Fecha: 28-03-2023

Título: PCR y Electroforesis en gel de agarosa.

Introducción:
Se prepara una PCR y una electroforesis a partir de esta de una muestra que contiene el kit.
Para ello se divide la práctica en dos primero se realiza la PCR y la en segunda parte se
realiza la electroforesis. Y a partir de la electroforesis observaremos los resultados de la PCR.

Materiales:
• Termociclador
• Micropipetas
• Puntas de micropipetas
• Gradillas para tubos Eppendorf
• Guantes
• Microtubos
• Gradilla para tubos de 1,5ml o 2ml
• Muestra para amplificación
• Enzima Taq polimerasa
• Tampón de actividad 5X
• Cebadores o primers
• Gradilla para tubos de 1,5ml o 2ml
• Tubos Eppendorf
• Tampón TAE
• Agarosa
• Matraz Erlenmeyer
• Agitador magnético termostático
• Marcador de peso molecular
• Muestra para cargar el gel
• Vidrio reloj
• Espátula
• Cubeta de electroforesis y peine
• Fuente de alimentación
• Celo
• Tijeras
• Agua destilada
• Pinzas
• Tampón de carga
• Agente intercalante (Midori Green)

Metodología:
Antes de comenzar la práctica se guarda todo el material seco del laboratorio, se prepara el
puesto de trabajo con todos los materiales necesarios para la práctica y los alumnos se
colocan los guantes.

Esta práctica se dividirá en dos, las cuales se realizaron en dos días:

PCR: Se mezcla en un tubo Eppendorf 0,2 ml de 20 µl de mezcla (05 µl de muestra de para
amplificación, 0,4 µl de Tac polimerasa, 5 µl de tampó, 0,5 µl. Cada uno de Primer F y R 20
µM, 13,6 µl de agua destilada estéril) haciendo un total de 25 µl. Mezclar siempre por
pipeteo y evitar la formación de burbujas. Añadir siempre los reactivos en orden de
volumen de mayor a menor. Al finalizar la mezcla se efectuará la PCR en el termociclador
con un programa de 40 ciclos.
Electroforesis de agarosa: Los alumnos preparan los 250 ml de tampón TBE, cada grupo,
haciendo un total, entre todos los grupos de 1 l de tampón. Tras esto se almacenará a
temperatura ambiente. Se continúa preparando el gel de agarosa al 8 % por grupo, cada
grupo meterá en el microondas, su mezcla de gel de agarosa hasta que empiece a hervir en
este momento se saca y se vierte en esta y 10 µl de agente intercalante Midori Green.
Cuando se atempere se vierte en la bandeja con el peine previamente montado y se deja
gelificar a temperatura ambiente. Una vez gelificado se retirará el peine, descubriendo así
los pocillos. Se introduce el gel y tampón electroforesis en la cubeta y se insertar la muestra
de ADN en los pocillos, con cuidado de no dañar el gel. El tampón debe cubrir y como
máximo 2 mm por encima del gel, se conecta la cubeta a la fuente de alimentación y poner a
voltaje constante hasta que el frente de electroforesis haya recorrido tres cuartas partes del
gel, en este momento se desconectara la fuente. Por último se realizará la visualización de
los resultados.

Para finalizar la práctica se eliminan los residuos de forma adecuada. Se guardan los
reactivos utilizados, se limpia todo el material utilizado, se deja secando, y se comprueba
que todo el laboratorio haya quedado limpio y despejado

Discusión:
El resultado de la práctica no ha sido apto, debido a qué el gel se contaminó, además de
haber roto el gel con la micropipeta, al meter el marcador.
Actividades:
Cuestiones PCR:
• Obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular,
amplificándolo para propósitos de investigación.
• El principal factor limitante es la ausencia de actividad correctora de pruebas en
la Taq polimerasa
• DESNATURALIZACIÓN INICIAL: Consiste en llevar la reacción hasta una temperatura
de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se
mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que
requieran activación por calor.

DESNATURALIZACIÓN: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos

cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes
modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La
temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo,
de la proporción de guanina y citosina que contenga la cadena, como también del
largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR,
serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la
desnaturalización.

ANILLAMIENTO: A continuación, el cebador se unirá a su secuencia complementaria

en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-
40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de
hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman
 cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La
polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar
ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser
amplificada.

-ELONGACIÓN : En esta etapa actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para

sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial
necesario para la síntesis de nuevo ADN.
La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde
añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-
fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente
(la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa
que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-
80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de el ADN
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.
Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN
polimerizará mil bases en un minuto.

ELONGACIÓN FINAL: Se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15

minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de
cadena simple restante sea totalmente ampliado.
• Al haber una mutación en la secuencia complementaria ésta no comenzará el
proceso de anillamiento y por lo tanto, tampoco dará lugar al proceso de elongación.
•

Cuestiones electroforesis:

• La electroforesis es una técnica de laboratorio que se usa para separar moléculas de

ADN, ARN o proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se usa una
corriente eléctrica para mover las moléculas a través de un gel o de otra matriz.
• Facilitar la carga de muestras en los pocillos de geles de agarosa y poliacrilamida
horizontales y verticales.
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• Por su densidad, las muestras se sumergen en la solución tampón y permanecen en
los pocillos.
• Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por
masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.
• Cuántos fragmentos diferentes de ADN están presentes en una muestra y cuán
grandes son unos con respecto a otros.
•

Bibliografía:
No procede.