Título Informe 1

"Polimorfismo del gen ACTN3: ¿Determinante del éxito deportivo?"

N. I. Acosta Rodríguez¹, J. M. Piñeros Charry² y A. G. Cañate Felipe³
Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias
Universidad de los Andes, Bogotá
Email: ¹ni.acosta@uniandes.edu.co, ²j.pineros@uniandes.edu.co, ³a.canate@uniandes.edu.co

I. INTRODUCCIÓN

El ADN es susceptible a diversas alteraciones genéticas como duplicaciones o

deleciones de fragmentos que pueden generar impactos nocivos en la persona o dar como
resultado el inicio de múltiples enfermedades. Estas modificaciones que alteran la
funcionalidad normal de un gen son conocidas como mutaciones. No obstante, también se
pueden presentar mutaciones que no conlleven a ningún efecto negativo y, en cambio,
solamente generen una variación genética común entre individuos de la misma especie
(Caratachea, 2007). Este tipo de mutaciones se denomina polimorfismos, de los cuales uno de
los más estudiados gracias a su potencial relación con la producción de fuerza y resistencia
muscular es el polimorfismo R577X (rs1815739) del gen alfa-actinina-3 (ACTN3). Este
último es quien codifica para la alfa-actinina-3, una de las proteínas más importantes y
funcionales de las líneas Z: unidades estructurales de los músculos esqueléticos
(Andrade-Mayorga et. al, 2019). La alfa-actinina-3 se encuentra principalmente en las fibras
musculares tipo II, y cumple un papel crucial al funcionar como punto de anclaje de los
filamentos de la actina en la estructura del sarcómero, contribuyendo así en la ejecución de
contracciones explosivas (Moya, 2021).

Gran parte de la atención que se le da a este gen se centra principalmente en dos de

sus alelos: el alelo R (funcional) y el alelo X (no funcional). La presencia del alelo R se
asocia con la predominancia de la fuerza, velocidad y potencia; fenotípicamente se identifica
por medio de contracciones enérgicas, mejor sprinting y mejor levantamiento de pesas. Por
otro lado, la presencia del alelo X se asocia más con la resistencia y se identifica por medio
de la capacidad de realizar una actividad física de alta intensidad por un período largo de
tiempo, como nadar o andar en bicicleta (Moya, 2021). Para la detección de estos
polimorfismos genéticos, la extracción de ADN y la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) son los procesos más comunes (Sambrook et al., 2001) Estos son aplicados en
múltiples disciplinas de las ciencias biológicas y de la salud, mayoritariamente para
expresión génica, genotipificación, detección de patógenos y análisis de mutaciones (Tamay
de Dios et al., 2013).

Numerosos autores argumentan que la destreza y el desempeño de un individuo son

influenciados en mayor medida por condiciones genéticas y que el entrenamiento no es más
que un potenciador para estas habilidades natas. Por ello, como uno de los objetivos
principales, este estudio busca evaluar la presencia del polimorfismo del gen ACTN3 en un
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individuo y explorar si influyen o no los hallazgos obtenidos en su capacidad deportiva.

Además, se espera que los resultados del estudio junto con toda la información proporcionada
sean de utilidad para el desarrollo de próximos estudios sobre el tema o relacionados.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

· Extracción y electroforesis de ADNg

En primer lugar, se recolectó la mucosa salival mediante un enjuague bucal con

solución salina. Las células recolectadas se centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 min y se
eliminó el sobrenadante sin perturbar el pellet. Luego, se resuspendió el pellet en 2 mL de
solución salina. Para la extracción de ADN, se tomó 200 μL de la suspensión y se colocó en
un tubo eppendorf limpio. Se agregó 20 μL de Proteinasa K y 200 μL de BioFluid & Cell
Buffer. La mezcla se homogeneizó por inversión y se incubó a 55°C durante 10 min.

Posteriormente, se realizó la purificación del ADN utilizando una columna de

purificación. Se agregaron 420 μL de Binding Buffer a la columna y se mezcló por inversión.
Luego, se transfirió la solución a un tubo de recolección y se centrifugó a 12,000 g durante 1
min. Se eliminó el tubo de recolección con el contenido y se transfirió la columna a un nuevo
tubo de recolección. Se agregó 400 μL de Pre-Wash Buffer a la columna y se centrifugó a
12,000 g durante 1 min. Se eliminó la fase acuosa y se agregó 700 μL de Wash Buffer a la
columna. Se centrifugó a 12,000 g durante 1 miny se eliminó la fase acuosa. Este proceso se
repitió dos veces más con 200 μL de Wash Buffer.

