biliares 1.9
Fosfato dipotásico 4.0
Fosfato monopotásico 1.5
Cloruro de Sodio 5
 Medio EMB
RESULTADOS

Se prepararon 30 ml de Caldo Lauril triptosa 2x, 60 ml [x], es decir a una doble concentración, a
la misma se le colocó la campana de Dunhans, esta preparación se realizó con el fin de
determinar la presencia de coliformes totales en las muestras de agua obtenidas en los
alrededores de la UNSA, se agregó a los tres tubos cada uno con 10 ml de Caldo, al de
concentración 2x 10 ml de agua en estudio, a los otros 3 con concentración x 1 ml y a los
restantes 0.1 ml, es decir, 10-1, 10-2, 10-3 respectivamente, así teniendo como resultado:

Fig 1: Medios de cultivo para las aguas recogidas en los alrededores de la universidad de la
UNSA.

Fig 2. Medios de cultivo

Fig. 3. Se muestran marcadas las campanas de Dunhans flotando con O2 en su interior.

Como se muestra en la Fig. 3. Las campanas de Dunhans se encuentran flotando en relación a la

posición en la cual se las dejó inicialmente, es decir que en su interior hay O2, el mismo que nos
da un indicio de presencia de bacterias coliformes fermentadores de Lactosa con liberación de
gas, para lo cual con ayuda de asa de siembra con punta cerrada se dieron tres asadas al Caldo
Lactosado Verde Brillante Bilis (prueba confirmatoria de coliformes totales) de cada una de las
concentraciones de las realizadas con el caldo Lauril Triptosa, es decir, en total 9 tubos, cuyos
resultados fueron:

Concentración Caldo Lauril Triptosa Caldo Verde Brillante Bilis

10-1 +,+,+ +,+,+

10-2 +,+,+ +,+,+

10-3 +,+,+ +,+,+

[+]: Positivo para un tubo de liberación de O2

Para confirmar la presencia de coliformes fecales, se realizaron cultivos en medio EMB, para
cada una de las concentraciones, cuyos resultados fueron:

Fig. 4. Resultados de los cultivos para confirmar coliformes fecales.

Como se presenta, para coliformes fecales dio negativo, sin embargo, se presentó un color
metálicosindicativo en E. colia fecal en un borde a una concentración de 10-2. Para comparar se
muestra en la Fig. 3 un cultivo positivo de coliformes fecales en aguas de Huarangillo.

Fig. 3. Muestra positiva para E. coli fecales de aguas en

Huarangillo (color verde metálico).

Basándonos en los resultados de 3,3,3 para coliformes

totales y comparando con la tabla de Número Más Probable
(NMP/100ml) nos menciona que son: >1100.

fue mucho mayor.

DISCUSIÓN:

Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de

bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios
taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para
fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo
de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC.

Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo

<<coliforme>> forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter,
etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros
ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.

Una elevada proporción de los coliformes que existen en los sistemas de distribución no se debe
a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las
conducciones. Dado que es dificil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas
contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas
contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario.

Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales.
Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción
de ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de
sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas
cepas de Enterobacter y Klebsiella.

Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal. Pero
el verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es
seguro. Desde el punto de vista metodológico Escherichia coli es el Coliforme es positivo a la
prueba del Indol.
CUESTIONARIO

 Fundamente el método NMP, usos.

Es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando

una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible.

La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia en réplicas de diluciones

consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelos u
otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder
reconocer un atributo particular de la población en el medio de crecimiento a utilizarse. El
estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en
diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística. El atributo particular a usarse en esta
técnica es la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.

La metodología es la siguiente:

1) Muestras: colecte asépticamente las muestras frescas de suelo (10 gr) de varios lugares, u
obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcos.

2) Extracción de microorganismos viables: para muestras de suelo, las células podrán ser
removidas y homogenizadas añadiendo 1 gr de la muestra a un tubo de ensayo que contenga 9
ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.

3) Diluciones en serie: el extracto de suelo puede ser diluido serialmente transfiriendo 1ml a
un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Repetir en serie el procedimiento hasta alcanzar una dilución
10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar las diluciones seriadas
según el procedimiento anterior.

