Prácticas PIM Genética (Curso 2020/21)

PRÁCTICA I. ADN RECOMBINANTE. CLONACIÓN EN BACTERIAS

INTRODUCCIÓN
Las primeras clonaciones y generación de moléculas de ADN recombinante fueron
creadas a principios de los años 70. Entendemos por clonación del ADN la obtención de
copias de un gen mediante la colocación de un fragmento de ADN portador del gen en
cuestión dentro de un vector de clonación (que es una molécula de ADN extra-
cromosómico autorreplicante). Los vectores deben tener una serie de características:
contener dianas para enzimas de restricción; poder ser incluido en la célula anfitriona con
facilidad; replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona; y poseer un
gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células clonadas (un
ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibiótico).

Uno de los avances más importantes en los inicios de la biología molecular y que permitió
la generación de ADN recombinante, fue el descubrimiento de las endonucleasas de
restricción, que actúan como "tijeras moleculares", que cortan la doble cadena de ADN a
través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases y que tienen la ventaja de que lo
cortan en sitios concretos.
La invención de la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), a principios de
la década de 1980, impulsó el ADN recombinante, al poder amplificar secuencias de ADN
de manera específica. La PCR se basa en el uso de una ADN polimerasa muy
termoestable y cuya temperatura de actividad es de 72ºC, la Taq polimerasa. Al igual que
otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede producir ADN si hay un cebador,
una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto de partida para la síntesis
de ADN, y suficientes dNTPs. En una reacción de PCR, la región de ADN que será
copiada, o amplificada, se determina por los cebadores que se utilicen.

OBJETIVO
La clonación de un fragmento de ADN recombinante implica una serie de pasos: la
generación de fragmentos de ADN (inserto); la ligación a un vector autorreplicativo
seleccionable; la introducción en un hospedador en el que pueda replicarse; la selección
de los clones recombinantes y finalmente la comprobación de que la construcción es
correcta. En esta práctica se comprobará la clonación de un gen de la levadura
Sacharomyces cerevisiae (RPB9) en el vector pRS315 (ver esquema).

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Para clonar el gen RPB9 en el vector pRS315, se ha purificado un fragmento de ADN
cortado con la enzima de restricción PstI que contiene el gen RPB9 (ver esquema). Se ha
ligado este fragmento de ADN (el inserto) con el vector pRS315 previamente cortado con
la enzima PstI. Se ha transformado bacterias E. coli (estirpe DH5a) con el ADN resultante
y se ha seleccionado clones resistentes al antibiótico Ampicilina.
Cada alumno purificará el plásmido a partir de un cultivo de uno de los clones obtenidos, y
procederá a la comprobación de la presencia del gen clonado mediante análisis por PCR
así como mediante análisis de restricción con la enzima PstI (que reconoce la diana
CTGCAG, cortando de forma simétrica en CéTGCAêG).

MATERIAL
- cultivo de E. coli
- tubos 1.5 ml, tubos de 0.1 ml, puntas de 1000 y 200
- Solución I: Tris-HCl pH 8.0 25 mM, EDTA 10 mM, sacarosa 25 mM y RNAsa
- Solución II (preparar en el momento de su uso): NaOH 0.2 M y SDS 1%
- Solución III: AcK 3 M y ácido acético glacial 11.5%
- Isopropanol 100%
- Etanol 70%
- TE 1X
- mix de restricción (20 µl finales) - mix de PCR (50 µl finales)
H2O miliQ 10 μl H2O miliQ 35,2 μl
tampón de restricción (10X) 2 μl tampón de la Taq polymerasa (5X
ARNasa 2 µl con 5 mM dNTPs y 15 mM MgCl2) 10 μl
enzima de restricción PstI 1 μl primer 1 (10 µM) 1 µl
primer 2 (10 µM) 1 µl
enzima ADN polimerasa 0,8 μl

