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Extraccin de la Muestra:
El camarn blanco se obtendr en alguno de los mercados de Texcoco de Mora,
Edo. De Mxico resultando una muestra grande (aprox. 350 g), la cual ser
utilizada para los diferentes anlisis a realizar.
Preparacin de muestras:
Para cada uno de los ensayos microbiolgicos, la preparacin consistir en tomar
una muestra representativa que consiste en 50 gramos aproximadamente de
camarn y cortarla en pequeos trozos, utilizando los cuchillos, cucharas,
tenedores y la tabla de picar estriles. Una vez homogenizada la muestra se
procede a tomar la muestra para el anlisis que son 25 g. Con dicha muestra se
proceder a realizar el sistema de diluciones:
Para realizar la dilucin primaria ser pesarn 25 gramos del alimento en cuestin
(previamente picado) en condiciones aspticas, teniendo la muestra ya pesada se
pasara al vaso de la licuadora que ya ha sido previamente lavado y esterilizado,
agregar los 225 ml del diluyente (agua destilada) y licuarlo. Una vez terminado de
licuar se verter el licuado en el frasco y se agitar vigorosamente para
homogenizarlo. Esta ser la dilucin 10-1.
Para realizar la segunda dilucin se tomar 10 ml de la primera dilucin y se
verter en uno de los frascos que contiene 90 ml del diluyente y se homogenizar
perfectamente, resultando la dilucin 10-2.
Por ltimo, se tomarn 10 ml y se verter en el ltimo frasco que contiene 90 mL
del diluyente y se homogenizar perfectamente. Esta es nuestra dilucin 10 -3.
Realizar el etiquetado correspondiente.
1. CUENTA MESOFLICA VIABLE
Se requiere para investigar el contenido de microorganismos viables en un
alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta de UFC en placa. Esta
tcnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el
medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxgeno,
permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en
diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesoflicas aerobias o mesfilos
aerobios son un indicador general de la poblacin que pueden estar presente en
nuestra muestra de camarn y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido
manejado este producto.
Agar nutritivo
-Fundamento:
Metodologa:
A partir de las diluciones decimales tomar una muestra de 0.1 mL de cada dilucin
a las placas con agar nutritivo previamente solidificada. Se realizara este proceso
3 veces para tener 3 placas con lo cual las comparaciones sern ms fciles.
El inoculo se disemina por la superficie con ayuda del varilla de vidrio en L.
Se colocarn las placas en una estufa en forma invertida a 37C, tratando de no
daarlas.
Transcurrido 24 horas de incubacin se procede a hacer el recuento de colonias
aisladas. Se toman las placas que contengan de 30 a 300 colonias, para
determinar las UFC se usa un cuenta-colonias.
El nmero de colonias multiplicado por el factor de dilucin utilizada proporciona
las UFC y as el nmero aproximado de microorganismos por gramo o mililitro de
la muestra analizada.
2. DETERMINACIN DE ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES
En un anlisis microbiolgico de alimentos, los coliformes son el grupo principal de
microorganismos que se detectan para determinar prcticas higinicas
inadecuadas en el procesamiento de dicho alimento. Puesto que estos
microrganismos habitan principalmente en el tracto digestivo de los humanos, la
presencia de estos indicara que el alimento tuvo contacto con heces fecales, ya
sea directa o indirectamente.
Fundamento:
Metodologa:
Fundamento:
Metodologa:
Fundamento:
Metodologa:
De los tubos de ensayo con reaccin positiva (de la prueba para coliformes
totales con produccin de gas dentro del tubo con caldo lauril sulfato) se
tomar una asada y se sembrarn en los tubos respectivamente con caldo bilis
verde brillante con la campana de Durham dentro, procurar la inexistencia de
burbujas en el medio y posteriormente incubarlos a 37 C durante 24 horas.
Transcurrido el periodo de incubacin, se considera positiva la prueba si se
observa produccin de gas en la campana de Durham dentro del medio en
cualquiera de los tubos inoculados.
