Biología Celular

2020 - II
 Biología Celular

Prácticas de taller

Docente:

Angel Hernández ahernandezra@ucientifica.edu.pe

 Plan de trabajo
1. Breve repaso: Extracción del ADN

2. Técnicas moleculares: 2. Reacción en cadena de la Polimerasa

• Repaso a la síntesis del ADN y sus componentes

• PCR
• PCR convencional
• Termociclador
• Usos
• Aprendiste
• Resolución de dudas
 Semana N° 11

Fundamentos de las técnicas de PCR

https://www.equiposylaboratorio.com/portal/productos/termociclador-pcr-punto-final-veriti-de-96-pozos
SEMANA 11: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2020 II

Biología Celular y Molecular: Conceptos y
Experimentos – Gerald Karp – 6 Edición
Autor del libro: Gerald Karp
Año de publicación: 2011
Categoría: Biologia
Libros de consulta:
Biología Celular y Molecular
Diagnósticos moleculares
Molecular Diagnostics: Fundamentals,
Methods, & Clinical Applications– Lela
Buckingham – 1st Edition
Autor del libro: Lela Buckingham
Año de publicación: 2007
Categoría: Biologia
 Semana N° 11

Características Generales de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Definición, funcionamiento y aplicaciones en la investigación biomédica

Biología Celular y Molecular: Conceptos y Experimentos

Molecular Diagnostics: Fundamentals,
– Gerald Karp – 6 Edición
Methods, & Clinical Applications– Lela
Autor del libro: Gerald Karp
Buckingham – 1st Edition
Año de publicación: 2011
Autor del libro: Lela Buckingham
Categoría: Biologia
Año de publicación: 2007
Categoría: Biologia SEMANA 11: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2020 II
RESULTADOS DE APRENDIZAJE
DE LA SESIÓN

Al final de la sesión el estudiante:

• Deberá comprender el procedimiento de la técnica de

la PCR y las aplicaciones de esta en la investigación

científica.

SEMANA 11: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2020 II

REFLEXIÓN DE LA EXPERIENCIA

• Conocer la prueba molecular de la Reacción en Cadena

de la Polimerasa (PCR) nos permitirá comprender una de

las técnicas más usadas en la Biología Molecular y los

procesos de replicación del material genético “in vitro”.

Además, podremos determinar las aplicaciones de mayor

uso de la PCR utilizados en las publicaciones de

investigación científica.

SEMANA 11: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2020 II

 Revisión de conceptos previos
• ADN: molécula de que conlleva la
información genética.

• Formada por una doble cadena

antiparalelas y complementarias

• ADN Compuesta de:

• Desoxirribonucleótidos
En una molécula de ADN, las
bases nitrogenadas que
interaccionan son:

Timina - - Adenina
Citocina - - - Guanina

Mediante enlaces de puente

de hidrógeno 3 en C-G y 2 A-T

Los grupos fosfatos se unen

por un enlace fosfodiéster.

La síntesis de una nueva

cadena va en sentido 5´a 3´
En una molécula de ADN, las
bases nitrogenadas que
interaccionan son:

Timina - - Adenina
Citocina - - - Guanina

Mediante enlaces de puente

de hidrógeno 3 en C-G y 2 A-T

Los grupos fosfatos se unen

por un enlace fosfodiéster.

La síntesis de una nueva

cadena va en sentido 5´a 3´
 Revisión de conceptos previos
Replicación del ADN https://www.youtube.com/watch?v=uEwyWgSvLc0 (4:22)

• Formada por 2 cadenas complementarias

• Separación de las hebras → Helicasa

• Cebador o primer → ARN primasa

• Síntesis del ADN complementario → ADN pol 3

• Unión de los dNTPs a la nueva hebra
• Sentido 5´→ 3´
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• Kary Mullis, desarrolla la PCR 1986, premio nobel 1993.

• Objetivo: Desarrollar una técnica que permita obtener de ADN a partir de un molde.