- gel de agarosa 0.8%

- TAE: EDTA 5 mM, Tris-acetato 0.2 M pH 8.0
- Bromuro de etidio (EtBr) 10 mg/ml (Se añade 1 μl / 10 ml agarosa)
- Cubeta y fuente de electroforesis
- tampón de carga de ADN 6x: Ficoll 15%, EDTA 60 mM, Tris-Hcl 20 mM, SDS 0.5%,
colorante 1 0.12%, colorante 2 0.006%
- Marcador de tamaño (Kilobase)

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Esquema del inserto:

Esquema del vector:

Secuencia del sitio de clonaje múltiple (MCS):

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PROTOCOLO.
DÍA 1

1.- Extracción del plásmido de los clones (Lisis alcalina o Miniprep):

1. Pasar 1’5 ml de cada cultivo inoculado el día anterior a un tubo de microcentrífuga.
2. Centrifugar a 13’000 rpm durante 2 min y descartar el sobrenadante completamente.
3. Resuspender el precipitado en 100 μl de Solución I fría. Dejar reposar 5 min a
temperatura ambiente.
4. Añadir 200 μl de Solución II (preparada en el instante) y mezclar suavemente
invirtiendo el tubo varias veces. Dejar 5 min en hielo.
5. Añadir 150 μl de Solución III fría y mezclar invirtiendo el tubo varias veces. Incubar
en hielo 5 min.
6. Añadir 10 μl de cloroformo frío [Esto lo realizará el profesor].
7. Centrifugar a 13000 rpm durante 5 min y pasar el sobrenadante a un tubo limpio.
8. A este sobrenadante, añadir de isopropanol el equivalente a 2 volúmenes de lo
recuperado y agitar invirtiendo el tubo varias veces. Dejar reposar al menos 5 min a
-20°C.
9. Centrifugar a 13’000 rpm durante al menos 5 min y eliminar el sobrenadante.
10. Añadir 1 ml de etanol al 70%, (el precipitado NO se tiene que resuspender) y
centrifugar a 13’000 rpm durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y dejar secar
completamente el precipitado.
11. Añadir 25 μl de TE 1x y dejar resuspender.

2.- Reacción de restricción.

1. Resuspender bien la miniprep (mediante vortex o pipeteo).
2. Dar a la preparación un pequeño spin en la microcentrífuga.
3. Añadir 5 µl del ADN obtenido en la miniprep al tubo de 1.5 ml que contiene 15 µl del
mix de restricción [el mix lo prepara el profesor]. Mezclar suavemente.
4. Incubar 1h a 37°C.

3.- Reacción de PCR

1. Diluir la muestra de ADN procedente de la miniprep. Realizar una dilución 1/50 en
H2OmiliQ.
2. Añadir 2 µl del ADN diluido al tubo de 0.1 ml que contiene 48 µl del mix de PCR [el
mix lo prepara el profesor]. Mezclar suavemente.

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3. Poner en la máquina de PCR con el siguiente programa:
TEMPERATURA TIEMPO CYCLOS
Desnaturalización inicial 95°C 1 min 1X
Desnaturalización 95°C 15 s
Anillamiento 60°C 15 s 30X
Elongación 72°C 1 m 30 s

Elongación final 72ºC 10 m 1X

Mantenimiento 4ºC indefinido

DÍA 2

1. Dar a las muestras de restricción un pequeño spin en la microcentrífuga.

2. Añadir a las muestras de la restricción 4 μl de tampón de carga de ADN 6X.
3. Cargar toda la muestra en un gel de electroforesis.
4. Cargar 10 µl de la muestra de PCR en un gel de electroforesis.
5. Cargar un marcador de tamaño del ADN.
Dejar correr en una cubeta bajo corriente continua durante 1 hora a 100 V y realizar
una foto de los resultados.
6. Discutir y analizar los resultados.

