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Biología Celular

2021
Semana 8
Sesión 24

Obtención y análisis de fracciones celulares

https://flalda.wordpress.com/2010/01/18/aproximacion-al-estudio-de-la-celula/ SEMANA 8: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2021


RESULTADOS DE
APRENDIZAJE DE LA SESIÓN

• Analiza el fundamento de la técnica de


fraccionamiento celular

• Describe las etapas de la técnica de


fraccionamiento celular para el estudio de las
organelas celulares

SEMANA 8: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2021


REFLEXIÓN DE LA EXPERIENCIA

Estudiar la estructura y función de las diferentes

fracciones celulares nos permitirá comprender que

el mal funcionamiento de las estructuras u

organelos celulares podrán generar enfermedades

o síndromes en los seres humanos.

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INTRODUCCIÓN

▪ Las células contienen diversas


organelas con diferentes
tamaños y densidades.

▪ Para estudiar una función


particular de las mitocondrias o
aislar una enzima particular del
aparato de Golgi, es mejor
aislar primero a la organela
relevante.

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FRACCIONAMIENTO CELULAR

Todo proceso de fraccionamiento celular, tiene 3 etapas:

1. HOMOGENIZADO

2. FILTRADO

3. CENTRIFUGADO

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1) HOMOGENIZADO

▪ Ruptura de la células o tejidos para


obtener un lisado celular (o tisular), de tal
manera que se liberen sus componentes,
en particular sus organelas, sin que éstos
sufran mayores daños, y que se
encuentren en condiciones adecuadas
para su purificación.

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HOMOGENIZADO
Métodos:
✓ Mecánico: homogeneizadores, trituración,
molienda, etc.
✓ No mecánico:
- Enzimático: lisis enzimática (lisozimas)
- Químicos: detergentes, solventes, etc.
- Físico: choque osmótico, choque térmico,
ultrasonido, etc.
❖ Amortiguador o Buffer: Solución isotónica
tamponada (presión osmótica adecuada)
Homogeneizador Potter:
Es muy suave y se lo utiliza para el aislamiento de estructuras y moléculas lábiles en tejidos
animales.
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2) FILTRADO

▪ Consiste en la separación de componentes


no deseados presentes en la suspensión
celular, mediante un medio poroso, que retire
sólidos y permita el pasaje del líquido.
▪ Después de la homogeneización se realiza
una filtración gruesa a través de una gasa
para eliminar los restos del tejido o las células
intactas que no hayan sido fraccionadas.

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3) CENTRIFUGADO

▪ Método más utilizado para poder separar en


fracciones los componentes celulares libres.
▪ En una solución las partículas con una densidad
mayor que la del medio circundante tienen a irse
al fondo (sedimentan); cuando su densidad es
menor las partículas flotan.
▪ Cuanto mayor es la diferencia entre las
densidades, más fácil es la sedimentación.

Condiciones de centrifugación:
- Velocidad
- Tiempo
- Temperatura (0 – 5°C): Evitar perder actividad biológica.

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CENTRIFUGADO

• Video de la técnica de Centrifugado:

https://www.youtube.com/watch?v=LWZMmCgC5rQ

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CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

▪ Es una serie de centrifugados, que se


realizada cada vez a mayor velocidad y a
mayor duración.
▪ Aquí componentes subcelulares son
separados por su tamaño y densidad.
▪ La sedimentación es más rápida con
componentes más grandes y más densos
que con componentes más pequeños y
menos densos.

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CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

SEMANA 8: EQUIPO DE DOCENTES BIOLOGÌA CELULAR 2021


CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

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CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

▪ Para efectuar esta técnica se procede primero


a la rotura mecánica de las células con un
homogeneizador mecánico.

▪ Las células se homogeneizan en una solución


amortiguada isotónica (que a menudo
contiene sacarosa), lo que previene la rotura
de las vesículas de membrana por osmosis.

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CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

▪ El homogeneizado se somete a una


centrifugación diferencial.

▪ Al principio el homogenizado se somete a


fuerzas centrifugas bajas por un periodo
corto para que solo los organelos celulares
mas grandes (núcleos y cualquier célula
completa remanente) se sedimente a esto se
le llama precipitado o pellet.

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CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

▪ Los organelos citoplásmicos grandes


(mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y
peroxisomas) pueden separarse con fuerzas
centrífugas mayores.

▪ Los microsomas (fragmentos de membranas


vacuolares y reticulares del citosol) y los
ribosomas se retiran en los pasos
subsiguientes.

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CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

▪ En el último paso se requiere el uso de


ultracentrífugas, que alcanzan velocidades
de 75 000 rpm, que producen fuerzas
equivalentes a 500 000 g.

▪ Una vez que los ribosomas se retiran, el


sobrenadante consiste en la fase soluble
de la célula y las partículas demasiado
pequeñas para retirarse por sedimentación.

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CENTRIFUGACIÓN POR GRADIENTE DE DENSIDAD

▪ En muchos casos se logra una purificación


adicional mediante centrifugación de una de las
fracciones utilizando una gradiente de densidad.
▪ La gradiente de densidad se logra utilizando una
solución que al mezclarse con buffer distribuye el
contenido de la muestra en varias capas o
fracciones de acuerdo con su densidad.
▪ Las fracciones aisladas pueden determinarse por
microscopia o la medición de proteínas especificas
de los organelos.

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CENTRIFUGACIÓN POR GRADIENTE DE DENSIDAD

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ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE FRACCIONES CELULARES
NÚCLEO – M. CAMPO CLARO

400X
Laboratorio de BC
ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE FRACCIONES CELULARES
NÚCLEO – M. FLUORESCENCIA

400X
Laboratorio de BC
ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE FRACCIONES CELULARES
MITOCONDRIAS – M. CAMPO CLARO

Laboratorio de BC
400X
ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE FRACCIONES CELULARES
MITOCONDRIAS – M. FLUORESCENCIA

Laboratorio de BC
400X
ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE FRACCIONES CELULARES

▪ Fracción a: corresponde a fragmentos


de la membrana plasmática y retículo
endoplasmático liso.

▪ Fracción b: corresponde a fragmentos


de retículo endoplasmático rugoso.

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MARCADORES DE FRACCIONES CELULARES

▪ Objetivo: Analizar la pureza de las


fracciones obtenidas

▪ Están presentes exclusivamente o


predominantemente en un tipo de
organela. Por ejemplo, la actividad
enzima específica de una organela
(marcador enzimático).

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INTEGRAMOS LO APRENDIDO

¿Qué aprendimos hoy?

• ¿A qué velocidad se tiene que

centrifugar para obtener lisosomas y

ribosomas?

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ACTIVIDAD ASINCRÓNICA

Video: Fraccionamiento celular – Centrifugación diferencial:

• https://www.youtube.com/watch?v=ogDx4jcxWFk&t=196s

• https://learninglink.oup.com/access/content/cooper8e-student-
resources/cooper8e-chapter-1-animation-1?previousFilter=tag_chapter-
01

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Karp G, Iwasa J, Marshall W. Cell and molecular biology: Concepts and


experiments. Nashville, TN: John Wiley & Sons; 2015.
• Alberts B. Molecular biology of the cell. 6a ed. New York, NY: Garland Publishing;
2014.
• Cooper G. The cell: A molecular approach. 8a ed. New York, NY: Oxford
University Press; 2018.
• Koolman J, Roehm KH. Color Atlas of Biochemistry. Thieme Medical; 2012.

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