• Importancia: Permite detectar la presencia o ausencia de cierta secuencia genómica y los

cambios que tiene esta.
 Amplificar la
secuencia deseada

Podemos determinar variaciones en el genoma

Árbol filogenético de Sars-cov-2

• Árbol filogenético
obtenido a partir de
diferentes cepas de
sars-cov-2

• El árbol permite ver

que diferencias hay
entre las diferencias
cepas estudiadas y Realización de arboles
la relación entre filogenéticos (ver variaciones
ellas dentro de una secuencia
deseada)
La realización de la PCR se lleva a cabo en 3
áreas distintas

• Área Pre-PCR (área limpia)

• Se prepara el Master Mix
• No ingresa ninguna muestra con material genético

• Área PCR
• Amplificación de la secuencia deseada mediante el uso del termociclador

• Área pos-PCR
• Análisis de los productos
• Electroforesis
¿ Qué es necesario para realizar la PCR?
1. Seleccionar la muestra a trabajar (suero, sangre, heces, orina, saliva, etc)

2. Agregar la muestra con la secuencia a amplificar (previamente extraído el material genético)

3. Preparación del master Mix (reactivos y materiales)

4. Realizar la PCR (en un termociclador)

Materiales para realizar la PCR

Tubos de PCR
Desinfectantes Guantes Micropipetas (0.6ml)
Tubos de 1.5ml

Tubos y placas de Mascarilla Gradillas para tubos Gradillas en frio para

PCR tubos
Reactivos para desarrollar la PCR
Materiales y reactivos

1. Agua.- solvente para los diferentes reactivos

2. dNTPs (A,T,C,G).- desoxinucleótidos (Adenina, Timina, Citocina, Guanina)
3. Primers o sondas.- Pequeña secuencia de nucleótidos aprox. 20 nucleótidos.
4. Buffer.- mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la enzima
5. MgCl2 (cloruro de magnesio) cofactor para la función de la polimerasa
6. Taq Polimerasa, enzima que lleva a cabo la síntesis de la cadena complementaria
7. Muestra con el ADN extraído
Reactivos para desarrollar la PCR
Al tubo
conteniendo el Master Mix
master mix, se
le agrega El
ADN extraído y
se coloca el
tubo en el
termociclador
Buffer

Agua

Primers
Termociclador
Programación del Termociclador
Pasos de la PCR
Tres pasos básicos

1. Desnaturalización:
Las doble cadena de ADN se separa
Aumento de T ≈ 95°C
Tiempo: 1¨

2. Alineamiento:
Los primers se unen específicamente a
cada hebra de ADN
Disminuye la T ≈ 55°C

3. Extensión:
La polimerasa sintetiza la nueva hebra,
fijando los dNTPs en dirección 5´a 3¨
Aumento de T ≈ 72°C
 Desnaturación del ADN
T ≈95°C

5’ 3’
-T–A-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-* *
-A–T-G-C-A-T-G-C-A-T-G-C-* *
3’ 5’
 Alineamiento de los primers
T ≈55°C

5’ 3’
-T- A-C-G
-A–T-G-C-A-T-G-C-A-T-G-C-*
3’ 5’

Síntesis de DNA: Primers específicos hibridan con la

cadena que tiene que ser copiada.

Primer o cebador: corta secuencia de nucleótidos que se van a finar a una de las hebras el ADN en sentido 5’ a 3’
 Elongación de la hebra complementaria (sentido 5´a 3)
T ≈72°C 5’ 3’
-T–A-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-* *
-A- T-G-C Reverse
3’ 5’ primer
5’ 3’
Forward
primer -T- A-C-G
-A–T-G-C-A-T-G-C-A-T-G-C-* *
3’ 5’

Forward primer: 5’ TACG 3’

Reverse primer: 5’ CGTA 3’
 Elongación de la hebra complementaria (sentido 5´a 3)
T ≈72°C 5’ 3’
-T–A-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-* *
-A- T-G-C Reverse
3’ 5’ primer
5’ 3’
Forward
primer -T- A-C-G
-A–T-G-C-A-T-G-C-A-T-G-C-* *
3’ 5’

Forward primer: 5’ TACG 3’

Reverse primer: 5’ CGTA 3’
Problemas al desarrollar la PCR

• Baja extracción del material genético para la PCR

• Problemas en la preparación del master mix

• Pipeteo

• Degradación de la taq pol

• Contaminación al momento de cargar el material genético sobre el master mix

Recapitulación
• https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU (3:40)

• https://www.youtube.com/watch?v=mslMRgxbdOA (hasta 4:48)

Diferentes ojos, diferentes secuencias…
Diferentes ojos, diferentes secuencias…
Aprendiste
• ¿Qué significa PCR?

• ¿Cuáles son los reactivos necesarios para llevar a cabo una PCR?
Aprendiste
• ¿Qué significa PCR?
• Es la Reacción en Cadena de la Polimerasa

• ¿Cuáles son los reactivos necesarios para llevar a cabo una PCR?
Aprendiste
Aprendiste
Aprendiste
Aprendiste
Aprendiste
Aprendiste
Aprendiste