Marcador de tamaño:

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PRÁCTICA II. MODELO TRIDIMENSIONAL DEL ADN

INTRODUCCIÓN
En 1953, Watson y Crick propusieron un modelo de la estructura del ADN que
satisfacía los datos que se tenían en ese momento sobre esta molécula:
• El ADN lleva la información genética
• El ADN es un polímero de nucleótidos
• Cada nucleótido está compuesto de un fosfato, un azúcar pentosa llamada
desoxirribosa y una base nitrogenada
• La molécula de ADN es muy larga
• El ADN es más denso que las proteínas
• Las reglas de Chargaff indican que la proporción de A iguala a la de T y la proporción
de G a la de C
• Los datos de cristalografía de rayos X indican que los fosfatos están en el exterior de
la molécula; las bases en el interior; el ADN está compuesto de dos cadenas y tiene
estructura helicoidal; las dos cadenas van en sentidos opuestos (antiparalelas); hay 10
pares de bases por cada vuelta de hélice.

OBJETIVOS
Identificar las distintas partes de un nucleótido y los enlaces más relevantes que se dan
en el ADN. Posteriormente construir un modelo de una molécula de ADN corta que
satisfaga los datos de la introducción. En dicho modelo identificar los extremos de cada
cadena, la diferente polaridad y los surcos mayor y menor. Y finalmente, determinar la
secuencia de la molécula de ADN representada por el modelo.

MATERIAL
Cada estudiante dispone de los modelos de 4 fosfatos, 4 desoxirribosas y 4 bases
nitrogenadas.
Cada átomo está coloreado de la siguiente manera:
• Oxígeno en rojo
• Nitrógeno en azul
• Carbono en gris
• Hidrógeno en blanco
La mayoría de los átomos de hidrógeno se han eliminado de los modelos para que se
pueda observar mejor la estructura.

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PROTOCOLO
1. Dispones de modelos de fosfatos, desoxirribosas y bases nitrogenadas. Identifica
cada parte. Distingue unas bases de otras.
2. Une una base con un azúcar para formar un desoxinucleósido. ¿Qué tipo de enlace
une la base a la pentosa? Añádele un fosfato para formar un desoxinucleótido. (Une o
separa las partes con cuidado para evitar romper los enganches).
3. Forma ahora un nucleótido complementario del anterior. Une los dos nucleótidos
utilizando la complementariedad de bases. Esto es un par de nucleótidos (también
llamado un par de bases y abreviado pb). ¿Cómo se llaman los enlaces que unen una
base con otra complementaria?
4. Une los dos fosfatos que quedan con las respectivas pentosas. Utilizando el imán de
un fosfato y el de una pentosa, une las dos estructuras. ¿Qué enlace está uniendo las
dos pentosas a través del fosfato?
5. Añade las bases nitrogenadas que quedan. Esto es un dinucleótido (no lo llamamos
par de nucleótidos o par de bases, como antes): dos nucleótidos contiguos en la misma
cadena. Si tuvieras un número ilimitado de los cuatro tipos de desoxinucleótidos,
¿cuántos dinucleótidos diferentes se podrían formar? ¿Cuántos trinucleótidos
diferentes? ¿Cuántas secuencias diferentes de 10 nucleótidos?
6. Organiza ahora tus cuatro nucleótidos en dos pares de bases y une los dos pares de
bases entre sí. Observa como un par de bases está girado respecto al otro.
7. Une tus dos pares de bases a los de otros cinco compañeros del grupo para generar
una doble hélice de 12 pares de bases. Identifica los extremos 5’ y 3’ de cada cadena.
Observa que las dos cadenas son antiparalelas.
8. Gira la estructura e identifica el surco mayor y el surco menor.
9. A partir de un fosfato cuenta el número de nucleótidos que hay que bajar para llegar
a otro fosfato justo debajo en la misma posición relativa: ¿cuántos pares de bases hay
por cada vuelta de hélice?
10. Determina la secuencia de cada una de las cadenas en vuestra estructura (tiene
que ser una secuencia de 12 bases en cada cadena).