Clonación del gen N-

SARS-COV-2
La clonación es el proceso en el cual se crea una
réplica genética exacta de un gen transfiriéndolo a
otro organismo usando un vector de expresión.

Objetivo: Clonación Gen N de

Pasos:
SARS-CoV-2
Enzimas de estricción: BamHl y

1.
1. pLÁSMIDO RECOMBINANTES Xhol
Vector de Clonación: Plásmido
2. iNSERCIÓN DEL GEN EN EL spET-C-His (5116pb)
PLÁSMIDO Gen Blanco: Gen N de la
nucleocápside de SARS-CoV-2
3. marcados de selección Célula anfitriona: E. coli

4. verificación por inductor de

expresión
5. Extracción de proteína por Plásmido recombinante
cromatografía
6. Visualización por sds-page El origen del plasmido se encuenetra en

ColE1 pBR322.

El vector de clonación es el spET-C-His

Se usan dos enzimas de restriccion para

2.
asegurar la dirección de inserción (BamHl y

Xhol)

INSERCIÓN DEL GEN

EN
PLÁSMIDO EN CÉULA HUESPED
La célula anfitriona capta el plásmido

3.
recombinante.

Marcador
de selección

-Se usa la kan sequence

como marcador de -Las bacterias transformadas

selección, que le confiere se encuentran en un medio con

resistencia a un medio con
kanamicina kanamicina

-Como vemos la célula

hospedera con el plásmido

inserto es resistente al medio

-El gen se inserta en la región

4.
del operon Lac Verificación por inductor
-Por tanto se agrega al
medio lactosa o IPTG para
de expresión
inducir la expresión, si no se Se usa para verificar el gen
induce, el gen ha sido se haya insertado

5-
insertado

Extracción de
proteína por
cromatografía de
afinidad

1. La proteína N de interés se una a

nuestro ligando: Resina quelante

Ni2+ que se une por afinidad al tag
de histidina

2. Se eluyen otras proteínas que no son

de nuestro interés

3. Se eluye unicamente la proteína

target unida al tag de histidina

 6. análisis de fracción
eluida por sds-page
Carril 1: sin inducir
Las fracciones eluidas se Carril 2:inducido

transfirieren a una membrana Carril 3: pellet

de nitrocelulosa para realizar Carril 4 : sobrenadante
un Western Blot Carril 5 flow-through
El peso de nuestra proteína Carril 6: proteína N purificada
de interés N es 41kD

Natalia Triana, Mariana de los

Angeles Peña Polania

,Santiago Rodríguez

González , Laura Sofia Jara

Sastoque ,Maria Fernanda

Nariño Parra. Santiago

Garcia Urueña