Después de la última centrifugación, se aseguró que se eliminara completamente el

líquido. Para eliminar las trazas de etanol, se centrifugó la columna a 12,000 g durante 1 min.
Luego, se transfirió la columna a un nuevo tubo de 1.5 mL y se agregó 50 μL de Elution
Buffer a la columna. La columna se incubó a temperatura ambiente durante 5 min y luego se
centrifugó a 12,000 g durante 2 min. Finalmente, se incubó el ADN a 55°C durante 5 min
para su correcta elución y se colocó en hielo inmediatamente. El ADN se almacenó a -20°C.

El proceso de electroforesis se realizó en una cámara con 0.5 gr de agarosa al 1%

mezclados con 50 mL TBE 1X, luego se calentó durante 40 seg. Se esperó a que la
temperatura bajara para agregar el GelRed en una cantidad de 0.5 μl a la mezcla. El gel se
dejó polimerizar durante 15 min antes de cargar las muestras. Para sembrar y correr las
muestras, se pasó la cama con el gel a la cámara de electroforesis horizontal, llenando la
cámara con buffer de corrido TBE 1X. En papel aluminio se mezcló, para sembrar en cada
pozo, 1 μ𝐿 de loading buffer con 5 μ𝐿 del ADN. El marcador de peso utilizado fue 1 Kb Plus
DNA Ladder. Se puso a correr la cámara a 80 voltios durante 40 min. Finalmente, se usó un
transiluminador para su visualización por medio de rayos UV

· Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y electroforesis de productos de PCR.

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Se utilizó el ADN extraído previamente y se realizó su amplificación en la región del

gen ACTN3 humano Se partió realizando la “Master Mix” compuesta por los siguientes
reactivos con sus respectivas concentraciones. Esta mezcla maestra se realizó para 4
reacciones.

Tabla 1. Reactivos y concentraciones necesarios para la creación de la “Master Mix”.

Reactivo Concentración Inicial Concentración Final

Agua PCR - -

Buffer 10x 1x

𝑀𝑔𝐶𝑙2 50 mM 1.25 mM

dNTPs 10 mM 0.2 mM

Primer F 10 μ𝑀 0.5 μ𝑀

Primer R 10 μ𝑀 0.5 μ𝑀

Primer F interno 10 μ𝑀 0.125 μ𝑀

Primer R interno 10 μ𝑀 0.25 μ𝑀

Taq 5u 2.5 u

ADN - -

Se mezcló la reacción de PCR por pipeteo, teniendo cuidado de no generar burbujas.

De esta mezcla, se añadieron 25 μ𝐿 a 3 tubos eppendorf, los cuales 2 contenían el ADN
extraído (1 μ𝐿), el otro tubo, por otro lado, fue utilizado como control negativo de la reacción
(añadiendo 1 μ𝐿 de agua ultrapura). Estos tubos fueron llevados al termociclador cumpliendo
los siguientes ciclos:

Tabla 2. Especificaciones de ciclos usados en el termociclador.

Número de Ciclos Temperatura (℃) Tiempo

1X 94 3 minutos

35X 94 30 segundos

68 30 segundos

72 90 segundos

1X 72 10 minutos

1X 4 ∞
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Para la electroforesis, se realizó una mezcla homogénea y transparente compuesta de

agarosa al 2% con TBE 1X. Inmediatamente, se añadió 0.5 μ𝐿 de GelRed. Antes de sembrar
y correr la muestra, se esperó alrededor de 20 min a que el gel polimerizara. Para sembrar, se
mezcló 1 μ𝐿 de loading buffer con 5 μ𝐿 del producto de PCR y se mezcló y se sembró.
Posteriormente, antes de correr, como marcador de peso, sembramos 1 μ𝐿 de HyperLadder
100 bp. Para finalizar, se corrió la cámara a 80 voltios durante 45 min y se usó
transiluminador para su visualización por medio de rayos UV.

· Análisis de datos

Dado que el objetivo era identificar el genotipo de la muestra, era importante elegir un
método correcto, con las validaciones correctas. Por ello, se eligió la PCR semi-anidada
debido a su especificidad y sensibilidad. La validación utilizada fue el uso de un control
negativo. Su propósito es asegurar que cualquier resultado positivo que se obtenga en la
prueba no sea el resultado de una contaminación o interferencia en el proceso de la prueba en
sí. El control negativo es importante porque ayuda a evitar resultados falsos positivos. Si un
resultado positivo se obtiene en la muestra de prueba pero también se obtiene en el control
negativo, es probable que el resultado positivo en la muestra de prueba sea un resultado falso
debido a una contaminación o interferencia en la prueba. En ese caso, los resultados deben
ser descartados y se debe realizar la prueba nuevamente para asegurarse de que los resultados
sean precisos y confiables.

