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Universidad Nacional «Daniel Alcides Carrión»

La Universidad mas alta del mundo con excelencia académica


y responsabilidad social
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
EFP INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

METODOS DE CULTIVO

TEMARIO: SEMANA 3

Métodos de Cultivo:
• Método Tubos Múltiples (NMP)
• Método de Placas secas rehidratables:
Mg. Blgo. Julio IBAÑEZ OJEDA
Docente D.E.N. Placa Petrifilm 3M
jibanezo@hotmail.com • Método de Sustrato Definido (Colilert
Cel: 976799595 Enterolert).
MÉTODOS DE CULTIVO

 Método de tubos Múltiples (NMP)


 Método de recuentos rápidos (Petrifilm)
 Método de sustrato definido (Colilert y Enterolert)
 Método de filtración de membrana.
METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE O TUBOS MULTIPLES

 Se preparan 3 juegos de 5 tubos c/u (serie de 3x5) ó 3 juegos de 3


tubos cada uno (serie de 3x3)
 Se puede efectuar la preparación del medio de cultivo (caldo) como
pre dispensado (recomendable) o post dispensado, en este caso
debe esterilizarse todo el medio en un matraz y luego verter en los
tubos.
 Se inoculan en cada juego 1 ml de inóculo según su dilución (10-1,
10-2, 10-3 u otros) dependiendo del nivel de contaminación de la
muestra.
 Se introduce la campana de Durham invertidas cerciorándose que no
haya atrapado aire.
 Se lleva a incubación según el tiempo especificado 37ºC para
coliformes totales y 44.5º C para coliformes termotolerantes y E. coli
 Luego, para el contaje se usa la tabla del NMP que permite calcular
el numero de microorganismos.
 Por ejemplo: si existen tubos positivos: 5-3-1, en la tabla se obtiene
el NMP 110 bacterias/100 ml. Esto significa que el 100 ml. De
muestra contendrán 110 bacterias.
Tabla de Numero Mas Probable (NMP) de 3 x 1, 3 x 0,1 y 3 x 0,01 g(ml).
Tabla de Numero
Mas Probable (NMP)
de 5 x 1, 5 x 0,1 y 5
x 0,01 g(ml).
METODO DE PLACAS SECAS REHIDRATABLES
(Placas Petrifilm3M)
PLACAS PETRIFILM 3M
 Tiene cuadrículas que facilita el recuento de las colonias.
 Se puede leer con contador Quebec o con magnificador.
 Menos pasos y trabajo para exámenes. Con ello, también podrá
hacerse mas exámenes al mismo tiempo, con el mismo personal
y en la misma locación.
 Las colonias son fácilmente de interpretar y disminuye las
posibilidades de error.
 Colonias pueden ser recogidas con asa para su ulterior análisis.
 Menos peso y volumen que las placas tradicionales, reduce
costos de desecho.
 Las placas Petrifilm3M están recubiertas con nutrientes y agentes
gelatinosos.
 Las placas se inoculan con un mililitro (1 ml.) de muestra diluida
y se incuban.
 Indicadores especiales colorean las colonias dándoles contraste,
lo cual facilita su identificación.
PASOS PARA RESULTADOS PRECISO Y CONSISTENTES

 Inocular - dispensar 1ml. de muestra, el cual puede


hacerse con una pipeta convencional o pipetor electrónico.
 Incubar a la temperatura apropiada, según la placa.
 Contar las colonias y con ello termina el trabajo.
 Las Placas PetrifílmTM, están hechos de dos capas o
láminas:
 Lámina superior: Presenta 3 partes: una película de
polipropileno; un adhesivo con indicador de colonias
(TTC, cloruro de trifenil tetrazolio) y gel soluble en agua.
 Lamina inferior: Presenta 3 componentes: nutrientes
mezclados con gel soluble en agua fría; adhesivo y papel
laminado con polipropileno impreso con cuadrículas.
Bolsa con placas, cerrar Colocar las placas en superficie plana, Colocar perpendicularmente
levantar el film superior la pipeta con 1 ml. de muestra.
adecuadamente.

Bajar el film evitando que Colocar el aplicador, si la placa lo necesita, Levantar el aplicador. Esperar unos
sobre el film superior y presione. minutos para que se solidifique el
se atrapen burbujas.
gel. Luego incubar.

Vista de los dos film que presenta


Leer las placas con un cuenta Forma como sacar la muestra para hacer la placa petrifilm.
colonias y una fuente de luz. cultivos posteriores.
Basado en el AOAC(método validado internacional)
E. coli = 49 (colonias azules con gas)
Coliformes totales = 87 (colonias rojas y azules con gas)
Para todos los métodos, el rango de recuento para la
población total en placas Petrifilm (CEE) es 15-150

Mohos: colonias grandes, de colores variables,


bordes difusos, y núcleo central.
RECUENTO RÁPIDO
CARACTERISTICAS EN COLILERT
DE PLACAS Y ENTEROLERT
PETRIFILM 3M

ESPECÍFICO

 Reduce al mínimo los resultados falsos positivos y la


necesidad de notificaciones injustificadas (por ejemplo,
positivo a coliformes fecales por Klebsiella
pneumoniae)
 Elimina interferencias heterotrópicas y la necesidad de
repetir el muestreo a causa de crecimiento confluente.
 No es necesario efectuar los pasos de enriquecimiento
previo ni de confirmación posterior.
 Inhibe hasta 2 millones de heterótrofos por cada 100 ml
 Elimina la interpretación subjetiva, típica de los
métodos tradicionales
 Detecta selectivamente, desde un coliforme o E. coli
viable por muestra de 100 ml.
CARACTERISTICAS DE PLACAS PETRIFILM3M