4. DETERMINACIN DE E. Coli
El hbitat natural de este organismo es el intestino del hombre y de los animales
vertebrados. En aguas templadas este organismo no se encuentra ni en el
pescado ni en los crustceos en el momento de la captura (excepto en aguas
fuertemente contaminadas). As que determinar la presencia de este
microorganismo en camarones nos indicar que las buenas prcticas de
manufactura no fueron las adecuadas o que el medio en el cual se desarroll este
crustceo estaba contaminado con materias fecales.
Medio de cultivo a utilizar:
Caldo Escherichia Coli
Fundamento:
Metodologa.
De los tubos positivos del caldo verde brillante bilis, de forma asptica se tomar
una asada y se inocula en los tubos con Caldo E.C., Incubar en estufa de 40-50
C.
Para la identificacin de E. coli se basa en la propiedad de los
microorganismos coliformes para producir gas a partir de glucosa y
fermentacin de lactosa dentro de las 48 horas de incubacin a 44.50.2C.
El resultado de los tubos positivos se consultar las tablas de Numero Ms
Probable, lo cual proporcionar una estimacin del nmero de microorganismos
coliformes (E. coli) presentes en una muestra de un gramo o mililitro.
4.1.
Aislamiento de E. Coli
Fundamento:
Metodologa.
1.- De cada tubo positivo de caldo E.C, transferir una asada a una placa con agar
EMB. Sembrar por agotamiento en estras, de forma de obtener colonias aisladas.
2.- Incubar a 35 C 1 C durante 24 2h.
3.- Al trmino del perodo de incubacin observar las colonias que presentan un
centro oscuro, con o sin brillo metlico. Las colonias descoloridas se descartan del
grupo de Coliformes.
5.- Realizar Tincin Gram como confirmacin morfolgica para presencia de E.
coli. Que corresponde a bacilos Gram Negativos y no forman esporas
4.2.
A pesar de que los medios de cultivo anteriormente utilizados son selectivos para
el desarrollo de E. coli es necesario realizar pruebas bioqumicas para asegurar la
presencia de este microrganismo en el alimento.
a) Produccin de Indol
Inocular una asada de una colonia sospechosa del medio EMB en un tubo que
contiene 7 ml de medio SIM mediante puncin e incubar a 35 C 1C por 24 2
h. Finalizada la incubacin aadir 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovacs y agitar.
5. DETECCIN DE S. aureus
La Bacteria Estafilococos Aureus no es una bacteria autctona de los productos
pesqueros, pero estos pueden ser contaminados debido a su estrecha relacin
Fundamento
Metodologa
Con una pipeta tomar 0.1 ml de la dilucin y vaciarlo en la caja Petri con el medio
de cultivo Baird Parker. , extender homogneamente sobre la superficie del cultivo
con la varilla de vidrio en L. Hacer tres repeticiones para cada dilucin.
Incubar en la estufa de 24-48 h.
Si hay colonias de coloracin (negras) tpica de s. aureus, hacer Tincin Gram.
Si hay presencia de cocos Gram positivos podemos predecir que hay presencia
de S. aureus.
5.1 Purificacin del microorganismo S. aureus
A pesar que el medio de cultivo Baird Parker es un medio selectivo para el
desarrollo de S. aureus, no es completamente confiable la presencia de esta
Agar nutritivo
Metodologa
Del cultivo obtenido en Baird Parker se tomara una muestra con un asa y se
sembrara por estra cruzada en el agar nutritivo. Se dejara incubar de 24 a 48 h a
35C aprox.
Emulsin en colonias en tubos con caldo Cerebro Corazn (BHI por sus
siglas en ingls)
Fundamento
Metodologa
Del cultivo obtenido en Agar nutritivo con colonias tpicas, se tomar una muestra
con un asa estril y se inocularan los tubos contenedores de caldo cerebro
corazn. Se incubarn a 35C aproximadamente, durante 24 h.
Determinacin de actividad coagulasa.
Material a utilizar:
Plasma de conejo
Metodologa
RESULTADOS
Cuenta Mesoflica Viable
Dilucin de la
muestra inoculada
No. De cajas
inoculadas
Dilucin 10-1
-2
Dilucin 10-3
Dilucin 10
UFC totales=
(45)(10)
0.1ml = 4,500 UFC/g o ml de
muestra de camarn.
