Taller 6.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

1. Complete el siguiente cuadro. Resuma qué pasa si no se agrega ese
reactivo/compuesto en la Master Mix. (1.0).

Reactivo ¿Qué ocurre si no se agrega en la Master Mix?

Si no se agrega el Buffer, no se mantendrían las condiciones del pH

Buffer
estable, por lo tanto, la polimerasa no actuaria de forma correcta.

Dado que el cloruro de magnesio es cofactor de la polimerasa, si no se

MgCl agrega, no habría una estimulación de los iones de Mg en la
polimerasa y esta no podría cumplir su función de incorporar los
dNTPs.

dNTPs
No se generarían nuevas cadenas de ADN.

Sin los primers no se iniciaría la reacción de la PCR ya que no se

Primers
unirían al ADN molde.

Taq polimerasa Al no agregar la Taq polimerasa, no se podría duplicar el ADN.

ADN Sin el ADN, claramente no habría nada que duplicar.

2. Teniendo en cuenta las concentraciones iniciales (stock) y los volúmenes en la reacción de PCR,
calcule los valores faltantes en la tabla (No olvide poner las unidades, Volumen final = 7
reacciones de 25µL). (1.0)

Reactivo    [inicial]   [final]  Vol una reacción   Vol para Master Mix
(7 reacciones)  
Buffer de PCR   10X 1X   2.5 µL 17.5uL
dNTPs   10mM   0.2mM 0.5uL 3.5 µL
MgCl2   50mM   1.5mM   0.75uL 5.25uL
Primer F   10μM   0.7µM   1.75uL 12.25uL
Primer R   10μM   0.7µM   1.75uL 12.25uL
Polimerasa   5U/µL   1U   0.2uL
H2O  17.25uL 120.75uL
ADN  10ng/µL  5ng total  0.5uL
3. ¿Cuántas copias del fragmento hay al final del tercer (3) ciclo de una reacción de PCR? ¿Cuántas
de esas copias de cadena sencilla corresponden al tamaño esperado? Dibuje el proceso para
poder responder a estas preguntas. (1.0)
En la reacción de PCR, el ADN se somete a una serie de ciclos de temperatura, lo que da como
resultado la amplificación exponencial de fragmentos de ADN específicos.
Después del tercer ciclo de PCR, habrá 8 copias del fragmento de ADN original, ya que el
número de copias se duplica con cada ciclo. Después del primer ciclo tendrás 2 copias, después
del segundo ciclo tendrás 4 y después del tercer ciclo tendrás 8.
Cuántas de estas copias corresponden al tamaño esperado depende de la especificidad de los
cebadores utilizados y de la eficiencia de la reacción de PCR. En una reacción de PCR ideal,
todas las copias amplificadas tendrían el tamaño esperado. Sin embargo, en la práctica puede
haber amplificación no específica, productos no deseados o defectos de reacción que pueden dar
lugar a copias de fragmentos no deseados.

4. Busque un artículo de investigación que realice una PCR, diríjase a Materiales y Métodos y
ponga el perfil térmico utilizado en la tabla que se encuentra a continuación. Asegúrese de que
los investigadores hayan realizado una PCR convencional. (1.0).

No.
Ciclos Proceso Temperatura Duración
(°C)
Desnaturalizació
n 98 30s
Inicial
Desnaturalizació
98 10s
n
Anillaje 58 10s
45
Elongación 72 20s
 Elongación Final 72 30s

5. Complete las siguientes preguntas sobre controles experimentales en la PCR (1.0).

a) ¿Cómo se realiza un control negativo para esta técnica? ¿Por qué es útil tener un control
negativo?
El control negativo en la PCR se realiza a partir de una muestra en la que se agregan todos los
componentes de la reacción, excepto el ADN. Su utilidad recae principalmente en comprobar
que ninguno de los componentes de la reacción está contaminado con ADN de otra
procedencia, y que, debido a errores de manejo, no se haya producido una contaminación
entre muestras.
b) ¿Cómo realizarían un control positivo?
El control positivo, es una muestra con antígeno viral confirmado, es decir, que el control
positivo contiene ADN correspondiente a la región de este que codifica el ARNr.
c) Dibuje un gel de electroforesis en el que muestre los siguientes carriles: 1) Marcador de peso, 2)
una muestra, 3) control positivo y 4) control negativo.

Marcador de peso Muestra Negativo Positivo

Referencias:
(N.d.). Upv.Es. Retrieved March 30, 2023, from
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena
%20de%20la%20polimerasa.pdf
(INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS POR ELECTROFORESIS, n.d.)
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS POR ELECTROFORESIS. (n.d.). Vetlab.cl.
Retrieved March 30, 2023, from https://www.vetlab.cl/?page_id=141
Schötta, A., Wijnveld, M., Höss, D., Stanek, G., Stockinger, H., & Markowicz, M. (2020).
Identification and Characterization of “Candidatus Rickettsia Thierseensis”, a Novel Spotted Fever
Group Rickettsia Species Detected in Austria. Microorganisms, 8(11), 1670.
https://doi.org/10.3390/microorganisms8111670