4) Placas Petri: utilizando un marcador, dividir la caja Petri en cinco zonas de igual tamaño.
Use una caja por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inoculado.

5) Inoculación: transfiera 5µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta

operación cinco veces por cada dilución.
6) Permita que el inoculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con una trilladle
de parafina, invierta la placa e inocule a 25ºC por 7 días.

7) Evaluación del crecimiento: para cada dilución es ascendencia evalué el crecimiento o No

crecimiento sobre cada replica inoculada. Reporte los resultados como se indica a continuación:

Datos y Análisis

Con ayuda de la siguiente tabla, determine la población estimada para su muestra. Si el patrón
de respuestas no se encuentra en la tabla, se promedia el valor estimado del patrón superior e
inferior en la tabla. Estos valores son el NMP sin ajustar. Para calcular la densidad poblacional
de la muestra, entonces tendrá que multiplicar el NMP sin ajustar por el factor de corrección de
volumen, por el reciproco del factor de dilución menor inoculado en la placa.
Para calcular el NMP de las diluciones mayores que las que señala la tabla, multiplicar en NMP
por el factor de dilución apropiado de 10, 100,1000. Por ejemplo, si se ha seleccionado tubos
provenientes de las diluciones: 10-2,10-3 ,10-4, multiplicar por 10, si de las diluciones 10-3,10-4
,10-5 multiplicar por 100.

ALGUNAS DE LAS VENTAJAS DEL NMP SON:

· La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un

proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinarla densidad poblacional de organismos
que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de
plantas.

· Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados.

· Determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente.

· Suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento
en platos de cultivo, entre otros.

Se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar en medio sólido. También se
usa para determinar el número de células de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio
líquido determinado. Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminación del agua
potable, determinando el número de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene
lactosa. Estas bacterias probablemente sean Escherichia Coli provenientes de aguas residuales
contaminadas, y la presencia de E. Coli en el agua potable es una prueba presuntiva de
contaminación

APLICACIÓN

Este método se usa para contar microorganismos difíciles de cultivar en medio sólido,o para
determinar el número de células que pueden crecer en un medio líquido determinado, como el
análisis para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de
bacterias Escherichia coli que pueden crecer en un medio con lactosa. La presencia de E. coli en
el agua potable es una prueba de contaminación.

En microbiología, el método se emplea habitualmente realizando diluciones en serie de un

cultivo de bacterias en un medio de crecimiento, y luego divisiones adicionales en serie hasta
obtener partes alícuotas. Los cultivos son incubados y evaluados a ojo, eludiendo el tedioso
recuento de colonias, o el caro y tedioso recuento microscópico.

 Diferencie Coliformes totales, coliformes fecales, E.coli

- características morfológicas y tintoriales.

Bacilo Gram negativo.

No forma esporas

Móviles (flagelos perítricos).

Miden 0.5 µ de ancho por 3 µ de largo.

Catalasa positivos.

Oxidasa negativos.

Reducen nitratos a nitritos.

Producen vitamina B y K

-características nutricionales:

No exigente.

Fermenta glucosa y lactosa con producción de gas.

Es anaerobio facultativo

características coloniales:

Las colonias de E. Coli en agar E.M.B. (eosina y azul de

metileno) tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de
color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico
cuando se observan con luz refleja.

En agar MacConkey las colonias so n rojas con halo turbio.

Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

 Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva,

a tubos que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.

 Agitar suavemente los tubos para su homogeneización. Incubar a 35 . 2 C durante 24 a

48 h..

 Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y

producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h..

 Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos

coliformes totales/100 mL.

Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

 Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva

a tubos con caldo EC.

 Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.

 Incubar a 44.5 C en incubadora o un baño de agua con circulación durante 24 a 48 h.

 Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción
de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.

 Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos

coliformes fecales/ 100 mL.

Prueba confirmativa para Escherichia coli

 Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por estría
cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.

 Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.

 Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial:

 Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias
con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada
placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de
morfología microscópica y pruebas bioquímicas.

 Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.

 Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de
bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.