IMPRESIÓN DE CÉLULAS MADRES MESENQUIMALES, MEDIANTE BIOIMPRESION ASISTIDO POR

LÁSER, PARA APLICACIONES DE REGENERACIÓN ÓSEA

Introducción
Se ha prestado mucha atención a los enfoques de ingeniería de tejidos con el fin de construir
construcciones tridimensionales (3D) para reemplazar o sostener la regeneración de los tejidos,
utilizando una combinación de biomateriales biocompatibles y bioactivos con o sin células y factores
bioactivos. Se han implementado dos enfoques principales de manufactura de tejidos: los enfoques de
arriba abajo y de abajo hacia arriba. En aproximaciones de arriba hacia abajo, las células son a menudo
sembradas escasamente dentro de un armazón sintético o natural (o un tejido decelularizado)
configurado para adaptarse a la geometría deseada de la lesión para regenerarse. Esta construcción a
menudo se madura en un biorreactor. En las dos últimas décadas, este enfoque ha dado lugar a cierto
progreso científico y éxito preclínico, especialmente para la regeneración de tejidos delgados o
avasculares, como la piel , el cartílago o los tejidos conectivos, o tejidos con una alta capacidad de
regeneración o remodelación, tal como hueso. Sin embargo, los enfoques de arriba hacia abajo casi no
imitan las intrincadas características microestructurales de los tejidos nativos, y la colonización y
diferenciación de las células dentro de estos andamios sigue siendo difícil de controlar. De hecho, con
respecto a las aplicaciones clínicas, sólo unos pocos ensayos clínicos han sido reportados y demostrado
tener éxito.
Por otro lado, los enfoques de abajo hacia arriba, basados en una reconstrucción de ladrillo a ladrillo de
un tejido, ofrecen la oportunidad de modelar los componentes individuales de acuerdo con un patrón
predefinido que guiará la maduración de la construcción de tejido hacia una arquitectura funcional
final. Como resultado, la distribución celular puede definirse a escala micrométrica, lo que permite la
creación de un microambiente de matriz extracelular (ECM) adecuado. Entre las diferentes técnicas de
abajo hacia arriba, el bioprinting, un avanzado método avanzado de biofabricación, se ha convertido
desde los últimos cinco años en uno de los enfoques técnicos más prometedores para lograr el control
sobre la geometría de los tejidos modificados. Este enfoque aprovecha la creación de prototipos rápidos,
asistidos por procedimientos de diseño asistido por ordenador (CAD) y / o de fabricación asistida por
ordenador (CAM).
Hasta la fecha, se han establecido tres técnicas principales de bioprintaje: inyección de tinta, asistida por
láser y extrusión. Numerosas revisiones han reportado una comparación concisa de estas tres
estrategias . Entre ellos, la tecnología de Bioprinting asistida por láser (LAB) ha surgido, desde el trabajo
inicial y las patentes de los investigadores en el Naval Research Laboratory, Como un método prometedor
para la ingeniería de tejidos artificiales. Este último método se basa en el efecto de transferencia directa
inducida por láser (LIFT). Los Bioprinters asistidos por LIFT o LAB se componen de 3 componentes
principales: (1) una fuente de láser pulsada, (2) un blanco o cinta, que sirve de soporte para el material
de impresión, y (3) un soporte para recoger el material impreso. Brevemente, la cinta está compuesta por
un soporte, que no es absorbente para el láser ( por ejemplo, vidrio o cuarzo), recubierto por una delgada
capa de metal absorbente láser ( por ejemplo, oro o titanio). Los componentes orgánicos (células o
moléculas) se preparan dentro de una fase líquida ( por ejemplo,. Medio de cultivo o colágeno), y se
depositan sobre la superficie del soporte revestido con metal. A continuación, el impulso láser induce la
vaporización de la película metálica, dando lugar a la formación de una gotita, que se deposita entonces
sobre el sustrato receptor. LAB es un método de escritura directa que puede administrar la deposición
de gotas de células o biomateriales, dentro de una fase fluídica, a una velocidad de rango MHz. Debido a
su resolución a nivel de picolitros, LAB permite controlar la densidad celular y la organización 3D
espacial, hasta el nivel de célula única, permitiendo un control sin precedentes sobre el comportamiento
y destino de la célula, parámetros clave en la ingeniería de tejidos. Como tal, LAB es una tecnología
emergente y prometedora para fabricar estructuras similares a tejidos con la capacidad de imitar la
funcionalidad fisiológica de sus homólogos nativos. Además, este método tiene ventajas adicionales tales
como automatización, reproducibilidad y alto rendimiento, haciéndolo compatible con la fabricación de
construcciones 3D de tamaños fisiológicamente relevantes.
Anteriormente nos centramos en este enfoque bioprinting para in vivolas intervenciones médicas
asistidas por computadora y en una aplicación en el lugar de ingeniería de tejidos [ 14] . Para ello, se
adaptó una estación de trabajo dedicada a la impresión láser biológica de alto rendimiento
a experimentos de impresión in vivo . La prueba de concepto para la impresión in vivo ya se realizó
utilizando LAB por una deposición de partículas de hidroxiapatita (HA) en un defecto de calvaria de ratón
de tamaño crítico, in vivo [ 14] . En este trabajo, y utilizando la tecnología LAB, nos centramos en el
impacto de diferentes patrones de células geométricas con el fin de lograr la regeneración guiada de in
vivoTejido óseo, después de bioprinting. Se muestra por primera vez el uso de la tecnología LAB para la
regeneración, en el lugar , en un defecto óseo de tamaño crítico, mediante la impresión de diferentes
componentes biológicos y células estromales mesenquimales en un patrón bien definido.
Bioimpresión asistido por láser (LAB)
El enfoque de bioprinting utilizado en este trabajo se basó en LAB, utilizando una estación de trabajo
dedicada a la impresión láser biológica de alto rendimiento adaptada al uso in vivo. La configuración
aplicada, descrita anteriormente 15 , se basa en un haz de láser pulsado de infrarrojo cercano, acoplado
a un espejo de exploración y un sistema de enfoque (figura 1). Esta configuración permite enfocar con
precisión un rayo láser en la cinta (una lámina de vidrio de cuarzo transparente recubierta con una capa
absorbente de oro) sobre la que se extiende una delgada capa de tinta celular. La energía creada por la
incidencia del haz láser crea una cavitación que propulsa una microgotícula, que contiene células, hacia
el sustrato receptor, que puede ser un soporte 2D o un tejido in vivo 3D expuesto (Fig. 1).
Figura 1

