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Trabajo Prctico N3

Determinacin de bacterias coliformes totales, coliformes fecales y


Escherichia coli por la tcnica del nmero ms probable (NMP).

Introduccin
Las bacterias del grupo coliformes se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y en la
mayora de las especies de animales, son casi exclusivos de la materia fecal y por esa razn se
consideran como indicadores de contaminacin fecal. Tienen la capacidad de desarrollarse extra
intestinalmente, observndose en aguas potables, por lo que se utiliza como indicador de
contaminacin fecal en agua, encontrndose que mientras mayor sea el nmero de coliformes en agua,
mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.

Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales que fermentan la
lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C.

El grupo de coliformes fecales capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de
incubacin a 44.5 1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms
prominente es Escherichia coli.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y
animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades
diarreicas. Estas se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia
nicos, cada grupo provoca enfermedad mediante un mecanismo diferente.

En este trabajo prctico determinaremos por la tcnica del nmero ms probable (NMP) la existencia
de estos microoganismos (coliformes) en las muestras de agua aportadas por los alumnos.

La tcnica NMP es el nico procedimiento de determinacin que puede utilizarse en aguas turbias o
cuando la muestra presenta semi slidos como sedimentos o barros, se fundamenta con la capacidad
que tiene el grupo de coliformes de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a
35C 1C durante 48 h, utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin
consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo
que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos
daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como
fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis
verde brillante y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las
sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos
coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en
la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una
temperatura de 44.5 1C por un periodo de 24 a 48 h.
Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los
cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar
eosina azul de metileno)

Objetivos
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua aportadas por los alumunos mediante la bsqueda de
microorganismos coliformes totales y coliformes fecales.

Procedimiento
Se prepar 100 ml de KH2PO 4 ajustando con NaOH el pH final a 7,2 y luego se los esteriliz en
autoclave. Se tomaron 3 tubos previamente esterilizados y se trasvasaron 9 ml de la solucin buffer a
cada tubo. Se tom 1 ml de la muestra contaminada y se lo pas al tubo de ensayo con 9 ml de
solucin buffer, se lo agit bien y de ese mismo tubo de ensayo con la muestra contaminada se tom 1
ml y se lo coloc en el otro tubo de ensayo para lograr una dilucin de 10 -2 y luego se hizo lo mismo
con el ultimo tubo de ensayo logrando una dilucin de 10 -3.

Luego se prepar 100ml de medio de cultivo lauril sulfato y se trasvas a 9 tubos de ensayo con
campana de Durham con 10 ml cada una .se los tap y esteriliz en autoclave. Se agreg 1 ml de cada
dilucin seriada de la muestra contaminada preparada anteriormente a 3 tubos de ensayo.
Obteniendo 3 tubos de ensayo con 1 ml de dilucin 10 -1, 3 tubos con 1 ml de dilucin 10-2 y 3 tubos
con dilucin 10-3. A los 9 tubos se los tap y se los incub en estufa a 37C por 48 horas.

Tambin se prepar 100ml de medio de caldo Verde brillante bilis (determinacin de coliformes
totales) y medio de cultivo EC (determinacin coliformes fecales). Se los pas a 10 tubos de ensayo
con 10 ml de caldo de verde brillante y 10 tubos de ensayo con medio de cultivo EC. Cada tubo tiene
una campana Durham en su interior. Se los tap y esteriliz en autoclave.

Pasadas las 48 horas se observ en determinados tubos la turbidez del medio de cultivo y la
generacin de gas dentro de la campana de Durham, clasificando los tubos que muestras esas
caractersticas como positivos (prueba presuntiva).
Para primera dilucin se observaron 3 tubos de ensayo positivos, de la dilucin 10 -2 se observaron 2
tubos de ensayo positivos y uno negativo y en la dilucin 10 -3 se observaron 2 tubos positivos y uno
negativo.