RÁPIDO

 Resultados confirmados y completos en 24 horas. No


necesita confirmación
 Los resultados están listos de 24 a 72 horas antes que
con los métodos tradicionales.
 Requiere menos de 2 minutos de trabajo físico.
 Proporciona una indicación mucho más temprana de
riesgos potenciales de salud.
 Menos de un minuto de trabajo físico
 Detecta simultáneamente coliformes y E. coli en 24
horas o menos.
 No necesita lavar frascos ni contar colonias.
CARACTERISTICAS DE PLACAS PETRIFILM3M

SENSIBLE

 Detecta desde un solo microorganismo viable (1 ufc/100 ml).


 Recupera bacterias dañadas o debilitadas por tratamientos.
 Proporciona un monitoreo más confiable y efectivo para la
protección de la salud pública.

ECONÓMICO

 Reduce dramáticamente los costos de mano de obra. Minimiza


horas extras
 No requiere de preparación de medios, ni de limpieza.
 No se requiere ningún equipo costoso. Reducción del 95% en
costo de equipos
 No hay desperdicio de medios.
 Ahorros del 20 al 50% por prueba comparado con los métodos
tradicionales (Según AWWARF Research Application # 4)
 Estable hasta 12 meses a temperatura ambiente.
MÉTODO DE SUSTRATO DEFINIDO
(COLILERT Y ENTEROLERT)

COMPROBADO

• Se ha examinado ampliamente en evaluaciones de campo a nivel


nacional.
• La única prueba de 24 horas para diferentes tipos de agua aprobado por
la USEPA para el análisis de agua potable y agua de abasto.
• Aprobado por la AOAC para el análisis de agua en alimentos.
• Incluido en la 18a edición de US Standard Methods.

CONVENIENTE

• Resultados claros y fáciles de leer.


• Viene ya medido, en dosis unitarias y listo para usarse.
• La obtención de la muestra, la incubación y la lectura pueden realizarse en
el mismo recipiente.
• Adecuado para usarse en el campo.
• Reduce al mínimo la necesidad de hacer análisis los fines de semana o
fuera de horas de trabajo.
• Estable hasta 15 meses a temperatura de habitación.
• Siempre listo para usarse en casos de emergencia.
MÉTODO DE SUSTRATO DEFINIDO
(COLILERT Y ENTEROLERT)

FÁCIL

 Su facilidad de uso simplifica el entrenamiento


 Disponible en paquetes predosificados
 No necesita repetir la prueba debido a filtros obstruidos o
interferencia heterotrófica
 15 minutos al mes para el control de calidad.

PRÁCTICO

 Un paquete de Colilert puede ser utilizado para P/A o prueba


cuantitativa.
 Con Quanti-Tray se pueden contar hasta 200 ufc/100 ml sin
diluciones.
 Con Quanti-Tray/2000 se pueden contar hasta 2,419 ufc/100 ml sin
diluciones Colilert viene también en tubos NMP de 10 ml
predispensados.
Frascos Colilert

Fluorescente = presencia de E. coli;


Amarillo = coliformes y,
Blanco = ausencia

Set de 10 tubos de prueba para el pre-dispensado


Prueba de mezclado y dispensado posterior.
Procedimiento mas economico en análisis cuantitativo.

 ONPG : orto-nitrofenil--galactopiranosido
 MUG : 4-metil-umbeliferil--D-glucurónido
 Enzima cromogénica indicadora de los coliformes = o-nitrofenol
 Enzima cromogénica indicadora de E.coli i = 4-metil-umbeliferona.
Mecanismos en la cual los coliformes usan el sustrato ONPG y tornan al
medio amarillo

Mecanismo en la cual E. coli usa el sustrato MUG y torna al medio


fluorescente.
MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA
VENTAJAS

 Proporciona recuentos directos.


 Posibilidad de estudiar volúmenes relativamente grandes de
muestra con bajas concentraciones de microorganismos
 Rapidez en la obtención de resultados con respecto al
método clásico.
 Es mas preciso (se obtienen resultados mas reproducibles
que la técnica de NMP)
 Economía de personal y material.

DESVENTAJAS

 No puede utilizarse con aguas muy turbias


 Su empleo no esta indicado cuando la muestra de agua
contiene poco número de coliformes y gran número de
microorganismos no coliformes capaces de multiplicarse
en el medio, ya que éstos últimos se extienden sobre toda
la superficie de la membrana e impide el crecimiento de
las colonias de coliformes.
CONTAJE DE COLONIAS POR FILTRACIÓN

 Este método se aplica a muestras líquidas, no


pastosas como: aguas diversas, cervezas, gaseosas,
licores, etc.
 Se utiliza un equipo de tipo “milipore”, se usa
ademas el disco de filtro, se esteriliza todo el
equipo en autoclave o con alcohol y flama
 Luego, se filtra la muestra pasando de 10 a 100 ml.
A través del filtro
 Se desarma el equipo cuidadosamente para retirar
el disco filtro con una pinza. Se coloca sobre un
medio de cultivo en placa
 Dejar reposar en estufa por 37ºC en 24 hs.
 Las colonias se forman sobre el filtro y se usa el
contaje respectivo.
Equipo portátil de Filtro de Membrana

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