Representación esquemática del enfoque bioprinting asistido por láser (LAB). Una configuración típica
de LAB comprende un haz de rayos láser pulsado, un sistema de enfoque, una cinta (una lámina de vidrio
transparente, recubierta con una capa de metal absorbente de láser, sobre la cual se extiende una capa
delgada de bioink y un sustrato receptor frente a la cinta. El principio físico de LAB se basa en la
generación de una burbuja de cavitación, en la profundidad de la película de bioinceno, cuya expansión y
colapso induce la formación de un chorro y, por tanto, la transferencia del bioincén de la cinta al sustrato
(Aquí un defecto óseo en la calvaria del ratón), formando una microgota.
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Con el fin de establecer las condiciones que se utilizarán en los estudios in vivo posteriores, se evaluó
la respuesta celular in vitro de las células D1 (células precursoras del estroma de la médula ósea del ratón
multipotente) a dos diseños impresos diferentes: un anillo y un disco. Nuestro objetivo racional fue
comprender el impacto de la distribución celular in vivo , sobre bioprinting por LAB, sobre la
regeneración de un defecto óseo en ratones. Como tal, se imprimieron células D1 positivas para tomate,
usando dos geometrías distintas pero con el mismo número total de células, sobre un sustrato de
colágeno y su morfología fue seguida hasta 4 días. Como se ve en la Fig. 2A, Ambas geometrías muestran
una correspondencia adecuada con el diseño predefinido después de la impresión. Además, con el tiempo
de cultivo, las células muestran propagación / proliferación y llenan los huecos entre las manchas, a los
días 2 y 4 (Figura 2A ).
Figura 2