III. RESULTADOS

· Electroforesis — ADNg

Con los resultados obtenidos que se logran observar en la Figura 1, se estima que las tres
bandas resultantes tienen un tamaño aproximado de 12000 pares de bases (bp). Asimismo, se
puede observar que los fragmentos tenían gran longitud, pues migraron en el gel lentamente y
se mantuvieron más cercanos a los pozos. Por otro lado, en el carril 2 se observa que la banda
es mucho más brillante que las otras dos, lo que se podría atribuir a la cantidad existente de
muestra en el pozo.
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Figura. 1. Visualización mediante luz UV de electroforesis en gel de agarosa al 2% en

Tris-Borato-EDTA (TBE 1X). En el carril 1 (amplificado al lado izquierdo) se encuentra el
marcador de peso molecular (1Kb Plus DNA Ladder). En los carriles 2, 3 y 4 del gel se
encuentran las muestras de DNA.

· Electroforesis — PCR

Al observar los resultados obtenidos, se afirma que en el gel resultante no se aprecia ninguna
banda que de indicios del polimorfismo esperado.

Figura. 2. Electroforesis de PCR que muestra los resultados (visualizados con luz UV) de la
amplificación del gen Alpha-actinina-3 (actn3) en una muestra de ADN de un estudiante. Los
carriles están organizados de la siguiente manera: (1) Marcador de peso molecular; (2)
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Control positivo proporcionado por el docente (3) Control positivo (4) Muestra de ADN (5)
Muestra de ADN (6) Control negativo.

IV. DISCUSIÓN

Para este estudio se esperaba obtener presencia del polimorfismo R577X. Sin
embargo, como se mencionó anteriormente, en el gel resultante de la electroforesis de PCR
no se aprecia ninguna banda además de las del marcador de peso y el control positivo; esto
ignorando las que están por debajo del peso esperado, las cuales pueden ser dímeros de
primers. Gracias a estos resultados, no es posible saber qué tipos de alelos presentaba el
individuo estudiado, su respuesta fenotípica y, por ende, si el polimorfismo del gen ACTN3
influye en la capacidad deportiva de una persona. Un ejemplo de la forma en que los
resultados se debieron obtener se muestra en la Figura 3, en la cual se puede observar la
electroforesis de PCR realizada por M. Romanovitch, H. Zonatto, I. Romanovitch y J.
Bassan.

Figura 3. Ejemplificación de los resultados esperados de una electroforesis de PCR realizada

para la amplificación del gen ACTN3. Se observan bandas que oscilan entre
aproximadamente las 100 y los 200 pares de bases.

Por otro lado, que los resultados obtenidos de la electroforesis indiquen que no se
detectó ninguna banda específica correspondiente al gen ACTN3 se pueden atribuir a la
existencia de una variedad de factores y condiciones que pudieron interferir en el momento
de realizar el proceso experimental. Por ejemplo, al ser realizado en un ambiente
mayoritariamente didáctico, la muestra y el proceso tienden a presentar errores que sesgan los
resultados. Además, la falta de una cámara estéril, la posible medición incorrecta de los
volúmenes usados para la preparación de primers y errores a la hora de sembrar son motivos
por los cuales la muestra no podría arrojar los resultados esperados. En el caso de esta
reacción se podría realizar nuevamente el proceso de mezcla de la master mix para la
realización de la PCR y en sí la replicación de todo el experimento como tal. Esto revisando
Título Informe 7

cuidadosamente las dosis usadas y el procedimiento para que de esta forma prevenir los
posibles errores que pudieron generar los resultados erróneos en primer lugar.

V. REFERENCIAS

Caratachea, M. A. C. (2007). Polimorfismos genéticos: Importancia y aplicaciones.

Revista del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, 20(3), 213-221.

Andrade-Mayorga, O., Lavados-Romo, P., Valdebenito, C., Herrera, C. L., Carrasco,

C., & Salazar, L. A. (2019). Polimorfismo genético ACTN3 R577X en deportistas
universitarios chilenos. International Journal of Morphology, 37(4): 1493-1497. DOI:
10.4067/S0717-95022019000401493

Tamay de Dios, L., Ibarra, C., & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en discapacidad,
2(2): 70-78.

Moya, W. A. (2021). Genética y fútbol: asociación de los polimorfismos genéticos

ACTN3 y ACE-I/D en jugadores de fútbol: Revisión literaria. Retos: nuevas tendencias en
educación física, deporte y recreación, (39): 929-936. DOI:10.47197/retos.v0i39.79347

Velázquez, L. P. A., Martínez, M. D. C. A., & Romero, A. C. (2014). Extracción y

purificación de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y
prácticos, 1.

Sambrook, J.F. & Rusell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
3.rd ed. Vol 1. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Ribas, M. R., Zonatto, H. A., Ribas, D. I. R., & Bassan, J. C. (2020). R577X OF THE
ACTN3 GENE AS PREDICTOR OF PHYSICAL PERFORMANCE IN
ULTRAMARATHON RUNNERS. Revista Brasileira De Medicina Do Esporte, 26(6),
523–526. DOI: https://doi.org/10.1590/1517-869220202606221667
Título Informe 8