Determinacin de organismos Coliformes totales
Para crecimiento en tubo
Dilucin de la
muestra inoculada
No. De tubos
inoculados
Dilucin 10-1
No. De tubos
positivos
(produccin de
gas)
3
Dilucin 10
-2
Dilucin 10
-3
No. De cajas
inoculadas
Dilucin 10-1
-2
Dilucin 10-3
Dilucin 10
UFC totales=
Basndonos en los resultados de una caja que present el mayor crecimiento (20
colonias aisladas) correspondiente a la dilucin 10 -1, se determinaron los
siguientes resultados:
UFC totales en Cuenta mesoflica viable:
(20)(10)
= 200 UFC/g ml de muestra
1 ml
de camarn.
Determinacin de organismos Coliformes fecales
Dilucin de la
muestra inoculada
No. De tubos
inoculados
Dilucin 10-1
No. De tubos
positivos
(produccin de
gas)
3
Dilucin 10
-2
Dilucin 10
-3
Determinacin de E. coli
Para crecimiento en tubo con caldo E. coli
Dilucin de la
muestra inoculada
No. De tubos
inoculados
Dilucin 10-1
No. De tubos
positivos
(produccin de
gas)
1
Dilucin 10
-2
Dilucin 10
-3
No. De cajas
inoculadas
Dilucin 10-1
Presencia de
colonias
sospechosas para
E. coli
+
Dilucin 10-2
Dilucin 10-3
Colonia sospechosa
para E. coli
Col. 1/ dilucin 10-1
Col. 2/ dilucin 10-1
Observaciones en tincin de
Gram
Cocobacilos
Gram
(-)
no
esporulados.
Presencia de bacilos gram (-) de
diferentes
tamaos.
Predominancia de cocobacilos
gram (-) no esporulados,
Presencia de bacilos gram (-) de
diferentes
tamaos.
Predominancia de cocobacilos
gram (-) no esporulados,
Cocobacilos
gram
(-)
no
esporulados.
Colonia no aislada
Colonia
aislada,
sospechosa para E. coli
Produccin de Indol
Rojo de Metilo
Prueba de Voges-Proskauer
Prueba en caldo citrato Koser
+
-
No. De cajas
inoculadas
Dilucin 10-1
Presencia de
colonias
sospechosas para
S. aureus
+
-2
Dilucin 10-3
Dilucin 10
Observaciones en tincin de
Gram
Coco Gram (+) no esporulados.
Presencia de cocos gram (+)
diferentes tamaos.
Presencia de cocos gram (+) de
diferentes tamaos.
No. De cajas
inoculadas
Dilucin 10-1
Dilucin 10-2
Dilucin 10-3
Crecimiento de
colonias
sospechosas para
S. aureus
Crecimiento
homogneo
Crecimiento
homogneo
Crecimiento
homogeneo
No. De tubos
inoculados
1
No. De tubos
positivos
(turbidez)
1
Dilucin 10-2
Dilucin 10-3
Actividad
coagulasa
-
Dilucin 10
-2
Dilucin 10
-3
ANALISIS DE RESULTADOS
Cuadro 1. Especificaciones sanitarias de la Secretara de Salud para crustceos fresco-refrigerados y
congelados
Parmetro
Lmite mximo
Menos de 10
400 NMP/g
Ausente en 25 g
1000 UFC/g
Negativo
10 000 000 UFC/g
Fuente: Norma Oficial Mexicana NOM-029-SSA1-1993, Bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustceos frescos, refrigerados y congelados.
Especificaciones sanitarias.
El producto, una vez libre de vsceras, cabeza o concha, debe lavarse con agua de mar limpia o agua potable;
en el caso de los pescados, esto debe hacerse hasta que cese el sangrado.
Las vsceras, as como los desechos destinados al consumo animal o al uso industrial no alimentario, deben
conservarse en condiciones que eviten su descomposicin y separarlos de los de consumo humano.
El mtodo de descongelacin aplicado a los productos no debe representar una fuente de contaminacin
para el mismo. La temperatura interna del producto no debe exceder los 4C.
6.10.2 La descongelacin se debe efectuar en lugares cerrados y en condiciones de higiene.
6.10.3 Cuando se emplee agua como medio de descongelacin sta debe ser potable, y la
circulacin debe ser suficiente para lograr una descongelacin uniforme.
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