Por cada resultado positivo en la prueba presuntiva se sembr en los tubos de ensayo con medio de
cultivo de verde brillante y EC. Con un ansa previamente esterilizada con calor se la carg con la
muestra positiva y se introdujo en los tubos de ensayo con medio de cultivo repitiendo el
procedimiento tres veces por cada tubo de ensayo y esterilizando el ansa cuando se cambia de
muestra y de medio. Se los tap, los tubos con medio caldo verde brillante bilis se los incub por 48
horas en estufa a 37C y los tubos con medio EC se los incub durante 48 horas en estufa a 44C.
(Prueba confirmativa)
pasadas las 48 horas se procedi a determinar los tubos donde hubo generacin de gas dentro de la
campana, turbidez y variacin de color del medio de cultivo.

En el medio de cultivo Verde brillante se observ:


En los 3 tubos con dilucin dieron positivo con mayor presencia de gas que el resto de los medios de
cultivos ms diluidos, tambin se observ una variacin de color verde claro
En los 2 tubos dieron positivo observndose presencia de gas variacin de color verde claro y
turbidez en el medio.
En 1 tubo de dio positivo. El tubo que dio positivo fue el que menor presencia de gas tena tambin se
observ la variacin de color a un vede ms claro que los otros tubos de ensayo

En el medio de cultivo EC
3 tubos dieron positivo: mayor presencia de gas.
2 tubos dieron positivo y uno dio negativo.
1 tubo de dio positivo.
Las muestras que dieron negativa en los medios de cultivo fueron descartadas.

Luego se prepar medio de cultivo Agar EMB (eosina y azul de metilo) se lo esteriliz en autoclave y
luego se plaque. Se sembraron las placas dentro de la campana de flujo laminar con un ansa
previamente esterilizada con calor a partir de aquellos tubos que dieron positivos para coliformes
fecales. Se incub las placas en estufa a 35C durante 48 horas. Luego se determin el crecimiento de
E. coli observando en las placas sectores con brillo verde metlico.

Resultado y discusin
Mediante los datos obtenidos sobre los tubos que nos dieron positivo se pudieron armar as
siguientes tablas se puedo armar la siguiente tabla

Tabla 1: ndice de NMP/cm3 segn nuestros tubos positivos para la fase confirmativa de
medio cultivo Verde brillante para coliformes totales.

Numero de tubos con reacciones positivas

3 tubos 1/10 3tubos 1/100 3 tubos 1/1000

3 2 2

De la tabla 1 se pudo determinar que el ndice de NMP/cm 3 es de 210 bacterias

Tabla 2: ndice de NMP/cm3 segn nuestros tubos positivos para la fase confirmativa de medio
de cultivo EC para coliformes fecales.

Numero de tubos con reacciones positivas

3 tubos 1/10 3tubos 1/100 3 tubos 1/1000

3 2 1

De la tabla 1 se pudo determinar que el ndice de NMP/cm 3 es de 150 bacterias.


Al observar las placas sembradas e incubadas con muestras positivas de coliformes fecales de distintas
concentraciones no se encontr presencia de crecimiento de E.coli en el medio de cultivo aunque se
observ el crecimiento de coliformes.
La ausencia de crecimiento de E.coli puede ser por varias razones, puede que la concentracin de la
misma haya sido muy baja. Tambin pudo haber sido que hayamos calentado mucho el ansa con el
que trabajamos y haber matado E.coli, pero se observ crecimiento de otras colonias de
microorganismos obtenidas de la muestra por lo tanto se descart esa teora.

Conclusin
Mediante este trabajo prctico se pudo evaluar la calidad sanitaria de las muestras de agua a travs
de la tcnica del nmero ms probable dando como resultado el ndice de bacterias de nuestra
muestra inicial.

Podemos que esta tcnica es muy til para determinar contaminacin de coliformes en aguas lo cual lo
vuelve una tcnica sumamente importante en la evaluacin de calidad sanitaria ya que los grupos de
coliformes son organismos patgenos por lo tanto pueden producir enfermedades.

Bibliografa
Microbiologa ambiental 2016, Trabajo practico N3, Determinacin de bacterias coliformes totales,
coliformes fecales y E. coli por la tcnica del numero ms probable (NMP).