PRÁCTICA 10: DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN AGUA

I. INTRODUCCIÓN

Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos

presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más
comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia,
así como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer
microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el
recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias

(UFC) o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP).

El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y
actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método
fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de
alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser
aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios
en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método
es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de
suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces

de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales.

Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces

están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que
los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de
los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia
de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por su
capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica
que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los
Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales
homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de
materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado
como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta
 como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar
presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan
exentos de organismos productores de enfermedades.

II. OBJETIVOS
a. Familiarizarse con los métodos de recuento, especialmente con el
de NMP.
b. Detectar bacterias coliformes en agua
c. Detectar si la muestra traída es apta para el consumo humano.

III. MATERIALES
a. Muestra: Agua de río
b. Medios de cultivo: Caldo Brilla (presuntivo)
c. Tubos de dilución
d. Pipetas de 10 y 1 mL
e. Bombilla de aspiración
f. Mecheros
g. Gradillas
h.
IV. PROCEDIMIENTO
 Muestra tomada en el río Caplina

 Se sigue el siguiente flujograma para la muestra de aguas

  Luego, incubar a 35 ºC ± 1 por 24 h.
 Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia de gas). Ésta se
observa en las campanas.
 Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h más.

V. RESULTADOS
 De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para
coliformes Totales y fecales termotolerantes:
 Determinar un código de tres cifras con la combinación de tubos
positivos y negativos obtenidos en cada dilución, en el ensayo
confirmativo para calcular por referencia en la tabla.
 Con el código establecido, entrar a la tabla NMP de Standard Methods
y leer directamente el número más probable de bacterias coliformes
por 100 mL, en la columna correspondiente al número de tubos
sembrados en cada dilución.
 En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos
adecuada, emplear para los cálculos la siguiente ecuación:

 A LAS 24 HORAS DE HABER REALIZADO EL PROCEDIMIENTO

DE OBTUVO LO SIGUIENTE:
o Caldo brilla concentración media

o Caldo brila con concentración normal

 o Caldo brila con doble concentración

10 ml 1ml 0.1 ml
+ + + + + + + + +

Para la prueba de coliformes totales, los tres tubos de las tres

concentraciones diferentes resultaron POSITIVOS (3 DE 3) ubicando estos
resultados en la tabla se obtiene:
El NPM para esta muestra de agua es de >=2400/100mL

La prueba de fecales termo tolerantes resulto NEGATIVA y eso se puede

adjudicar a que pasó mucho tiempo para hacer el sembrado nuevamente y
ya no se tornó viable.

VI. DISCUSIÓN
Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y
constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas
usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la
familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para
fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos
rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de
incubación comprendida entre 30-37ºC.
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del
Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al
incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que
contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase
 presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo
que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación
de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra
y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante
la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis
verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos
microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde
brillante. La determinación del número más probable de microorganismos
coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba
presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar
la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5°
0.1° C por un periodo de 24 a 48 h.

VII. CONCLUSIONES
 Se logró realizar las pruebas del NMP diferenciando los coliformes totales
de los coliformes termotolerantes en el Río Caplina, Tacna.
 Con base a las pruebas presuntiva, confirmativa realizadas se informa
que el agua del Río Caplina tiene presencia de Coliformes totales.
 El agua del río Caplina no es apta para consumo humano.

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método del NMP?

VENTAJAS:
 La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos
relacionados a un proceso (selectividad).
 Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de
suelos diversificados.
 Determina solo organismos vivos y activos metabólicamente.
 Suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos
tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.
 Determina cargas microbianas baja, pero también pueden emplearse
para determinar cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.
  Presenta ventajas frente a otros métodos para el caso de muestras
como polvos insolubles.
 Preferible para microorganismos que presentan crecimiento lento o
han sido sometidos a condiciones adversas.
 Es posible enumerar microorganismos anaeróbicos utilizando medios
prereducidos, cubriendo con vaselina.
DESVENTAJAS:
 No detectan las poblaciones con menos de una célula por mililitro,
sólo permite microorganismos viables.

2. ¿Qué otra técnica conoce para la determinación de coliformes?

 Técnica de filtración sobre membrana, donde determina mediante la
filtración de volúmenes específicos de la muestra a través de filtros de
membrana.
 Se pueden realizar diluciones consecutivas (10-1, 10-2, 10-3) del 1 ml
de muestras en 9 ml de agua pectonada (1%) entres tubos, de los
cuales se toma para cada caso 1 ml de dilución y se le agrega a otros
tres con caldo BRILA a concentración normal.
 Otra forma es transferirse de la muestra original 10ml a los tres
primeros tubos conteniendo 10 ml de caldo BRILA doble concentrado,
1ml a los tres siguientes y 0.1 ml a los tres restantes; ambos a
concentración normal. La muestra puede ser diluida ser seriadamente
transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de caldo. Cada transferencia
corresponde a una dilución de 1 en 10. Se puede dividir la placa petri
en cinco zonas de igual tamaño. Usar una placa por cada muestra.
Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inoculado: Transferir
5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repetir esta
operación cinco veces por cada dilución: Permitir que el inóculo seque
sobre el medio de crecimiento. Selle la placa. Invierta la placa e
incubar a 25°C por 7 días.