( A ) Imágenes de fluorescencia representativas de células D1 positivas para tomate y disco impresas en

anillo a los días 0, 2 y 4. ( B ) Porcentaje de actividad metabólica, medida por el ensayo de resazurina, de
células D1 impresas en una geometría de anillo o disco a los días 1 y 8, en relación con la geometría del
anillo al día 1 (Promedio ± SD, n = 6, ** y *** denota p <0,01 yp <0,001, respectivamente).
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Como medio para establecer el comportamiento de las células D1 al imprimir, se evaluó la actividad
metabólica tanto a 1 como a 8 días, en relación con la geometría del anillo al día 1, después de la impresión
(Figura 2B ). Las células muestran un aumento significativo en términos de actividad metabólica desde
el día 1 a 8, para ambas geometrías (figura 2B ). Además, no se observaron diferencias significativas
entre las dos geometrías diferentes, en el mismo punto de tiempo, afirmando la consistencia de la
impresión (figura 2B ).
BioImpresion en vivo y en el lugar de afección
Basándose en los diseños de impresión probados en condiciones in vitro , seguimos a continuación para
adaptar las mismas geometrías de impresión a un defecto in vivo en la calvaria de ratón. Con el fin de
confinar los puntos celulares impresos al defecto de la calavera y proporcionar una matriz
osteoconductora a las células impresas, se imprimieron dos discos de colágeno nHA antes y después de
la impresión de tinta celularizada (Figuras 3A1 y B1 , para geometrías de anillo y disco ,
Respectivamente).
figura 3

Representación esquemática de las geometrías bioprinting asistida por láser in vivoprobadas, es decir,
un anillo ( A1 ) con diámetro externo e interno de 3 y 2,1 mm, respectivamente, y un disco ( B1 ) de 2 mm
de diámetro. En ambos casos, se imprimieron dos capas de tinta de colágeno de nHA por debajo y por
encima de la capa de tinta celularizada. Las imágenes de fluorescencia representativas de anillo ( A2 ) y
disco ( B2 ) imprimieron células positivas a tomate ( D1 ) dentro del defecto de la calvaria en ratones,
inmediatamente después de la impresión.
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Con el fin de evaluar la proliferación de las células impresas, usando el diseño de impresión descrito,
seguimos la señal de luciferasa de las células D1 positivas a la luciferasa en el modelo de calvaria in
vivo en ratones hasta 42 días. Como se observa en la Fig. 4 , se puede observar un aumento de señal
consistente hacia el tiempo y no se pueden observar diferencias significativas para ambas geometrías
ensayadas.
Figura 4

( A ) Imagen de luminiscencia representativa de células D1 positivas a la luciferasa en una geometría de

anillo a 10, 15, 21, 28, 35 y 42 días después de la impresión, en un modelo de calvaria de ratones. ( B )
Cuantificación de la señal de luciferasa de células D1 positivas a la luciferasa en una geometría de anillo
y disco en un modelo de calvaria de ratón (Promedio ± DE, n = 5).
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Reparación ósea después de LAB
Se evaluó el potencial de diferentes geometrías impresas de células mediante la evaluación de la
reparación ósea, mediante tomografía de rayos X (μCT), tanto a 1 como 2 meses después de la
impresión. Como se observa en la Fig. 5 , se puede observar una reconstrucción marginal del defecto,
únicamente impresa con tinta de colágeno de nHA, a los 2 meses después de la impresión (Figuras 5A y
D ). En el caso de los defectos impresos con el material de colágeno nHA y con células D1 en una geometría
de anillo, tampoco se puede observar ninguna formación ósea importante en ambos puntos de tiempo
probados (Figuras 5A y D). Por el contrario, en el caso del material de colágeno de la NHA y con las células
D1 en la geometría del disco, se puede observar un aumento significativo en términos de formación de
hueso tanto a 1 como a 2 meses, después de la impresión, en relación con las otras dos condiciones
ensayadas (Fig. 5A y D ) .
Figura 5

( A ) Imágenes representativas de reconstrucción de micro tomografía de rayos X (μCT) de colágeno de

nHA y células D1 impresas en una geometría de anillo o disco (defecto de calvaria en el lado derecho) o
colágeno de nHA solo (defecto de calvaria en el lado izquierdo) 2 meses después de la impresión en un
modelo de ratones calvaria. Proyección horizontal ( B ) y coronal ( C ) μCT y regiones de interés (3,3 mm
de diámetro y 0,5 mm de espesor de disco) para la evaluación de la reparación ósea, en un defecto de la
calvaria en ratones a los 2 meses después de la impresión. ( D) Evaluación cuantitativa del volumen óseo
/ volumen total (BV / TV) mediante la evaluación de μCT de células de colágeno y D1 de NHA, impresas
en una geometría de anillo o disco, o colágeno de nHA solo a 1 y 2 meses después de impresión (Promedio
± DE, n = 9, * y *** denotan p <0,05 y p <0,001, respectivamente).
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Como medio para evaluar adicionalmente el impacto de ambas geometrías impresas en la reparación
ósea, evaluamos la reparación ósea, por μCT, a los 2 meses después de la impresión utilizando una región
central de 1,5 mm del defecto. Como se observa en la figura 6C , se puede observar un aumento
significativo en términos de BV / TV en el caso de la impresión de colágeno de nHA y con células D1, en
geometría de disco, en comparación con las otras dos condiciones. Estos resultados muestran que en el
caso de la geometría impresa en disco, la regeneración es homogénea a lo largo del defecto, en contraste
con la geometría del anillo, donde la regeneración se observa principalmente en la periferia.
Figura 6

Horizontal ( A ) y coronal ( B ) de rayos X micro tomografía (μCT) de proyección y región de interés

(diámetro de 1,5 mm y 0,5 mm de disco de espesor) para la evaluación de la reparación ósea, en el centro
de un defecto de la bóveda craneal en ratones a 2 Meses después de la impresión. ( C ) Evaluación
cuantitativa del volumen óseo / volumen total (BV / TV) mediante la evaluación de μCT de células de
colágeno y D1 de NHA, impresas en una geometría de anillo o disco o colágeno de nHA solo a los 2 meses
después de la impresión (Promedio ± SD, n = 9, * denota p <0,05).
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La evaluación de la micro-TC se confirmó mediante análisis histológico de las muestras recuperadas a los
1 y 2 meses después de la impresión, usando tinción con hematoxilina-eosina-azafrán (HES). Como se
observa en la Fig. 7 , al 1 mes después de la impresión, ambas células de colágeno y nHA-colágeno + D1,
impresas en una geometría de anillo, muestran sólo una reconstrucción de tejido marginal,
particularmente desde la periferia del defecto. En contraste, las células de colágeno + D1 de nHA,
impresas en geometría de disco, muestran una formación de hueso sustancialmente nueva, bien
distribuida a lo largo del defecto.
Figura 7
Evaluación histológica por tinción con hematoxilina / eosina / safran (HES) de la reparación ósea, en un
defecto de la calvaria en ratones, a los 1 y 2 meses después de la impresión del colágeno de la NHA y
células D1, impresas en una geometría de anillo o disco o colágeno. (Se muestran imágenes
representativas).
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A los dos meses después de la impresión se observó la misma tendencia (Fig. 7 ), la condición impresa
de colágeno-nHA mostró poca reparación ósea y las células de colágeno + D1 de NHA, impresas en
geometría de anillo, mostraron reparar hueso hasta cierto punto, En la periferia del defecto. Por el
contrario, las células de colágeno + D1 de nHA, impresas en geometría de disco, muestran la formación
de hueso maduro, incluso en el centro del defecto.